恶性疟红细胞膜蛋白1在疟原虫免疫逃避中的作用
恶性疟红细胞膜蛋白1在疟原虫免疫逃避中的作用
王宪锋 薛采芳 甄荣芬
关键词：恶性疟原虫红细胞膜蛋白1；免疫逃避；抗原变异；细胞粘附；综述
疟疾是热带病中最严重的一种寄生虫病。疟原虫和蚊媒抗药性的出现，战争，自然灾害，人员的频繁流动，以及近年来全球变暖对世界各地的疟疾流行均已产生了较严重的影响。因此，疟疾疫苗的研制迫在眉捷。疟原虫的免疫逃避机制是该研究的困难之一。疟原虫免疫逃避的机制有很多种，如抗原变异、细胞粘附、宿主免疫应答的抑制或破坏、分子模拟和T表位的多态性等等。越来越多的研究发现恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,PfEMP1)在免疫逃避中具有重要的地位，可同时参与抗原变异和受染红细胞(infected red blood cell,IRBC)与内皮细胞的细胞粘附。
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1 PfEMP1的分子生物学
PfEMP1(200～350KD)是一个重要的靶抗原家族，在无性血期疟原虫由var基因表达，通过某种未知的方式运输至IRBC表面knob结构处，然后插入到IRBC膜上，显著地暴露在外，不仅参与抗原变异，也参与细胞粘附和Rosetting(IRBC与正常红细胞的粘连)[1]。最近发现，不仅无性血期，而且有性传播期 也可表达PfEMP1变异体[2]。
尽管PfEMP1是变异分子，但它仍具有一些共同的结构特征。编码PfEMP1的var基因是一个多基因大家族[3～5]，约占恶性疟原虫(Plasmodium falciparum， P.f.)基因组的6%，含50～150个成员，每个var基因10～12kb，具两个外显子：5’外显子高度多态，编码PfEMP1的胞外区和跨膜区，含1～5个Duffy样结合结构域(Duffy-binding like domain，DBL)，DBL1与DBL2之间有一个结构域间半胱氨酸富含区(cysteine-rich interdomain region， CIDR)，CIDR与DBL1共同构成保守的头部结构，其后为1～3个可变的DBL结构域；3’外显子十分保守，编码PfEMP1胞浆内的酸性末断区(acidic-terminal segment，ATS)。knob结构处膜下聚集带大量电荷的富含His和Lys蛋白，这些蛋白可能与ATS形成盐桥将PfEMP1锚定于膜上 [5]。
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疟原虫染色体中央区结构上保守，端粒区在长度和序列上均呈多态性，抗原编码基因则常位于端粒临近区。众多研究表明[6～10],大多数染色体的亚端粒区分布有var基因,但也有部分var基因分布于染色体中央区[5、7、10]。染色体末端的异位重组可赋予亚端粒var基因以遗传多态性，从而产生具有新的抗原性和粘附表型的PfEMP1变异体，而染色体中央区的var基因则可能作为var基因的“基因池”而稳定存在[9]。
2 PfEMP1与抗原变异
抗原变异一直被人们认为是感染性病原体逃避宿主免疫攻击的主要途径。所谓抗原变异是指寄生虫生活史各期不断地更换抗原，产生新的变异体，使宿主体内每次产生的抗体，对下一次出现的新的变异体都无作用。在生物进化中，变异的根本原因是突变，单个个体突变的基因数目必定有限，否则会危及到个体生存，所以必须在种内个体间进行基因交流，筛选优势杂种，以适应自然选择，这样必然造成抗原在种群内的多态现象，即不同个体的同类抗原具有多种形式。
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在每种疟原虫，可变异的抗原均是表达于IRBC表面的虫源性蛋白[1]。Biggs等[11]以血清学和生物化学方法检测一P.f.克隆后代的IRBC表面抗原，发现产生了抗原差异，实验证明该抗原差异是由虫源性变异体蛋白PfEMP1产生的。随后Roberts等[12]发现，PfEMP1的变异不是有规律的，而是随机的。
Smith等[4]由三个抗原性不同的P.f.克隆的var cDNA推出的氨基酸序列均不同，但均含有var DBL1结构域的一致性序列(后者在var家族中高度保守[5])，表明这三个cDNA均为var家族的成员。说明抗原表型的改变与不同var基因的表达直接相关，不同 var基因的表达是抗原变异的分子基础。
关于其它几种原虫抗原变异的基本机制已有综述[13]，主要有三种机制：(I)转录前控 制，即改变被转录的抗原基因，启动子不变；(II)转录控制，即活化静止抗原基因的启动 子，同时关闭活性抗原基因的启动子；(III)转录后控制，改变抗原mRNA的阅读框。但有关研究[4]的结果不能说明P.f.采用了上述哪种抗原变异的机制。Borst等[14]提出一种可能性：P.f.始终转录所有的var基因，但在mRNA加工时降解了所有的mRNA而只余其一。
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1998年，Chen等[15]在试验中发现，同一细胞几条染色体上的var基因在环状体期同时转录，但在滋养体期仅检测到一个var转录本，并在红细胞膜上也仅发现一种125I标记的PfEMP1。表明单个P.f.可同时转录多个var基因，经调控加工后只选择其中一个var产物抵达宿主细胞表面。该实验证明了Borst等人当初推测的正确性。有实验表明，var基因的广泛转录发生于环状体早期，而基因表达的严紧控制是在滋养体期[16]。是否还存在其他的抗原变异机制尚不清楚。
