输血后乙型肝炎病毒感染的前瞻性研究
输血后乙型肝炎病毒感染的前瞻性研究
王笃初 谭德明 曹希娟
摘 要 目的 了解输血后所致乙型肝炎病毒(HBV)感染现状，以及通过检测乙型肝炎病毒表面抗原筛选献血员的效果。方法 用酶联免疫吸附测定(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)分别检测了受血者和供血者血清中HBV-M和HBV DNA。结果 在583份供血者血中HBV-M阳性326份，HBV DNA阳性57份。136份受血者输血后39份血清HBV-M阳转，阳转率为28.68%；23份HBV DNA阳性，阳性率为16.9%。结论 经检测乙型肝炎病毒表面抗原筛选献血员后仍有输血后乙型肝炎病毒感染的可能。
关键词：输血 肝炎，乙型 肝炎表面抗原，乙型 酶联免疫吸附测定 聚合酶链反应
, http://www.100md.com
为了解输血后所致乙型肝炎病毒感染的现状和通过检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)筛选献血员的效果，我们用酶联免疫法和聚合酶链反应分别检测献血员和受血者血清中乙型肝炎病毒标志物(HBC-M)和HBV DNA，对乙型肝炎病毒输血后感染的发生进行了前瞻性研究。
1 材料和方法
1.1 研究对象 1996年7月至1997年5月在湘雅医院接受输血治疗的住院患者，符合下列条件者为研究对象：①既往无输血及使用血液制品史；②无肝炎病史，肝功能正常；③乙型肝炎病毒标志物(HBC-M)均为阴性，HBV DNA为阴性；④在住院期间无肝炎接触史；研究对象于输血前，输血后1，3，6个月随访采血。共收集187例受血者血清，6例于随访期间因原发病死亡，45例在随访期间不能配合或失访。最后136例完成200天的随访。其中男性94例，女性42例，年龄2～72岁。输血量400～5 000 ml。
1.2 供血 本组共583份合格血，由湖南省某血站提供。其中男性198人，女性385人。年龄在18岁至55岁。所提供的合格血液均经过乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、人类免疫缺陷病毒抗体(抗-HIVⅠ，Ⅱ)，梅毒不加热反应(USR)的初检和复查，血红蛋白(Hb)和丙氨酸转氨酶(ALT)均在正常值范围。所收集的标本及时分离血清，-30℃冷冻保存待用。
, 百拇医药
1.3 HBV-M的检测 HBV-M的检测用ELISA，试剂盒由上海实业科华生物工程公司提供，批号950410-950427。按说明书严格操作，用伯乐550型酶标仪判定吸光度A值(旧称光密度OD值)。
1.4 HBV DNA的检测 用PCR法取血清20 μl加等量标本变性液，混匀，置97℃10 min，15 000 r/min离心5 min，取上清10 μl加入PCR缓冲液中，最后反应体积为50 μl，其中含50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1.5 mmol/L MgCl2,1%gelation,200 mmol/L dNTP,25 mmol/L HBV DNA特异性引物1和引物2(引物1位于前C区1 740-1 759碱基片段，序列为5′-CTGGGGGGGAGATTAGGTT-3′；引物2位于前C区1 940-1 959碱基片段，序列为5′-GGCAA AAACGAAAGTAACTC-3′)，TaqDNA聚合酶3 U，反应液上复盖石腊油后，置PerKin-Elmer自动PCR仪上94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共35个循环，然后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼酯糖电泳，0.5 μg/ml溴化乙啶染色，紫外光下观察结果。HBV DNA特异性引物由上海肿瘤研究所提供，其余试剂购自洛阳华美生物工程公司。
, http://www.100md.com
1.5 血清ALT的检测 采用改良赖式法。
1.6 统计方法 采用x2检验。
2 结果
2.1 合格血中HBV的检测结果 从583例合格血标本中检出326份HBC-M阳性，阳性率为55.9%(326/583)；HBV DNA阳性57份，阳性率为9.78%(57/583)。HBV DNA阳性与HBV-M检出的关系见表1。在326份HBV-M阳性血中有55份HBV DNA阳性，阳性率为16.87%(55/326)；257份HBV-M全部阴性组，其中只有2份HBV DNA阳性，阳性率为0.78%(2/25)；两组经统计学处理P<0.01。
表1 583份HBsAg阴性血清中HBV DNA的检出与HBV-M的关系
Tab.1 The relation between HBV DNA and HBV-M in 583 HBsAg negative donors′sera
, 百拇医药
分类
