聚合酶链反应-微孔板杂交法检测输血传播病毒DNA
聚合酶链反应-微孔板杂交法检测输血传播病毒DNA
马达 郭乃洲 王惠民 张冬雷 王万相
摘 要 目的 建立聚合酶链反应(PCR)-微孔板杂交检测TT病毒(TTV)DNA的方法，探讨不同因素对方法敏感度和特异性的影响。方法 硫氰酸胍裂介异丙醇沉淀提取TTV DNA，经PCR扩增，扩增产物上标记的生物素与包被在微孔板上的链霉亲和素结合，标记有荧光素的探针与产物杂交，再与酶标抗荧光素抗体结合，经底物显色。结果 在各种影响因素中，当NaOH浓度为0.3 mol/L，杂交时间60 min,酶反应时间为45 min时，结果较好，洗板液以pH7.4 PBS-T为最佳，本法测定敏感度明显优于套式扩增电泳法观察结果的方法，且无假阳性出现。183例血清标本检测表明，TTV在正常人群、甲～庚型肝炎、非甲～庚型肝炎中的阳性率分别为3.6%，20.3%，28.1%。结论 本文用微孔板杂交酶呈色技术检测TTV DNA PCR产物，具有敏感、特异、快速，重复性良好，无溴乙锭污染等优点，可望取代电泳法，而作为TTV DNA的常规检测方法。
, 百拇医药
关键词：输血，病毒 聚合酶链反应 分子探针技术
1997年底日本学者Nishizawa[1]等从一例输血后的非甲～戊型肝炎中分离出一种新的肝炎相关病毒基因，与转氨酶升高有密切关系，并命名为输血传播(TT)病毒。目前TTV检测主要依赖于聚合酶链反应，由于TTV DNA在血清中含量较低，需经套式PCR扩增技术才能检出，操作较繁琐，且技术要求高，易引起交叉污染而出现假阳性，影响结果判断。我们建立的PCR-微孔板杂交法克服了以上缺陷，有推广应用价值，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样本 样本均来自盐城市第一人民医院传染科住院病人，采用无菌带盖试管空腹抽血5 ml,离心分离血清后置-20℃贮存备用，全部病例进行血清甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎标志物检测。
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1.1.2 试剂及仪器 硫氰酸胍购自Serva公司，streptavidin、dNTP、Taq酶为Promega公司产品，Anti-FLuorescein-POD购自Boehringer Mannheim公司，微孔板由上海华美公司提供，扩增仪为PE公司480型，酶标仪为奥地利SLT SPECTRA CLASSIC型。
1.1.3 引物 根据Okamoto报道[2]的TTV全序列设计如下引物和探针
T1 5′-TCA CCG ACA GAG GAG AGG
T2 5′-biotin-CAT GTA TAG GAT AGA CTG
T3 5′-biotin-CCT GGC AAT TTA CCA TTCC
探针5′-FITC-CTA CCT CTA TGG GCA GCA GCA
, http://www.100md.com
引物由上海生工生物公司合成，探针由中恒博奥基因诊断技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 核酸提取 100 μl血清加200 μl裂解液[3]混匀置室温10 min，加300 μl异丙醇，于4℃12 000 r/min离心15 min弃上清，70%预冷乙醇洗涤沉淀，真空抽干，加10 μlDEPC H2O或TE(pH8.0)溶解备用。
1.2.2 套式PCR扩增 取模板5 μl，加20 μl反应液(含1×Taq酶Buffer,200 μmoL/LdNTP，0.3 μmol/L T1/T3引物，Taq酶2U)，94℃预变性3 min，94℃45 s，56℃45 s，72℃60 s循环30次，最后72℃延伸5 min。取第1次扩增产物2 μl，加23 μl反应液(含T2/T3)引物，其余成分同第1次)进行第二次扩增，条件同前。电泳法观察结果，出现266 bp DNA扩增带为阳性。
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1.2.3 单式PCR扩增 取模板5 μl加20 μl反应液(含T2/T3引物，其余成份同二步扩增)，94℃预变性3 min,94℃45 s，56℃45 s，72℃60 s，循环35次，最后72℃延伸5 min。PCR产物作微孔板杂交。
1.2.4 包被微孔板 每孔加含1 μg streptavidin的碳酸盐缓冲液(pH9.6)100 μl，4℃过液，轻轻弃去液体，加300 μl封闭液(pH7.4 PBS，3%BSA，0.05%Tween-20)，42℃孵育2 h，弃去液体，真空抽干，置-20℃备用，至少可用1个月。
1.2.5 扩增产物检测 将单式PCR扩增产物与变性液(0.3 mol/L NaOH)等量混匀，室温变性5 min，取25 μl加入微孔板，再加入100 μl杂交应用液(0.5 μmol/L探针，0.25 g/L Ficoll 1400, 0.25 g/L BSA，0.25 g/L PVP，0.0625 g/L鲑鱼精DNA，20×SSC 312.5 ml/L)37℃60 min,用PBS-T洗板三次，滤纸轻轻拍干，每孔加入100 μl酶应用液(Anti-Flourescein POD，临用前用PBS-T 1∶1 000稀释)37℃45 min，洗板同前，加入100 μl TMB-H2O2显色5 min，加入100 μl 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪450 nm波长比色。