3 PfEMP1与细胞粘附
实验证明，仅幼期无性红内疟原虫随血流循环，而成熟期P.f.则粘附于各器官的血管内皮。粘附可能是多种IRBC表面分子与内皮细胞表面不同粘附分子相互作用的结果。80年代PfEMP1即被认为是一种介导粘附的虫源性IRBC表面分子，它可能在粘附中起着主要作用。var基因含有众多的成员，说明PfEMP1的受体也必然具有多样性。已确定的PfEMP1受体有CD36、血小板凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin,TSP)、ICAM-1和硫酸软骨素A [17、18]。其中研究的最为深入的是CD36。
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预先以抗PfEMP1抗体、CD36和TSP处理IRBC的抽提物可明显降低PfEMP1与CD36和TSP的结合[17],说明PfEMP1是CD36和TSP 在IRBC膜上的受体。在C5克隆和MC株，CD36和TSP可结合于以胰蛋白酶温和消化IRBC产生的不同tryptic片段，而在克隆ItG-ICAM，同一tryptic片段与CD36和TSP均可结合。提示同一PfEMP1分子的CD36-和TSP-结合结构域不同[17]。Baruch 等[19]对MC株PfEMP1的576-755位氨基酸重组蛋白rC1-2[1-179](该区可与CD36特异性结合)进行分析发现，rC1-2[1-179]所含7个Cys，尤其是N-端Cys富含区CIDR中的5个Cys在不同的var基因中高度保守，表明Cys在CD36结合结构域的结构(形成高度保守的构象)和功能上具有重要的作用。最近，Smith等[20]关于A4 var(该基因编码的PfEMP1含五个DBL结构域和两个CIDR结构域)的实验结果表明，CIDR1是结合CD36的唯一结构域，不需要其他结构域的辅助。是否所有var基因中的CIDR具有同样功能还有待于进一步研究。
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PfEMP1与TSP、ICAM-1和硫酸软骨素A间相互作用的细节问题也正在研究之中。
有人发现，与MSP1和MSP2分子C-端结合的GPI可促使成熟IRBC表达PfEMP1，使IRBC粘附于血管内皮细胞[21]。
寄居于红细胞内的疟原虫可对红细胞造成损伤，为避免被脾细胞杀灭，疟原虫以虫源性粘附分子修饰宿主细胞膜使之粘附于内皮细胞，但同时虫源性抗原暴露于宿主免疫系统，此时，疟原虫又可进行抗原变异，不易被免疫效应细胞和效应分子识别，体现了疟原虫在进化上对宿主的高度适应性。而PfEMP1集细胞粘附与抗原变异两种功能于一体，足见其在免疫逃避中的重要性。
4 结语
疟疾疫苗的研究已经走过一段相当艰难的路程，人们合成了很多保护性抗原，如Pataro- yo的杂合肽sf66已经在大量的人体试验中取得了可喜的部分保护性作用，但疟疾疫苗的研究在目前还没有取得突破性进展，其中除了合成抗原和天然抗原的差异、疫苗佐剂及细胞因子等方面的原因以外，一个重要的原因就是疟原虫免疫逃避的机制问题。免疫逃避无疑会削弱疟疾疫苗的作用，给疫苗的研制和使用带来困难。疟原虫可能与其它真核生物一样，本身具有一套“防御系统”以抵御外部侵害，该系统可进行包括改变抗原性、抑制或破坏宿主的免疫应答和分子模拟等各种变化。其中的很多功能涉及到疟原虫的基因结构和基因表达调控。
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从生物进化的角度看，寄生虫与宿主之间的相互关系是在长期共进化过程中基于种间斗争建立起来的平衡关系，这种平衡关系主要具有免疫学性质，即宿主因寄生虫抗原致敏所产生的免疫应答能产生作用于寄生虫的免疫效应，寄生虫也可产生逃避免疫效应的机制。寄生虫与宿主之间的这种关系分别受各自的基因控制，疟原虫与其宿主也必然如此。
自从1995年编码PfEMP1的var基因被克隆以来，关于PfEMP1抗原变异和细胞粘附的研究才真正地深入到了分子水平。但目前仍有许多问题没有解决，如PfEMP1抗原变异的机制，PfEMP1与内皮细胞不同受体结合的结构域，粘附特异性的决定因素，序列多态性的机制和PfEMP1分泌至红细胞膜的途径等。这些问题的解决对于疟原虫免疫逃避机制的阐明和疟疾疫苗的研制都具有重要意义。
作者单位：第四军医大学病原生物学教研室 西安 710032
参考文献
, http://www.100md.com
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[3] Baruch DI, Pasloske BL, Singh HB, et al. Cloning the P. falciparum gene encoding PfEMP1, a malarial variant antigen and adherence receptor on the surface of parasitized human erythrocytes[J]. Cell,1995,82：77～87.