type
检测数
No.detected
HBV DNA阳性数(%)
HBV DNA positive no.(%)
HBV-M阳性
Anti-HBs
32
3(9.38)
Anti-HBe
45
, http://www.100md.com
2(4.44)
Anti-HBc
93
14(15.05)
Anti-HBs，HBe，HBc
18
3(16.67)
Anti-HBs，HBe
33
7(21.21)
Anti-HBs，HBc
31
, http://www.100md.com
8(25.81)
Anti-HBe，HBc
72
16(22.22)
HBeAg
2
2(100)
HBV-M negative
257
2(0.34)
合计
Total
, http://www.100md.com
583
57(9.78)
2.2 受血者输血后HBV的感染状况 136例受血者输血后HBV-M阳转39例，阳转率为28.68%(39/136)。其中23例HBV DNA阳性。输血后1个月检测到HBV DNA3例，3个月21例，6个月18例。136例受血者无论HBV-M阳转与否，均无明显肝炎症状，血清ALT均正常。受血者输血后HBV的感染与供血中的HBV-M及HBV DNA阳性关系见表2。
表2 输血后HBV感染与供血者HBV的感染状况
Tab.2 Posttransfusion HBV infection and the status of donors′ HBV infection
分类
, http://www.100md.com
供血者HBV感染的状况
Status of donors′HBV infection
输血后HBV感染的状况
Posttransfusion HBV infection of recipients
Type
HBV-M阳性数
No HBV-M positive
HBV DNA阳性数
No HBV DNA positive
HBV-M阳性数
, 百拇医药
No HBV-M positive
HBV DNA阳性数
No HBV DNA positive
Anti-HBs
32
3
6
3
Anti-HBe
45
2
2
, 百拇医药 1
Anti-HBc
93
14
7
5
Anti-HBs,HBe,HBc
18
3
2
1
Anti-HBs,HBe
33
, 百拇医药
7
4
2
Anti-HBs,HBc
31
8
6
4
Anti-HBe,HBc
72
16
12
7
, 百拇医药
HBeAg
2
2
HBV-M negative
2
合计
Total
326
57
39
23
2.3 输血后HBV感染与供血HBV DNA的关系 136例受血者输血后HBV-M阳转者，39例均输入了HBV DNA阳性的血，输入血量最少400 ml，最多3 000 ml,100%促使受血者HBV-M阳转。
, 百拇医药
3 讨论
输血是传播HBV感染的主要途径之一。自1970年初应用HBsAg筛选献血员以来，输血后乙型肝炎病毒感染明显下降。过去的研究表明，以输血后HBsAg阳转为标准的输血后HBV感染率为0%～3%[1，2]。本研究136例受血者观察6个月以上未见HBsAg，但有其它的HBV-M阳转，提示有可能发生输血后HBV感染。在受血者HBV感染中，尽管有的HBV DNA是一过性的，但最早能在输血后一个月检测到HBV DNA。
57份HBV DNA阳性血，其中55份来自HBV-M阳性，2份来自HBV-M均阴性者血。本研究结果揭示凡是输入了HBV DNA的受血者，能促使HBV-M 100%阳转。而HBV DNA阴性则未发现HBV-M阳转。提示HBV DNA 是输血后HBV感染源。
受血者通过输血能否感染HBV，又能否发病，与输入体内HBV DNA复制的强弱、输入体内HBV DNA的量有关。更重要的与被感染者免疫功能正常与否有关。结合本研究39例输血后HBV感染情况，输血后HBV感染在受血者体内大约有3种转归：①受血者免疫功能正常，感染到体内的HBV DNA量较少或者复制能力差，被免疫功能所抑制或灭活。表现为受血者体内检测不到HBV DNA或者HBV-M中某些抗体的阳转；②受血者输入了较大剂量的HBV DNA或者其复制活跃，正常的免疫功能处于与之搏斗的相持阶段。肝功能正常，肝脏未遭到伤害。表现为能检测到受血者体内HBV DNA及HBV-M的某些抗体。本文39例输血后HBV感染除上述1种情况外，都应属于此。③由于某种或某些原因使受血者免疫功能降低，而输入的HBV DNA复制活跃或数量较大，导致肝功能异常，肝脏受到伤害。表现为受血者HBV DNA与HBV-M中的抗原为阳性。随着时间的推移，病情的恶化，有可能导致肝硬化、肝细胞癌。至于免疫功能与HBV DNA之间的相互变化、转归机制有待我们进一步去探讨。这些都提示我们，凡属免疫功能不全或低下者进行输血治疗时，要选择HBV DNA阴性的血液，以免发生输血后HB、或输血后HBV感染、或病毒性肝炎相关性再生障碍性贫血(HAAA)[3]。
, 百拇医药
