大肠癌微转移的基因检测
大肠癌微转移的基因检测
刘连杰 王颢 景在平 孟荣贵
关键词：大肠癌 微转移 基因检测 肿瘤标志物
转移是恶性肿瘤的重要特征，也是癌症患者死亡的主要原因。大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前对其局部原发肿瘤，采取手术为主的治疗方法基本可以控制，但根治术后肿瘤的复发和转移率高达50%左右[1]。早期认识有无肿瘤转移、转移方式及范围对临床诊断、治疗及预后判断具有重要意义。近年来随着免疫学及分子生物学的发展，使大肠癌的微转移检测成为可能。
一、微转移的概念
自1869年首次在外周血中发现癌细胞以来，肿瘤微转移逐步引起人们重视。人们发现早期大肠癌可有远处转移，借助活体显微电视系统更可直接观测到手术中癌细胞播散，特别是“无淋巴转移”的Dukes B期患者中，有近30%5年内死于局部复发或远处转移，提示淋巴系统或全身存在微转移[2,3]。
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微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶，常无任何临床表现，常规检查方法如CT、MRI、单抗放射显影技术、普通病理检查等都很难发现[3]。
微转移的肿瘤细胞常以单个细胞或微小细胞团形式经淋巴系统、血液系统转移至淋巴结、骨髓和其他组织器官，也可直接侵袭周围组织或种植于体腔。
二、大肠癌微转移与临床转移的关系
除非在非常晚期，临床转移一般都由微转移发展而来。而微转移只有少数才能发展为临床转移。微转移发展为临床转移至少经过4步[2]：(1)微量肿瘤细胞自原发灶脱离；(2)适应新代谢环境，逃避机体免疫；(3)侵袭远处组织；(4)在新组织中新血管生成，肿瘤生长。微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境。动物实验表明，血循环中至少有104个肿瘤细胞才可出现显性转移 ，多数肿瘤细胞发生凋亡，少数进入休眠状态，极少数发生增殖。淋巴结、血循环、骨髓中存在微转移，提示肿瘤不再局限于原发灶，有发展为远处转移瘤的可能，但微转移灶可长期处于G0期或增殖与死亡处于平衡状态。只有当机体遭受种种打击或免疫力下降时，休眠的肿瘤细胞才摆脱抑制状态而持续增值，并发展为临床显性转移。
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三、大肠癌微转移的检测方法
微转移的检测方法有多种。连续切片是最早用于检测淋巴结微转移的一种简单方法，对常规检测阴性的淋巴结进行连续切片检查，可使淋巴结转移的检出率提高14%～24%。但此方法工作量大，粗糙，且不适用于血循环、骨髓的微转移检测。
免疫组化、免疫荧光检测实用有效，应用较广。选用针对大肠癌细胞标志物的抗体，对组织切片、细胞涂片进行染色，以寻找各种组织中的肿瘤细胞。Lindemann等[4]应用APAAP法对88例大肠癌患者行术前骨髓组织单克隆CK18检测，癌细胞阳性检出率达32%，部分呈簇状分布，部分呈单细胞分布。其他角蛋白单抗、CEA、CD45等也可单独或联合应用。该方法简便、直观，还可用于鉴别肿瘤病理来源。缺点是易遗漏、需连续切片，单抗的质量、交叉反应等因素影响检测的敏感性和特异性。
此外，放射免疫检测、流式细胞分析技术也具有重要应用价值。
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四、基因检测大肠癌微转移
基因检测方法是通过对肿瘤标志物进行PCR、RT-PCR检测来诊断微转移。PCR技术由Mullis 1985年发明并荣获诺贝尔奖。1991年Smith等[5]首次应用PCR技术检测到血循环中存在转移的瘤细胞。之后PCR技术被广泛应用于微转移研究。PCR、RT-PCR检测具有高度敏感性、特异性，理论上可准确检测1g组织或1ml液体中的1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效方法。
肿瘤标志物种类众多[2]。(1)特异性基因：包括染色体的异常、基因点突变、基因缺失等等。正常组织一般不伴有这些改变，检测相关特异性基因可诊断微转移。如p53、ras、DCC、erb-B2等等。(2)肿瘤特异性标志物：指在肿瘤细胞中存在而在正常细胞中不存在，如CEA、AFP。(3)组织特异性标志物：指在肿瘤起源组织中存在，而在其他组织中不存在，特别是在淋巴细胞和血细胞中不存在，如角蛋白20(cytokeratin,CK20)。 (4)转移特异性基因。(5)肿瘤伴随的病毒。
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五、基因检测微转移方法的比较
利用任何一种标志物都可能建立一种检测微转移的方法，理想的标志物应同时具备敏感性、特异性。
Hayashi等[3]1995年采用PCR对120例常规诊断无转移的大肠癌患者淋巴结进行K-ras、p53基因突变检测，发现存在淋巴结微转移。但各类大肠癌细胞中K-ras、p53的突变率仅为 50%左右，该方法敏感性较低。CEA是一个良好血清学指标，但有报道，可有23%的健康人群CEA mRNA表达阳性。