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2 结果
2.1 探针敏感度试验 取1份阳性血清，用正常混合血清进行10倍系列稀释，分别用微孔板杂交法与套式PCR电泳法检测PCR产物，当血清稀释103倍时，电泳法无阳性条带，而杂交法在血清稀释104时，仍呈阳性(A值为0.25)。
2.2 重复性测定 取二份TTV DNA阳性血清用本法重复测定20次，吸光度分别为1.48±0.22和0.74±0.14(X±s)，CV分别为14.8%和18.9%。
2.3 NaOH浓度的选择 用等量不同浓度NaOH作为变性液加入PCR产物中观察其对结果的影响，见图1。
图1 不同浓度NaOH的杂交结果
Fig.1 Effect of various concentrations of NaOH on hybridization
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2.4 杂交时间和酶反应时间对结果的影响 将TTV阳性血清分成二组，分别观察不同杂交时间及酶反应时间对结果的影响，各管均设立阴性对照，结果见表1。
表1 不同杂交时间和酶反应时间的杂交结果
Tab.1 Effect of different times of hybridization and enzymatic reaction on hybridization
组别
Group
反应时间(分)
Time of reaction(min)
15
, http://www.100md.com
30
45
60
75
90
105
120
一组
Group Ⅰ
阳性标本A值
A value of sample
0.96
1.25
, http://www.100md.com
1.41
1.68
1.75
1.79
1.81
1.83
阴性对照A值
A value of negative control
0.07
0.06
0.08
0.08
, 百拇医药
0.13
0.18
0.21
0.23
二组
Group Ⅱ
阳性标准A值
A value of sample
1.21
1.52
1.63
1.68
1.74
, http://www.100md.com
1.81
1.80
1.85
阴性对照A值
A value of negative control
0.03
0.06
0.08
0.13
0.19
0.23
0.28
, 百拇医药
0.28
一组：杂交时间；二组：酶反应时间
Group Ⅰ:Time of hybridization; Group Ⅱ:Time of enzymatic reaction2.5 产物用量对结果的影响 用pH7.4 PBS将扩增产物进行5倍系列稀释后，用本法检测，A值分别为1.62(5°)，1.78(5-1)，1.23(5-2)，0.68(5-3)，0.41(5-4)，0.20(5-5)，阴性对照A值为0.08。
2.6 不同洗板液对结果的影响 分别采用以下五种缓冲液作为洗板液，观察其对结果的影响：(1)蒸馏水；(2)蒸馏水加Tween-20；(3)生理盐水加Tween-20;(4)PBS加Tween-20；(5)Tris-HCL加Tween-20，结果显示以PBS加TWeen-20和Tris-HCl加TWee-20为最佳。
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2.7 183例不同人群TTV DNA检测结果 见表2。
表2 不同人群TTV DNA检测结果
Tab.2 Detection of serum TTV DNA among different populations
组别
Group
例数
Cases
阳性数(%)
Positive No.(%)
正常人群
, http://www.100md.com
Normal population
28
1(3.6)
甲～庚型肝炎
Hepatitis A-G
123
25(20.3)
非甲～庚型肝炎
Hepatitis Non A-G
32
9(28.1)
合计
, 百拇医药
Total
183
35(19.1)
3 讨论
由于TTV DNA在血清中含量较低，常规的TTV DNA检测需作二步扩增，测定时间较长，方法较繁琐。我们建立的PCR微孔板杂交法检测TTV DNA采用单式扩增，使方法更为简便、快速，并应用生物素—亲和素系统将PCR产物固相化于微孔板上，再与特异性荧光素标记的探针杂交，最后再用特异性的酶标记抗荧光素抗体进行酶呈色，消除了非特异性扩增产物的影响，避免出现假阳性，使结果更为可靠。
