蛋白激酶C在中毒性休克中调节内皮细胞通透性的机制研究
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中国病理生理杂志 2000年第10期第16卷 第六届受体和信
作者：杨滔 黄巧冰 武一曼
单位：第一军医大学病理生理教研室，广东 广州 510515
关键词：
中国病理生理杂志0010289
目的：蛋白激酶C(PKC)通道是一条重要的细胞内信号传导通道，许多实验证明蛋白激酶C的激活在调节内皮屏障功能中起者重要的作用。静息情况下，PKC绝大多数位于细胞的胞浆部分，胞膜部分含量很少，当细胞受到某些刺激(如抗原或某些炎性介质)之后，胞膜中的磷脂崩解产生二酰基甘油(DAG)，DAG的增加可激活胞浆中的PKC，使其从胞浆转位至胞膜，这种转位是PKC活化的重要标志。有研究表明PKC只有在活化状态才能产生其调节作用。本研究观察PKC的激动剂佛波脂(PMA)刺激内皮细胞使PKC转位活化，用PKC的抑制剂可终止这种转化，同样条件下用中毒性休克的主要致病成分脂多糖(LPS)刺激内皮细胞也可以产生PKC的转位活化，用PKC的抑制剂也可终止这种转化。通过对内皮细胞内PKC信息传导通路的研究，探讨血管通透性调节的机制。方法：用最适佛波脂(PMA)波度(100 nmol/L)在不同时段刺激人脐静脉内皮细胞。收集、超声裂解细胞，细胞悬液离心，所得上清液为细胞浆蛋白粗提液，沉淀经混匀溶解再离心，上清液即为细胞膜蛋白粗提液。PKC的活性测定可在磷脂酰丝氨酸(PAS)、甘油二油酸酯(DG)、及Ca2+，[γ-32P]-ATP酶存在的条件下，使PKC与其特异底物髓磷脂碱性蛋白(MBP4-14)反应，用液体闪烁记数仪测定髓磷脂碱性蛋白(MBP4-14)中被PKC催化磷酸化时被置代的[γ-32P]-磷酸根基团放射活性，以此测得不同时段胞浆及胞膜PKC活性高低。提前使用PKC的抑制剂处理细胞，再用PMA和脂多糖(LPS)刺激后，测定胞浆及胞膜PKC活性高低。通过测定不同刺激前后胞膜、胞浆PKC的含量，可以分析PKC激动剂和脂多糖(LPS)对PKC转移和活化的影响。结果：未刺激细胞时，大多数PKC位于胞质中(约85168.83 counts.min-1)胞膜中含量较少(约34962.01 counts.min-1)，用佛波脂(PMA)刺激5 min之后，胞膜中PKC开始增高(达到48389.37 counts.min-1)，胞质中的PKC则开始下降(约为65639695 counts.min-1)。刺激持续到30 min则胞膜中的PKC含量达到高峰，相对胞质中PKC的含量也跌至最低。用LPS刺激后随时间的推移胞膜与胞浆中PKC含量变化趋势和PMA刺激细胞引起PKC的转化结果基本相同，用PKC的抑制剂提前处理细胞，均抑制PKC的转位。结论：1. 用PKC的激动剂PMA刺激内皮细胞，产生时间依赖性胞膜PKC活性增加，伴相应胞质PKC活性下降，而胞膜中的活性逐渐上升，提前用PKC的抑制剂处理细胞则抑制这种情况。说明PKC被激活后发生转位。2.用LPS刺激内皮细胞也同样出现时间依赖性胞膜PKC活性增加，伴相应胞质PKC活性下降。提前用PKC的抑制剂处理细胞也可抑制PKC的转位。说明机体发生中毒性休克后产生的LPS可激活PKC，使其发生转位从而引发包括内皮细胞通透性增高在内的一系列病理反应。, 百拇医药
单位：第一军医大学病理生理教研室，广东 广州 510515
关键词：
中国病理生理杂志0010289
目的：蛋白激酶C(PKC)通道是一条重要的细胞内信号传导通道，许多实验证明蛋白激酶C的激活在调节内皮屏障功能中起者重要的作用。静息情况下，PKC绝大多数位于细胞的胞浆部分，胞膜部分含量很少，当细胞受到某些刺激(如抗原或某些炎性介质)之后，胞膜中的磷脂崩解产生二酰基甘油(DAG)，DAG的增加可激活胞浆中的PKC，使其从胞浆转位至胞膜，这种转位是PKC活化的重要标志。有研究表明PKC只有在活化状态才能产生其调节作用。本研究观察PKC的激动剂佛波脂(PMA)刺激内皮细胞使PKC转位活化，用PKC的抑制剂可终止这种转化，同样条件下用中毒性休克的主要致病成分脂多糖(LPS)刺激内皮细胞也可以产生PKC的转位活化，用PKC的抑制剂也可终止这种转化。通过对内皮细胞内PKC信息传导通路的研究，探讨血管通透性调节的机制。方法：用最适佛波脂(PMA)波度(100 nmol/L)在不同时段刺激人脐静脉内皮细胞。收集、超声裂解细胞，细胞悬液离心，所得上清液为细胞浆蛋白粗提液，沉淀经混匀溶解再离心，上清液即为细胞膜蛋白粗提液。PKC的活性测定可在磷脂酰丝氨酸(PAS)、甘油二油酸酯(DG)、及Ca2+，[γ-32P]-ATP酶存在的条件下，使PKC与其特异底物髓磷脂碱性蛋白(MBP4-14)反应，用液体闪烁记数仪测定髓磷脂碱性蛋白(MBP4-14)中被PKC催化磷酸化时被置代的[γ-32P]-磷酸根基团放射活性，以此测得不同时段胞浆及胞膜PKC活性高低。提前使用PKC的抑制剂处理细胞，再用PMA和脂多糖(LPS)刺激后，测定胞浆及胞膜PKC活性高低。通过测定不同刺激前后胞膜、胞浆PKC的含量，可以分析PKC激动剂和脂多糖(LPS)对PKC转移和活化的影响。结果：未刺激细胞时，大多数PKC位于胞质中(约85168.83 counts.min-1)胞膜中含量较少(约34962.01 counts.min-1)，用佛波脂(PMA)刺激5 min之后，胞膜中PKC开始增高(达到48389.37 counts.min-1)，胞质中的PKC则开始下降(约为65639695 counts.min-1)。刺激持续到30 min则胞膜中的PKC含量达到高峰，相对胞质中PKC的含量也跌至最低。用LPS刺激后随时间的推移胞膜与胞浆中PKC含量变化趋势和PMA刺激细胞引起PKC的转化结果基本相同，用PKC的抑制剂提前处理细胞，均抑制PKC的转位。结论：1. 用PKC的激动剂PMA刺激内皮细胞，产生时间依赖性胞膜PKC活性增加，伴相应胞质PKC活性下降，而胞膜中的活性逐渐上升，提前用PKC的抑制剂处理细胞则抑制这种情况。说明PKC被激活后发生转位。2.用LPS刺激内皮细胞也同样出现时间依赖性胞膜PKC活性增加，伴相应胞质PKC活性下降。提前用PKC的抑制剂处理细胞也可抑制PKC的转位。说明机体发生中毒性休克后产生的LPS可激活PKC，使其发生转位从而引发包括内皮细胞通透性增高在内的一系列病理反应。, 百拇医药