细胞角蛋白是分布于外胚层起源细胞的中间纤维丝，包含多个成员，CK20由Moll等[6]于1990年发现，含424个氨基酸，相对分子质量为48553，CK20不同于其他细胞角蛋白，它非常局限在胃肠上皮细胞，正常淋巴组织、血液组织、骨髓组织中不表达。大肠癌中高表达，且在肿瘤侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定。在非上皮组织中检测到CK20提示存在肿瘤细胞。Bostick等[7]分别对大肠癌患者、乳腺癌患者、正常人、良性疾病患者淋巴结进行CEA、CK19、CK20、肿瘤相关抗原733.2 (GA733.2)、粘蛋白1(MUC-1)的mRNA RT-PCR联合检测，发现组织学检查为阴性的淋巴结中有40%左右已经有微转移。而在正常人外周血和淋巴结中只有CK20无表达，其他标志物都有不同程度的假阳性。认为CK20是检测肠癌微转移的既特异又敏感的良好标志物。
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六、大肠癌微转移检测的临床应用
可监测大肠癌区域淋巴结微转移。Dorudi等[8]研究了18例中期大肠癌患者162枚区域淋巴结，应用CK20 RT-PCR检测发现，21%的Dukes B期患者已有淋巴结微转移，实属Dukes C期，认为检测该方法可协助准确分期。
可监测大肠癌血循环中的微转移。Funaki等[9]检测了28例大肠癌患者外周血CK20 mRNA，8例复发患者和4例伴远处转移患者均为阳性，5例CK20 mRNA表达阳性但无复发或转移的Dukes C患者在随访到11个月时有3例复发，11例正常人或良性患者外周血CK20 mRNA均为阴性。Funaki认为微转移可能是Dukes B期患者术后复发的主要原因，外周血CK20 mRNA表达是预测大肠癌复发和转移的实用指标。还有学者对65例大肠癌患者围手术期血循环微转移进行动态监测，发现手术增加转移机率。
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可监测大肠癌骨髓中的微转移。Soeth等[10]用套式RT-PCR检测了57例大肠癌患者骨髓的CK20 mRNA表达，发现CK20阳性表达率与肿瘤分期紧密相关，Ⅰ期0%,Ⅱ期24%,Ⅲ期31%,Ⅳ期71%。Soeth等[11]检测了胃肠肿瘤患者的141份骨髓标本和104份静脉血标本，发现骨髓检测微转移较外周血敏感、稳定，两者吻合率为87%。
可监测大肠癌腹腔微转移。Vogel等[12]对90例大肠癌患者行剖腹后立即用100ml温盐水局部冲洗的方法，腹腔冲洗液进行检测，常规细胞学发现肿瘤细胞发现率为35.5%。而利用一种糖蛋白抗体进行免疫组化检测，阳性率提高到47.2%。并且认为腹腔微转移与患者肝转移密切相关。Vogel认为该方法检测微转移，敏感性较高，特异性强。
七、大肠癌微转移的意义
有研究表明，37例伴淋巴结微转移的大肠癌患者中有27例5年内复发，而34例无微转移的患者，无1例复发[3]。另有报道，骨髓中CK20 mRNA表达阳性的大肠癌患者2年内死亡率为60%，表达阴性患者同期死亡率为11%，两者差别很明显[11]。微转移是一个独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级。但也有报道认为，微转移与预后无关[13]。对于血循环微转移的诊断争议最大，不仅因为可能存在假阳性[14]，而且临床转移所需的最小肿瘤细胞数量级为104，远远高于基因诊断为微转移的细胞数量[2]，故基因诊断的血循环微转移可能对患者预后影响不大，基因检测的高敏感性可能降低了其临床应用价值。一些学者认为，基因诊断为微转移的细胞成分非常复杂[2]，特别在骨髓中，肿瘤标志物表达阳性的细胞可能不是肿瘤细胞。
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尽管近年来对于检测大肠癌微转移的研究取得了很大进展，但一些标志物(如CK20)的分子行为、基因特征还有待进一步研究，微转移的确切意义值得商榷，与预后的确切关系有待观察。正常人、慢性胰腺炎患者、 肝腺瘤患者分别出现外周血、骨髓CK20表达阳性，从而怀疑CK20的特异性[14]。对低分化、未分化大肠肿瘤的基因检测研究较少。许多实验结果相差较大，可能与技术方法、病例选择不同有关。PCR检测费用昂贵，限制了其广泛临床研究，对早期诊断意义也不大。相信随着对微转移检测的认识和不断研究，将建立更科学的检测方法，揭示微转移的机制，明确微转移与复发、临床转移、生存期的关系，从而带来诊断、治疗的根本变化。
作者单位：刘连杰(200433 上海，第二军医大学附属长海医院普外科)
王颢(200433 上海，第二军医大学附属长海医院普外科)
参考文献
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1 Litle VR,Warren RS, Moore D,et al. Molecular cytogenetic analysis of cytokeratin 20-labeled cells in primary tumors and bone marrow aspirates from colorectal carcinoma patients. Cancer, 1997, 79: 1664-1670.