NaOH浓度对PCR产物的变性影响较大，浓度过高过低均可使A值降低，低浓度会使双链DNA解链不完全，而浓度过高可能导致DNA片段断裂，故终浓度以0.3 mol/L时(见图1)效果较好。在杂交过程中，我们观察了杂交时间和酶反应时间对吸光度的影响(见表1)，如时间过短，测定管吸光偏低，影响检测敏感度，时间过长，阴性对照管吸光度升高幅度较大，影响检测特异性，实验结果显示，以杂交时间60 min为宜，酶反应时间45 min较为合适。Tatsufi等[4]报道，当扩增产物稀释100～125倍时，吸光度达到最高峰，能检测到200 fg的病毒颗粒，而DNA浓度过高或过低，都会使吸光度降低。我们在实验中发现，用微孔板杂交检测TTV DNA时，扩增产物用pH7.4 PBS稀释5倍左右，结果较为理想。这可能是由于血清中TTV DNA含量较低的缘故。另外不同洗板液对结果亦有影响；我们对五种洗板液进行了比较，结果以PBS加Tween20和Tris-HCl加Tween-20为佳。
, 百拇医药
我们用该法对183例不同人群进行检测，正常人群、甲～庚型肝炎与非甲～庚型肝炎的阳性率分别为3.6%，20.3%和28.1%，提示各类人群均存在不同程度的感染率，非甲～庚型肝炎的感染率较高，说明TTV病毒可能是不明原因肝病的病源体之一。
从初步应用看来，我们建立的方法比套式PCR电泳法敏感100倍，重复性也较好，CV值在15%左右。由于采用了酶呈色技术，方法简便，结果客观，而且酶联方法比较成熟，易被人们掌握，该法排除了化学试剂(加溴化乙淀)造成的环境污染，同时避免了假阳性发生，有利于今后进行半定量、定量及自动化分析，可望逐步取代电泳法而作为常规检测方法，有较好的推广应用价值。
作者单位：马达(224001 江苏盐城市第一人民医院)
郭乃洲(224001 江苏盐城市第一人民医院)
王万相(224001 江苏盐城市第一人民医院)
, 百拇医药
王惠民(南通医学院附属医院酶学研究室)
张冬雷(南通医学院附属医院酶学研究室)
参考文献
1，Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biophys Res commun, 1997, 241: 92-97.
2，Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998, 16: 1-16.
3，王惠民，张冬雷.二重RT-PCR同时检测HGV和HCV RNA.临床检验杂志，1998，16：6-8.
4，Tatsufi H, Alice KI, Eishiro S. A PCR-microplate hybridization method for plant virus detection. J Virol Meth, 1994, 46: 223-236., http://www.100md.com
马达 郭乃洲 王惠民 张冬雷 王万相
摘 要 目的 建立聚合酶链反应(PCR)-微孔板杂交检测TT病毒(TTV)DNA的方法，探讨不同因素对方法敏感度和特异性的影响。方法 硫氰酸胍裂介异丙醇沉淀提取TTV DNA，经PCR扩增，扩增产物上标记的生物素与包被在微孔板上的链霉亲和素结合，标记有荧光素的探针与产物杂交，再与酶标抗荧光素抗体结合，经底物显色。结果 在各种影响因素中，当NaOH浓度为0.3 mol/L，杂交时间60 min,酶反应时间为45 min时，结果较好，洗板液以pH7.4 PBS-T为最佳，本法测定敏感度明显优于套式扩增电泳法观察结果的方法，且无假阳性出现。183例血清标本检测表明，TTV在正常人群、甲～庚型肝炎、非甲～庚型肝炎中的阳性率分别为3.6%，20.3%，28.1%。结论 本文用微孔板杂交酶呈色技术检测TTV DNA PCR产物，具有敏感、特异、快速，重复性良好，无溴乙锭污染等优点，可望取代电泳法，而作为TTV DNA的常规检测方法。
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关键词：输血，病毒 聚合酶链反应 分子探针技术
1997年底日本学者Nishizawa[1]等从一例输血后的非甲～戊型肝炎中分离出一种新的肝炎相关病毒基因，与转氨酶升高有密切关系，并命名为输血传播(TT)病毒。目前TTV检测主要依赖于聚合酶链反应，由于TTV DNA在血清中含量较低，需经套式PCR扩增技术才能检出，操作较繁琐，且技术要求高，易引起交叉污染而出现假阳性，影响结果判断。我们建立的PCR-微孔板杂交法克服了以上缺陷，有推广应用价值，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样本 样本均来自盐城市第一人民医院传染科住院病人，采用无菌带盖试管空腹抽血5 ml,离心分离血清后置-20℃贮存备用，全部病例进行血清甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎标志物检测。
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1.1.2 试剂及仪器 硫氰酸胍购自Serva公司，streptavidin、dNTP、Taq酶为Promega公司产品，Anti-FLuorescein-POD购自Boehringer Mannheim公司，微孔板由上海华美公司提供，扩增仪为PE公司480型，酶标仪为奥地利SLT SPECTRA CLASSIC型。
1.1.3 引物 根据Okamoto报道[2]的TTV全序列设计如下引物和探针
T1 5′-TCA CCG ACA GAG GAG AGG
T2 5′-biotin-CAT GTA TAG GAT AGA CTG
T3 5′-biotin-CCT GGC AAT TTA CCA TTCC
探针5′-FITC-CTA CCT CTA TGG GCA GCA GCA