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[4] Smith JD, Chitnis CE, Craig AG, et al. Switches in expression of Plasmodium falciparum var genes correlate with changes in antigenic and cytoadherent phenotypes of infected erythrocytes[J] Cell, 1995,82：101～110.
[5] Su XZ, Heatwole VM, Wertheimer SP, et al. The large diverse gene family var encodes proteins involved in cytoadherence and antigenic variation of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes[J].Cell,1995,82：89～100.
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[16] Scherf A , Hernandez Rivas R, Buffet P, et al. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum[J]. EMBO J,1998, 17(18)：5418～5426.
[17] Baruch DI, Gormely JA, Ma C, et al. Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 is a parasitized erythrocyte receptor for adherence to CD36, thrombospondin, and intercellular adhesion molecule 1[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(8)：3497～3502.
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[18] Reeder JC , Cowman AF, Davern KM, et al. The adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to chondroitin sulfate A is mediated by P. falciparum erythrocyte membrane protein 1[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96(9):5198～5202.
[19] Baruch DI, Ma XC, Singh HB, et al. Identification of a region of PfEMP1 that mediates adherence of Plasmodium falciparum infected erythrocytes to CD36: conserved function with variant sequence[J]. Blood,1997,90(9)：3766～3775 .
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[20] Smith-JD, Kyes S, Craig AG, et al.Analysis of adhesive domains from the A4VAR Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein-1 identifies a CD36 binding domain[J].Mol Biochem Parasitol,1998,97(1-2):133～148.
[21] Gerold P , Schofield L, Blackman MJ, et al. Structural analysis of the glycosyl-phosphatidylinositol membrane anchor of the merozoite surface proteins-1 and -2 of Plasmodium falciparum[J]. Mol Biochem Parasitol, 1996,75(2)：131～143., http://www.100md.com
王宪锋 薛采芳 甄荣芬
关键词：恶性疟原虫红细胞膜蛋白1；免疫逃避；抗原变异；细胞粘附；综述
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2 PfEMP1与抗原变异
抗原变异一直被人们认为是感染性病原体逃避宿主免疫攻击的主要途径。所谓抗原变异是指寄生虫生活史各期不断地更换抗原，产生新的变异体，使宿主体内每次产生的抗体，对下一次出现的新的变异体都无作用。在生物进化中，变异的根本原因是突变，单个个体突变的基因数目必定有限，否则会危及到个体生存，所以必须在种内个体间进行基因交流，筛选优势杂种，以适应自然选择，这样必然造成抗原在种群内的多态现象，即不同个体的同类抗原具有多种形式。
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在每种疟原虫，可变异的抗原均是表达于IRBC表面的虫源性蛋白[1]。Biggs等[11]以血清学和生物化学方法检测一P.f.克隆后代的IRBC表面抗原，发现产生了抗原差异，实验证明该抗原差异是由虫源性变异体蛋白PfEMP1产生的。随后Roberts等[12]发现，PfEMP1的变异不是有规律的，而是随机的。