2 Raj GV, Moreno JG, Gomella LG. Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors. Cancer, 1998,82:1419-1442.
3 Hayashi N, Ito I, Yanagisawa A, et al. Genetic diagnosis of lymph-node metastases in colorectal cancer. Lancet, 1995,345:1257-1259.
, http://www.100md.com
4 Lindemann F, Schlimok G, Dirschedl P, et al. Prognostic significance of micrometastatic tumor cells in bone marrow of colorectal cancer patients. Lancet, 1992, 340: 685-689.
5 Smith B, Selby P, Southgate J, et al. Detection of melanoma cells in peripheral blood by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction. Lancet, 1991,338:1227-1229.
6 Moll R, Schiller DL, Franke WW, et al. Identification of protein IT of the intestinal cytoskeleton as a novel type I cytokeratin with unusual properties and expression patterns. J Cell Biol, 1990,111:567-580.
, 百拇医药
7 Bostick PJ, Chatterjee S, Chi DD, et al. Limitations of specific reverse-transcriptase polymerase chain reaction markers in the detection of metastases in the lymph nodes and blood of breast cancer patients. J Clin Oncol, 1998, 16:2632-2640.
8 Dorudi S, Kinrade E, Marshall NC, et al. Genetic detection of lymph node micrometastases in patients with colorectal cancer. Br J Surg, 1998, 85: 98-100.
9 Funaki NO, Tanaka J, Ohshio G, et al. Cytokeratin 20 mRNA in peripheral venous blood of colorectal carcinoma patients. Br J Cancer, 1998, 77:1327-1332.
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10 Soeth E, Roder C, Juhl H, et al. The detection of disseminated tumor cells in bone marrow from colorectal-cancer patients by a cytokeratin-20-specific nested reverse-transcriptase-polymerase-chain reaction is related to the stage of disease. Int J Cancer, 1996, 69: 278-282.
11 Soeth E, Vogel I, Roder C, et al. Comparative analysis of bone marrow and venous blood isolates from gastrointestinal cancer patients for the detection of disseminated tumor cells using reverse transcription PCR. Cancer Res, 1997, 57:3106-3110.
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12 Vogel P, Ruschoff J, Kummel S, et al. Prognostic value of microscopic peritoneal dissemination: comparison between colon and gastric cancer. Dis Colon Rectum, 2000, 43: 92-100.
13 Wyld DK, Selby P, Perren TJ, et al. Detection of colorectal cancer cells in peripheral blood by reverse-transcriptase polymerase chain reaction for cytokeratin 20. Int J Cancer, 1998,79: 288-293.