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引物由上海生工生物公司合成，探针由中恒博奥基因诊断技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 核酸提取 100 μl血清加200 μl裂解液[3]混匀置室温10 min，加300 μl异丙醇，于4℃12 000 r/min离心15 min弃上清，70%预冷乙醇洗涤沉淀，真空抽干，加10 μlDEPC H2O或TE(pH8.0)溶解备用。
1.2.2 套式PCR扩增 取模板5 μl，加20 μl反应液(含1×Taq酶Buffer,200 μmoL/LdNTP，0.3 μmol/L T1/T3引物，Taq酶2U)，94℃预变性3 min，94℃45 s，56℃45 s，72℃60 s循环30次，最后72℃延伸5 min。取第1次扩增产物2 μl，加23 μl反应液(含T2/T3)引物，其余成分同第1次)进行第二次扩增，条件同前。电泳法观察结果，出现266 bp DNA扩增带为阳性。
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1.2.3 单式PCR扩增 取模板5 μl加20 μl反应液(含T2/T3引物，其余成份同二步扩增)，94℃预变性3 min,94℃45 s，56℃45 s，72℃60 s，循环35次，最后72℃延伸5 min。PCR产物作微孔板杂交。
1.2.4 包被微孔板 每孔加含1 μg streptavidin的碳酸盐缓冲液(pH9.6)100 μl，4℃过液，轻轻弃去液体，加300 μl封闭液(pH7.4 PBS，3%BSA，0.05%Tween-20)，42℃孵育2 h，弃去液体，真空抽干，置-20℃备用，至少可用1个月。
1.2.5 扩增产物检测 将单式PCR扩增产物与变性液(0.3 mol/L NaOH)等量混匀，室温变性5 min，取25 μl加入微孔板，再加入100 μl杂交应用液(0.5 μmol/L探针，0.25 g/L Ficoll 1400, 0.25 g/L BSA，0.25 g/L PVP，0.0625 g/L鲑鱼精DNA，20×SSC 312.5 ml/L)37℃60 min,用PBS-T洗板三次，滤纸轻轻拍干，每孔加入100 μl酶应用液(Anti-Flourescein POD，临用前用PBS-T 1∶1 000稀释)37℃45 min，洗板同前，加入100 μl TMB-H2O2显色5 min，加入100 μl 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪450 nm波长比色。
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2 结果
2.1 探针敏感度试验 取1份阳性血清，用正常混合血清进行10倍系列稀释，分别用微孔板杂交法与套式PCR电泳法检测PCR产物，当血清稀释103倍时，电泳法无阳性条带，而杂交法在血清稀释104时，仍呈阳性(A值为0.25)。
2.2 重复性测定 取二份TTV DNA阳性血清用本法重复测定20次，吸光度分别为1.48±0.22和0.74±0.14(X±s)，CV分别为14.8%和18.9%。
2.3 NaOH浓度的选择 用等量不同浓度NaOH作为变性液加入PCR产物中观察其对结果的影响，见图1。
图1 不同浓度NaOH的杂交结果
Fig.1 Effect of various concentrations of NaOH on hybridization
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2.4 杂交时间和酶反应时间对结果的影响 将TTV阳性血清分成二组，分别观察不同杂交时间及酶反应时间对结果的影响，各管均设立阴性对照，结果见表1。
表1 不同杂交时间和酶反应时间的杂交结果
Tab.1 Effect of different times of hybridization and enzymatic reaction on hybridization
组别
Group
反应时间(分)
Time of reaction(min)
15
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30
45
60
75
90
105
120
一组
Group Ⅰ
阳性标本A值
A value of sample
0.96
1.25
, http://www.100md.com
1.41
1.68
1.75
1.79
1.81
1.83
阴性对照A值
A value of negative control
0.07
0.06
0.08
0.08
, 百拇医药
0.13
0.18
0.21
0.23
二组
Group Ⅱ
阳性标准A值
A value of sample
1.21
1.52
1.63
1.68
1.74
, http://www.100md.com
1.81
1.80
1.85
阴性对照A值
A value of negative control
0.03
0.06
0.08
0.13
0.19
0.23
0.28
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0.28