在39例输血后HBV感染中，尽管无肝功能异常，但有23例HBV DNA阳性，阳性率16.91%(33/136)。提示输血后隐匿型HBV DNA感染不可忽视。我们目前筛选献血员HBsAg的方法要进一步完善。因为HBsAg本身只是HBV感染的标志之一。不能完全反映有无病毒的复制、复制程度，传染性的强弱及预后。更何况HBV-M感染后的病毒基因突变可使HBsAg合成水平降低，以致查不出HBsAg[4]。为确保供血质量和受血者健康，我们认为以HBV-M皆为阴性作为筛选献血员标准较妥。有条件的地方或对某些病种，最好以HBV DNA为阴性作为筛选标准，才能最大限度地杜绝乙型肝炎的血源性传播。
本文受湖南省科委资助(97SSY1045)
作者单位：王笃初(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院输血科)
谭德明(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院输血科)
, http://www.100md.com
曹希娟(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院输血科)
参考文献
1，盛端垦，王受霞，许少侠，等.输血后丙型肝炎的前瞻性研究.中国医学论坛报，1995年9月14日，第2版。
2，谭复明，骆抗先，王志明，等.输血后乙肝和丙型肝炎病毒感染的前瞻性调查.中华肝脏病杂志，1997，5：42-44.
3，方炳木.病毒性肝炎相关性再生障碍性贫血的研究发展.国外医学输血及血液学分册，1993，16：90-92.
4，Brown JL,Carman WF,Thomas HC,et al.The clinical significance of molecular variation within the hepatitis B virus genome.Hepatology,1992,15:144-147., http://www.100md.com
王笃初 谭德明 曹希娟
摘 要 目的 了解输血后所致乙型肝炎病毒(HBV)感染现状，以及通过检测乙型肝炎病毒表面抗原筛选献血员的效果。方法 用酶联免疫吸附测定(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)分别检测了受血者和供血者血清中HBV-M和HBV DNA。结果 在583份供血者血中HBV-M阳性326份，HBV DNA阳性57份。136份受血者输血后39份血清HBV-M阳转，阳转率为28.68%；23份HBV DNA阳性，阳性率为16.9%。结论 经检测乙型肝炎病毒表面抗原筛选献血员后仍有输血后乙型肝炎病毒感染的可能。
关键词：输血 肝炎，乙型 肝炎表面抗原，乙型 酶联免疫吸附测定 聚合酶链反应
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为了解输血后所致乙型肝炎病毒感染的现状和通过检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)筛选献血员的效果，我们用酶联免疫法和聚合酶链反应分别检测献血员和受血者血清中乙型肝炎病毒标志物(HBC-M)和HBV DNA，对乙型肝炎病毒输血后感染的发生进行了前瞻性研究。
1 材料和方法
1.1 研究对象 1996年7月至1997年5月在湘雅医院接受输血治疗的住院患者，符合下列条件者为研究对象：①既往无输血及使用血液制品史；②无肝炎病史，肝功能正常；③乙型肝炎病毒标志物(HBC-M)均为阴性，HBV DNA为阴性；④在住院期间无肝炎接触史；研究对象于输血前，输血后1，3，6个月随访采血。共收集187例受血者血清，6例于随访期间因原发病死亡，45例在随访期间不能配合或失访。最后136例完成200天的随访。其中男性94例，女性42例，年龄2～72岁。输血量400～5 000 ml。
1.2 供血 本组共583份合格血，由湖南省某血站提供。其中男性198人，女性385人。年龄在18岁至55岁。所提供的合格血液均经过乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、人类免疫缺陷病毒抗体(抗-HIVⅠ，Ⅱ)，梅毒不加热反应(USR)的初检和复查，血红蛋白(Hb)和丙氨酸转氨酶(ALT)均在正常值范围。所收集的标本及时分离血清，-30℃冷冻保存待用。
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1.3 HBV-M的检测 HBV-M的检测用ELISA，试剂盒由上海实业科华生物工程公司提供，批号950410-950427。按说明书严格操作，用伯乐550型酶标仪判定吸光度A值(旧称光密度OD值)。