14 Bustin SA, Gyselman VG, Williams NS, et al. Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients. Br J Cancer, 1999, 79: 1813-1820., 百拇医药
刘连杰 王颢 景在平 孟荣贵
关键词：大肠癌 微转移 基因检测 肿瘤标志物
转移是恶性肿瘤的重要特征，也是癌症患者死亡的主要原因。大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前对其局部原发肿瘤，采取手术为主的治疗方法基本可以控制，但根治术后肿瘤的复发和转移率高达50%左右[1]。早期认识有无肿瘤转移、转移方式及范围对临床诊断、治疗及预后判断具有重要意义。近年来随着免疫学及分子生物学的发展，使大肠癌的微转移检测成为可能。
一、微转移的概念
自1869年首次在外周血中发现癌细胞以来，肿瘤微转移逐步引起人们重视。人们发现早期大肠癌可有远处转移，借助活体显微电视系统更可直接观测到手术中癌细胞播散，特别是“无淋巴转移”的Dukes B期患者中，有近30%5年内死于局部复发或远处转移，提示淋巴系统或全身存在微转移[2,3]。
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微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶，常无任何临床表现，常规检查方法如CT、MRI、单抗放射显影技术、普通病理检查等都很难发现[3]。
微转移的肿瘤细胞常以单个细胞或微小细胞团形式经淋巴系统、血液系统转移至淋巴结、骨髓和其他组织器官，也可直接侵袭周围组织或种植于体腔。
二、大肠癌微转移与临床转移的关系
除非在非常晚期，临床转移一般都由微转移发展而来。而微转移只有少数才能发展为临床转移。微转移发展为临床转移至少经过4步[2]：(1)微量肿瘤细胞自原发灶脱离；(2)适应新代谢环境，逃避机体免疫；(3)侵袭远处组织；(4)在新组织中新血管生成，肿瘤生长。微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境。动物实验表明，血循环中至少有104个肿瘤细胞才可出现显性转移 ，多数肿瘤细胞发生凋亡，少数进入休眠状态，极少数发生增殖。淋巴结、血循环、骨髓中存在微转移，提示肿瘤不再局限于原发灶，有发展为远处转移瘤的可能，但微转移灶可长期处于G0期或增殖与死亡处于平衡状态。只有当机体遭受种种打击或免疫力下降时，休眠的肿瘤细胞才摆脱抑制状态而持续增值，并发展为临床显性转移。
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三、大肠癌微转移的检测方法
微转移的检测方法有多种。连续切片是最早用于检测淋巴结微转移的一种简单方法，对常规检测阴性的淋巴结进行连续切片检查，可使淋巴结转移的检出率提高14%～24%。但此方法工作量大，粗糙，且不适用于血循环、骨髓的微转移检测。
免疫组化、免疫荧光检测实用有效，应用较广。选用针对大肠癌细胞标志物的抗体，对组织切片、细胞涂片进行染色，以寻找各种组织中的肿瘤细胞。Lindemann等[4]应用APAAP法对88例大肠癌患者行术前骨髓组织单克隆CK18检测，癌细胞阳性检出率达32%，部分呈簇状分布，部分呈单细胞分布。其他角蛋白单抗、CEA、CD45等也可单独或联合应用。该方法简便、直观，还可用于鉴别肿瘤病理来源。缺点是易遗漏、需连续切片，单抗的质量、交叉反应等因素影响检测的敏感性和特异性。
此外，放射免疫检测、流式细胞分析技术也具有重要应用价值。
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四、基因检测大肠癌微转移
基因检测方法是通过对肿瘤标志物进行PCR、RT-PCR检测来诊断微转移。PCR技术由Mullis 1985年发明并荣获诺贝尔奖。1991年Smith等[5]首次应用PCR技术检测到血循环中存在转移的瘤细胞。之后PCR技术被广泛应用于微转移研究。PCR、RT-PCR检测具有高度敏感性、特异性，理论上可准确检测1g组织或1ml液体中的1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效方法。
肿瘤标志物种类众多[2]。(1)特异性基因：包括染色体的异常、基因点突变、基因缺失等等。正常组织一般不伴有这些改变，检测相关特异性基因可诊断微转移。如p53、ras、DCC、erb-B2等等。(2)肿瘤特异性标志物：指在肿瘤细胞中存在而在正常细胞中不存在，如CEA、AFP。(3)组织特异性标志物：指在肿瘤起源组织中存在，而在其他组织中不存在，特别是在淋巴细胞和血细胞中不存在，如角蛋白20(cytokeratin,CK20)。 (4)转移特异性基因。(5)肿瘤伴随的病毒。
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五、基因检测微转移方法的比较
利用任何一种标志物都可能建立一种检测微转移的方法，理想的标志物应同时具备敏感性、特异性。
Hayashi等[3]1995年采用PCR对120例常规诊断无转移的大肠癌患者淋巴结进行K-ras、p53基因突变检测，发现存在淋巴结微转移。但各类大肠癌细胞中K-ras、p53的突变率仅为 50%左右，该方法敏感性较低。CEA是一个良好血清学指标，但有报道，可有23%的健康人群CEA mRNA表达阳性。