一组：杂交时间；二组：酶反应时间
Group Ⅰ:Time of hybridization; Group Ⅱ:Time of enzymatic reaction2.5 产物用量对结果的影响 用pH7.4 PBS将扩增产物进行5倍系列稀释后，用本法检测，A值分别为1.62(5°)，1.78(5-1)，1.23(5-2)，0.68(5-3)，0.41(5-4)，0.20(5-5)，阴性对照A值为0.08。
2.6 不同洗板液对结果的影响 分别采用以下五种缓冲液作为洗板液，观察其对结果的影响：(1)蒸馏水；(2)蒸馏水加Tween-20；(3)生理盐水加Tween-20;(4)PBS加Tween-20；(5)Tris-HCL加Tween-20，结果显示以PBS加TWeen-20和Tris-HCl加TWee-20为最佳。
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2.7 183例不同人群TTV DNA检测结果 见表2。
表2 不同人群TTV DNA检测结果
Tab.2 Detection of serum TTV DNA among different populations
组别
Group
例数
Cases
阳性数(%)
Positive No.(%)
正常人群
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Normal population
28
1(3.6)
甲～庚型肝炎
Hepatitis A-G
123
25(20.3)
非甲～庚型肝炎
Hepatitis Non A-G
32
9(28.1)
合计
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Total
183
35(19.1)
3 讨论
由于TTV DNA在血清中含量较低，常规的TTV DNA检测需作二步扩增，测定时间较长，方法较繁琐。我们建立的PCR微孔板杂交法检测TTV DNA采用单式扩增，使方法更为简便、快速，并应用生物素—亲和素系统将PCR产物固相化于微孔板上，再与特异性荧光素标记的探针杂交，最后再用特异性的酶标记抗荧光素抗体进行酶呈色，消除了非特异性扩增产物的影响，避免出现假阳性，使结果更为可靠。
NaOH浓度对PCR产物的变性影响较大，浓度过高过低均可使A值降低，低浓度会使双链DNA解链不完全，而浓度过高可能导致DNA片段断裂，故终浓度以0.3 mol/L时(见图1)效果较好。在杂交过程中，我们观察了杂交时间和酶反应时间对吸光度的影响(见表1)，如时间过短，测定管吸光偏低，影响检测敏感度，时间过长，阴性对照管吸光度升高幅度较大，影响检测特异性，实验结果显示，以杂交时间60 min为宜，酶反应时间45 min较为合适。Tatsufi等[4]报道，当扩增产物稀释100～125倍时，吸光度达到最高峰，能检测到200 fg的病毒颗粒，而DNA浓度过高或过低，都会使吸光度降低。我们在实验中发现，用微孔板杂交检测TTV DNA时，扩增产物用pH7.4 PBS稀释5倍左右，结果较为理想。这可能是由于血清中TTV DNA含量较低的缘故。另外不同洗板液对结果亦有影响；我们对五种洗板液进行了比较，结果以PBS加Tween20和Tris-HCl加Tween-20为佳。
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我们用该法对183例不同人群进行检测，正常人群、甲～庚型肝炎与非甲～庚型肝炎的阳性率分别为3.6%，20.3%和28.1%，提示各类人群均存在不同程度的感染率，非甲～庚型肝炎的感染率较高，说明TTV病毒可能是不明原因肝病的病源体之一。
从初步应用看来，我们建立的方法比套式PCR电泳法敏感100倍，重复性也较好，CV值在15%左右。由于采用了酶呈色技术，方法简便，结果客观，而且酶联方法比较成熟，易被人们掌握，该法排除了化学试剂(加溴化乙淀)造成的环境污染，同时避免了假阳性发生，有利于今后进行半定量、定量及自动化分析，可望逐步取代电泳法而作为常规检测方法，有较好的推广应用价值。
作者单位：马达(224001 江苏盐城市第一人民医院)
郭乃洲(224001 江苏盐城市第一人民医院)
王万相(224001 江苏盐城市第一人民医院)
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王惠民(南通医学院附属医院酶学研究室)
张冬雷(南通医学院附属医院酶学研究室)
参考文献
1，Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biophys Res commun, 1997, 241: 92-97.
2，Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998, 16: 1-16.
3，王惠民，张冬雷.二重RT-PCR同时检测HGV和HCV RNA.临床检验杂志，1998，16：6-8.
4，Tatsufi H, Alice KI, Eishiro S. A PCR-microplate hybridization method for plant virus detection. J Virol Meth, 1994, 46: 223-236., http://www.100md.com