Smith等[4]由三个抗原性不同的P.f.克隆的var cDNA推出的氨基酸序列均不同，但均含有var DBL1结构域的一致性序列(后者在var家族中高度保守[5])，表明这三个cDNA均为var家族的成员。说明抗原表型的改变与不同var基因的表达直接相关，不同 var基因的表达是抗原变异的分子基础。
关于其它几种原虫抗原变异的基本机制已有综述[13]，主要有三种机制：(I)转录前控 制，即改变被转录的抗原基因，启动子不变；(II)转录控制，即活化静止抗原基因的启动 子，同时关闭活性抗原基因的启动子；(III)转录后控制，改变抗原mRNA的阅读框。但有关研究[4]的结果不能说明P.f.采用了上述哪种抗原变异的机制。Borst等[14]提出一种可能性：P.f.始终转录所有的var基因，但在mRNA加工时降解了所有的mRNA而只余其一。
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3 PfEMP1与细胞粘附
实验证明，仅幼期无性红内疟原虫随血流循环，而成熟期P.f.则粘附于各器官的血管内皮。粘附可能是多种IRBC表面分子与内皮细胞表面不同粘附分子相互作用的结果。80年代PfEMP1即被认为是一种介导粘附的虫源性IRBC表面分子，它可能在粘附中起着主要作用。var基因含有众多的成员，说明PfEMP1的受体也必然具有多样性。已确定的PfEMP1受体有CD36、血小板凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin,TSP)、ICAM-1和硫酸软骨素A [17、18]。其中研究的最为深入的是CD36。
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预先以抗PfEMP1抗体、CD36和TSP处理IRBC的抽提物可明显降低PfEMP1与CD36和TSP的结合[17],说明PfEMP1是CD36和TSP 在IRBC膜上的受体。在C5克隆和MC株，CD36和TSP可结合于以胰蛋白酶温和消化IRBC产生的不同tryptic片段，而在克隆ItG-ICAM，同一tryptic片段与CD36和TSP均可结合。提示同一PfEMP1分子的CD36-和TSP-结合结构域不同[17]。Baruch 等[19]对MC株PfEMP1的576-755位氨基酸重组蛋白rC1-2[1-179](该区可与CD36特异性结合)进行分析发现，rC1-2[1-179]所含7个Cys，尤其是N-端Cys富含区CIDR中的5个Cys在不同的var基因中高度保守，表明Cys在CD36结合结构域的结构(形成高度保守的构象)和功能上具有重要的作用。最近，Smith等[20]关于A4 var(该基因编码的PfEMP1含五个DBL结构域和两个CIDR结构域)的实验结果表明，CIDR1是结合CD36的唯一结构域，不需要其他结构域的辅助。是否所有var基因中的CIDR具有同样功能还有待于进一步研究。
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PfEMP1与TSP、ICAM-1和硫酸软骨素A间相互作用的细节问题也正在研究之中。
有人发现，与MSP1和MSP2分子C-端结合的GPI可促使成熟IRBC表达PfEMP1，使IRBC粘附于血管内皮细胞[21]。
寄居于红细胞内的疟原虫可对红细胞造成损伤，为避免被脾细胞杀灭，疟原虫以虫源性粘附分子修饰宿主细胞膜使之粘附于内皮细胞，但同时虫源性抗原暴露于宿主免疫系统，此时，疟原虫又可进行抗原变异，不易被免疫效应细胞和效应分子识别，体现了疟原虫在进化上对宿主的高度适应性。而PfEMP1集细胞粘附与抗原变异两种功能于一体，足见其在免疫逃避中的重要性。
4 结语
疟疾疫苗的研究已经走过一段相当艰难的路程，人们合成了很多保护性抗原，如Pataro- yo的杂合肽sf66已经在大量的人体试验中取得了可喜的部分保护性作用，但疟疾疫苗的研究在目前还没有取得突破性进展，其中除了合成抗原和天然抗原的差异、疫苗佐剂及细胞因子等方面的原因以外，一个重要的原因就是疟原虫免疫逃避的机制问题。免疫逃避无疑会削弱疟疾疫苗的作用，给疫苗的研制和使用带来困难。疟原虫可能与其它真核生物一样，本身具有一套“防御系统”以抵御外部侵害，该系统可进行包括改变抗原性、抑制或破坏宿主的免疫应答和分子模拟等各种变化。其中的很多功能涉及到疟原虫的基因结构和基因表达调控。
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从生物进化的角度看，寄生虫与宿主之间的相互关系是在长期共进化过程中基于种间斗争建立起来的平衡关系，这种平衡关系主要具有免疫学性质，即宿主因寄生虫抗原致敏所产生的免疫应答能产生作用于寄生虫的免疫效应，寄生虫也可产生逃避免疫效应的机制。寄生虫与宿主之间的这种关系分别受各自的基因控制，疟原虫与其宿主也必然如此。
自从1995年编码PfEMP1的var基因被克隆以来，关于PfEMP1抗原变异和细胞粘附的研究才真正地深入到了分子水平。但目前仍有许多问题没有解决，如PfEMP1抗原变异的机制，PfEMP1与内皮细胞不同受体结合的结构域，粘附特异性的决定因素，序列多态性的机制和PfEMP1分泌至红细胞膜的途径等。这些问题的解决对于疟原虫免疫逃避机制的阐明和疟疾疫苗的研制都具有重要意义。
作者单位：第四军医大学病原生物学教研室 西安 710032
参考文献
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