细胞角蛋白是分布于外胚层起源细胞的中间纤维丝，包含多个成员，CK20由Moll等[6]于1990年发现，含424个氨基酸，相对分子质量为48553，CK20不同于其他细胞角蛋白，它非常局限在胃肠上皮细胞，正常淋巴组织、血液组织、骨髓组织中不表达。大肠癌中高表达，且在肿瘤侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定。在非上皮组织中检测到CK20提示存在肿瘤细胞。Bostick等[7]分别对大肠癌患者、乳腺癌患者、正常人、良性疾病患者淋巴结进行CEA、CK19、CK20、肿瘤相关抗原733.2 (GA733.2)、粘蛋白1(MUC-1)的mRNA RT-PCR联合检测，发现组织学检查为阴性的淋巴结中有40%左右已经有微转移。而在正常人外周血和淋巴结中只有CK20无表达，其他标志物都有不同程度的假阳性。认为CK20是检测肠癌微转移的既特异又敏感的良好标志物。
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六、大肠癌微转移检测的临床应用
可监测大肠癌区域淋巴结微转移。Dorudi等[8]研究了18例中期大肠癌患者162枚区域淋巴结，应用CK20 RT-PCR检测发现，21%的Dukes B期患者已有淋巴结微转移，实属Dukes C期，认为检测该方法可协助准确分期。
可监测大肠癌血循环中的微转移。Funaki等[9]检测了28例大肠癌患者外周血CK20 mRNA，8例复发患者和4例伴远处转移患者均为阳性，5例CK20 mRNA表达阳性但无复发或转移的Dukes C患者在随访到11个月时有3例复发，11例正常人或良性患者外周血CK20 mRNA均为阴性。Funaki认为微转移可能是Dukes B期患者术后复发的主要原因，外周血CK20 mRNA表达是预测大肠癌复发和转移的实用指标。还有学者对65例大肠癌患者围手术期血循环微转移进行动态监测，发现手术增加转移机率。
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可监测大肠癌骨髓中的微转移。Soeth等[10]用套式RT-PCR检测了57例大肠癌患者骨髓的CK20 mRNA表达，发现CK20阳性表达率与肿瘤分期紧密相关，Ⅰ期0%,Ⅱ期24%,Ⅲ期31%,Ⅳ期71%。Soeth等[11]检测了胃肠肿瘤患者的141份骨髓标本和104份静脉血标本，发现骨髓检测微转移较外周血敏感、稳定，两者吻合率为87%。
可监测大肠癌腹腔微转移。Vogel等[12]对90例大肠癌患者行剖腹后立即用100ml温盐水局部冲洗的方法，腹腔冲洗液进行检测，常规细胞学发现肿瘤细胞发现率为35.5%。而利用一种糖蛋白抗体进行免疫组化检测，阳性率提高到47.2%。并且认为腹腔微转移与患者肝转移密切相关。Vogel认为该方法检测微转移，敏感性较高，特异性强。
七、大肠癌微转移的意义
有研究表明，37例伴淋巴结微转移的大肠癌患者中有27例5年内复发，而34例无微转移的患者，无1例复发[3]。另有报道，骨髓中CK20 mRNA表达阳性的大肠癌患者2年内死亡率为60%，表达阴性患者同期死亡率为11%，两者差别很明显[11]。微转移是一个独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级。但也有报道认为，微转移与预后无关[13]。对于血循环微转移的诊断争议最大，不仅因为可能存在假阳性[14]，而且临床转移所需的最小肿瘤细胞数量级为104，远远高于基因诊断为微转移的细胞数量[2]，故基因诊断的血循环微转移可能对患者预后影响不大，基因检测的高敏感性可能降低了其临床应用价值。一些学者认为，基因诊断为微转移的细胞成分非常复杂[2]，特别在骨髓中，肿瘤标志物表达阳性的细胞可能不是肿瘤细胞。
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尽管近年来对于检测大肠癌微转移的研究取得了很大进展，但一些标志物(如CK20)的分子行为、基因特征还有待进一步研究，微转移的确切意义值得商榷，与预后的确切关系有待观察。正常人、慢性胰腺炎患者、 肝腺瘤患者分别出现外周血、骨髓CK20表达阳性，从而怀疑CK20的特异性[14]。对低分化、未分化大肠肿瘤的基因检测研究较少。许多实验结果相差较大，可能与技术方法、病例选择不同有关。PCR检测费用昂贵，限制了其广泛临床研究，对早期诊断意义也不大。相信随着对微转移检测的认识和不断研究，将建立更科学的检测方法，揭示微转移的机制，明确微转移与复发、临床转移、生存期的关系，从而带来诊断、治疗的根本变化。
作者单位：刘连杰(200433 上海，第二军医大学附属长海医院普外科)
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11 Soeth E, Vogel I, Roder C, et al. Comparative analysis of bone marrow and venous blood isolates from gastrointestinal cancer patients for the detection of disseminated tumor cells using reverse transcription PCR. Cancer Res, 1997, 57:3106-3110.
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14 Bustin SA, Gyselman VG, Williams NS, et al. Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients. Br J Cancer, 1999, 79: 1813-1820., 百拇医药