1.4 HBV DNA的检测 用PCR法取血清20 μl加等量标本变性液，混匀，置97℃10 min，15 000 r/min离心5 min，取上清10 μl加入PCR缓冲液中，最后反应体积为50 μl，其中含50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1.5 mmol/L MgCl2,1%gelation,200 mmol/L dNTP,25 mmol/L HBV DNA特异性引物1和引物2(引物1位于前C区1 740-1 759碱基片段，序列为5′-CTGGGGGGGAGATTAGGTT-3′；引物2位于前C区1 940-1 959碱基片段，序列为5′-GGCAA AAACGAAAGTAACTC-3′)，TaqDNA聚合酶3 U，反应液上复盖石腊油后，置PerKin-Elmer自动PCR仪上94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共35个循环，然后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼酯糖电泳，0.5 μg/ml溴化乙啶染色，紫外光下观察结果。HBV DNA特异性引物由上海肿瘤研究所提供，其余试剂购自洛阳华美生物工程公司。
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1.5 血清ALT的检测 采用改良赖式法。
1.6 统计方法 采用x2检验。
2 结果
2.1 合格血中HBV的检测结果 从583例合格血标本中检出326份HBC-M阳性，阳性率为55.9%(326/583)；HBV DNA阳性57份，阳性率为9.78%(57/583)。HBV DNA阳性与HBV-M检出的关系见表1。在326份HBV-M阳性血中有55份HBV DNA阳性，阳性率为16.87%(55/326)；257份HBV-M全部阴性组，其中只有2份HBV DNA阳性，阳性率为0.78%(2/25)；两组经统计学处理P<0.01。
表1 583份HBsAg阴性血清中HBV DNA的检出与HBV-M的关系
Tab.1 The relation between HBV DNA and HBV-M in 583 HBsAg negative donors′sera
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分类
type
检测数
No.detected
HBV DNA阳性数(%)
HBV DNA positive no.(%)
HBV-M阳性
Anti-HBs
32
3(9.38)
Anti-HBe
45
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2(4.44)
Anti-HBc
93
14(15.05)
Anti-HBs，HBe，HBc
18
3(16.67)
Anti-HBs，HBe
33
7(21.21)
Anti-HBs，HBc
31
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8(25.81)
Anti-HBe，HBc
72
16(22.22)
HBeAg
2
2(100)
HBV-M negative
257
2(0.34)
合计
Total
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583
57(9.78)
2.2 受血者输血后HBV的感染状况 136例受血者输血后HBV-M阳转39例，阳转率为28.68%(39/136)。其中23例HBV DNA阳性。输血后1个月检测到HBV DNA3例，3个月21例，6个月18例。136例受血者无论HBV-M阳转与否，均无明显肝炎症状，血清ALT均正常。受血者输血后HBV的感染与供血中的HBV-M及HBV DNA阳性关系见表2。
表2 输血后HBV感染与供血者HBV的感染状况
Tab.2 Posttransfusion HBV infection and the status of donors′ HBV infection
分类
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供血者HBV感染的状况
Status of donors′HBV infection
输血后HBV感染的状况
Posttransfusion HBV infection of recipients
Type
HBV-M阳性数
No HBV-M positive
HBV DNA阳性数
No HBV DNA positive
HBV-M阳性数
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No HBV-M positive
HBV DNA阳性数
No HBV DNA positive
Anti-HBs
32
3
6
3
Anti-HBe
45
2
2
, 百拇医药 1
Anti-HBc
93
14
7
5
Anti-HBs,HBe,HBc
18
3
2
1
Anti-HBs,HBe
33
, 百拇医药
7
4
2
Anti-HBs,HBc
31
8
6
4
Anti-HBe,HBc
72
16
12
7
, 百拇医药
HBeAg
2
2
HBV-M negative
2
合计
Total
326
57
39
23
2.3 输血后HBV感染与供血HBV DNA的关系 136例受血者输血后HBV-M阳转者，39例均输入了HBV DNA阳性的血，输入血量最少400 ml，最多3 000 ml,100%促使受血者HBV-M阳转。
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3 讨论
输血是传播HBV感染的主要途径之一。自1970年初应用HBsAg筛选献血员以来，输血后乙型肝炎病毒感染明显下降。过去的研究表明，以输血后HBsAg阳转为标准的输血后HBV感染率为0%～3%[1，2]。本研究136例受血者观察6个月以上未见HBsAg，但有其它的HBV-M阳转，提示有可能发生输血后HBV感染。在受血者HBV感染中，尽管有的HBV DNA是一过性的，但最早能在输血后一个月检测到HBV DNA。
57份HBV DNA阳性血，其中55份来自HBV-M阳性，2份来自HBV-M均阴性者血。本研究结果揭示凡是输入了HBV DNA的受血者，能促使HBV-M 100%阳转。而HBV DNA阴性则未发现HBV-M阳转。提示HBV DNA 是输血后HBV感染源。
受血者通过输血能否感染HBV，又能否发病，与输入体内HBV DNA复制的强弱、输入体内HBV DNA的量有关。更重要的与被感染者免疫功能正常与否有关。结合本研究39例输血后HBV感染情况，输血后HBV感染在受血者体内大约有3种转归：①受血者免疫功能正常，感染到体内的HBV DNA量较少或者复制能力差，被免疫功能所抑制或灭活。表现为受血者体内检测不到HBV DNA或者HBV-M中某些抗体的阳转；②受血者输入了较大剂量的HBV DNA或者其复制活跃，正常的免疫功能处于与之搏斗的相持阶段。肝功能正常，肝脏未遭到伤害。表现为能检测到受血者体内HBV DNA及HBV-M的某些抗体。本文39例输血后HBV感染除上述1种情况外，都应属于此。③由于某种或某些原因使受血者免疫功能降低，而输入的HBV DNA复制活跃或数量较大，导致肝功能异常，肝脏受到伤害。表现为受血者HBV DNA与HBV-M中的抗原为阳性。随着时间的推移，病情的恶化，有可能导致肝硬化、肝细胞癌。至于免疫功能与HBV DNA之间的相互变化、转归机制有待我们进一步去探讨。这些都提示我们，凡属免疫功能不全或低下者进行输血治疗时，要选择HBV DNA阴性的血液，以免发生输血后HB、或输血后HBV感染、或病毒性肝炎相关性再生障碍性贫血(HAAA)[3]。
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在39例输血后HBV感染中，尽管无肝功能异常，但有23例HBV DNA阳性，阳性率16.91%(33/136)。提示输血后隐匿型HBV DNA感染不可忽视。我们目前筛选献血员HBsAg的方法要进一步完善。因为HBsAg本身只是HBV感染的标志之一。不能完全反映有无病毒的复制、复制程度，传染性的强弱及预后。更何况HBV-M感染后的病毒基因突变可使HBsAg合成水平降低，以致查不出HBsAg[4]。为确保供血质量和受血者健康，我们认为以HBV-M皆为阴性作为筛选献血员标准较妥。有条件的地方或对某些病种，最好以HBV DNA为阴性作为筛选标准，才能最大限度地杜绝乙型肝炎的血源性传播。
本文受湖南省科委资助(97SSY1045)
作者单位：王笃初(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院输血科)
谭德明(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院输血科)
, http://www.100md.com
曹希娟(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院输血科)
参考文献
1，盛端垦，王受霞，许少侠，等.输血后丙型肝炎的前瞻性研究.中国医学论坛报，1995年9月14日，第2版。
2，谭复明，骆抗先，王志明，等.输血后乙肝和丙型肝炎病毒感染的前瞻性调查.中华肝脏病杂志，1997，5：42-44.
3，方炳木.病毒性肝炎相关性再生障碍性贫血的研究发展.国外医学输血及血液学分册，1993，16：90-92.
4，Brown JL,Carman WF,Thomas HC,et al.The clinical significance of molecular variation within the hepatitis B virus genome.Hepatology,1992,15:144-147., http://www.100md.com