核酶对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转
核酶对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转
陈良安 刘又宁
摘 要 目的 探讨针对多药耐药基因(mdr1)的核酶对肺腺癌细胞多药耐药的逆转作用。方法以mdr1 mRNA 880位点为靶位点，通过脂质体介导，将抗mdr1核酶表达质粒(pH β Apr-1 neo/mdr1-Rb)导入肺腺癌耐药细胞株A549/R。分别采用RT-PCR、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及MTT方法，观察细胞的mdr1 mRNA、P糖蛋白(P-glycoprotein, Pgp)表达和对阿霉素敏感性的变化。结果 经抗mdr1核酶处理的细胞，mdr1 mRNA、Pgp明显降低，细胞内罗丹明聚集，对阿霉素的敏感性提高200倍。结论 针对多药耐药基因mdr1的核酶可明显降解mdr1 mRNA，抑制Pgp的表达，具有强大的逆转肺腺癌细胞多药耐药的作用。
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主题词：肺肿瘤；腺癌；核酶；多药耐药性
肺癌的多药耐药(multidrug resistance, MDR)一直严重影响着肺癌的化疗效果和预后。而传统的MDR逆转剂是作用在P糖蛋白(P-glycoprotein， Pgp)水平，效率低，副作用大。随着分子生物学发展，尤其是对核酶(ribozyme)的研究为肺癌MDR的逆转提供了新的策略。核酶通过碱基配对，特异地与靶mRNA结合，并切割分解靶mRNA。其突出的高效率、高特异性、少副作用，被誉为分子剪刀，为从基因水平逆转MDR展示了良好的前景。本研究旨在探讨用这一先进技术来逆转MDR的可能性。
材料与方法
一、材料
Pgp抗体、罗丹明为中山公司产品，PCR、RT-PCR试剂为鼎国公司产品，MTT为Sigma公司产品，G418、脂质体为Gibco公司产品。肺腺癌耐药细胞系A549/R(对阿霉素、长春新碱和丝裂霉素等多种抗癌药耐药)由第三军医大学提供。mdr1核酶表达质粒pH β Apr-1 neo/mdr1-Rb由美国Scanlon教授提供。
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二、方法
1.质粒：pH β Apr-1 neo/mdr1-Rb质粒DNA的制备，DNA、RNA提取，PCR，RT-PCR按常规方法进行。
2.A549/R细胞的转染和筛选：取6孔培养板，每孔种入约1×105A549/R细胞，细胞生长汇合达70%时开始转染。质粒DNA 5 μg，脂质体10 μl，孵育时间6 h。分别设置转染组(A组)和未转染组(B组)。待转染细胞生长72 h后，细胞接近融合时，按1∶3密度传代；继续培养至细胞密度达80%融合时，加浓度为80 μg/ml的G418培养液进行筛选，以未转染的细胞做筛选对照。当对照细胞绝大部分死亡时，再更换一次转染细胞的筛选培养液(浓度为800 μg/ml)，2 d后，将G418浓度降至400 μg/ml维持筛选；3周后可见抗性克隆形成，消化收集克隆后继续培养待测各种指标。
3.mdr1基因表达水平的测定：Pgp的流式细胞术检测、罗丹明试验按文献[1，2]方法进行。
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4.细胞药敏试验(MTT试验)：将细胞数调整至3×104/ml，取96孔板，每孔加入200 μl细胞悬液，培养箱中过夜；去掉培养液，加入用1640配制的不同浓度的阿霉素溶液(每ml分别含0.000 01，0.000 1，0.001，0.01，0.1，1，10，100 μg)200 μl/孔，细胞培养箱中48 h后，每孔加入MTT 20 μl(10 mg/ml)，保温4 h。弃上清，加入二甲亚砜200 μl/孔，酶标仪上测出570 nm值，算出ID50并做图。
结果
一、细胞A549/R的MDR特性
1.DNA水平：PCR在A549/R细胞可扩增出mdr1基因片断(图1)，证明该细胞内有mdr1基因存在。
M：相对分子质量标准；Pc：阳性对照；Nc：阴性对照；A：A549/R细胞
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图1 A549/R细胞mdr1 PCR
2.mRNA水平：RT-PCR证实A549/R有mdr1-mRNA表达(图2)，提示该细胞内已有mdr1基因转录。
M：相对分子质量标准；Pc:阳性对照；Nc：阴性对照；B：对照细胞；A：Ribozyme处理细胞
图2 两组细胞mdr1 RT-PCR比较
3.Pgp水平：流式细胞术证明A549/R有Pgp的存在，提示该细胞在蛋白质水平表达mdr1。
二、mdr1核酶对MDR的逆转效果
1.mdr1 mRNA：由图2可见，A组mRNA水平明显低于B组。经密度扫描证实，A组mRNA水平下降85%。
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2.Pgp表达：流式细胞术证明A组细胞荧光强度显著低于B组(A组相对荧光强度5.87%，B组相对荧光强度12.24%)，表明A组细胞Pgp含量低于B组，提示Pgp的表达受到极大的阻滞。
3.Pgp功能测试——罗丹明试验：罗丹明流式细胞术结果提示，A组细胞荧光强度显著高于B组(A组相对荧光强度159.95%，B组相对荧光强度70.36%)。罗丹明是Pgp的特异性荧光底物，能被Pgp从细胞内泵出，A组细胞由于Pgp的含量减少，排出罗丹明的功能下降，细胞内罗丹明聚积，故荧光强度明显高于B组。
4.药敏试验：A组和B组细胞的ID50分别为0.001 μg/ml和0.2 μg/ml，即A组细胞对阿霉素的敏感性是B组细胞的200倍，极大地恢复了细胞对阿霉素的敏感性。随着阿霉素浓度的增加，A组细胞的存活率明显下降。
讨论
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mdr1基因[3-5]是导致MDR最直接的原因，它编码1 280个氨基酸的Pgp，后者能将细胞内药物泵出，降低胞内药物浓度，增加对药物的抗性 。从分子生物学理解MDR形成过程是：mdr1基因→转录→mdr1 mRNA→翻译→Pgp→泵出胞内抗癌药物→MDR表型。显然，在这一过程的上游阻止其发展效果最好，而传统的MDR逆转剂均在最下游拮抗Pgp，较为被动，效率低，副作用大，难以进入临床。本研究试图用抗mdr1核酶在mRNA水平阻止MDR的形成，提高肺腺癌细胞对抗癌药的敏感性。
核酶由Cech等[6]首次发现。目前，对其结构、功能和生物学特征有了深入了解，正在向应用方向发展[7，8]。其本质是RNA，具有与RNA特异性结合和催化功能，俗称为分子剪刀，与其他反义物比较有如下特征和优势[9]：(1)其作用底物主要是RNA分子；(2)与底物通过碱基互补配对而且有高度特异性；(3)一个分子核酶在切割靶RNA后，可以从杂交链上解脱下来，再对新的RNA进行切割反应，可循环使用，故有较高的效率；(4)有特定的切割位点识别序列，其中GUC为最常见的切割位点；(5)核酶可迅速与底物RNA结合形成高级结构，从而防止了核酸酶的降解，在细胞内比其他反义物稳定。
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切割位点的选择是影响核酶作用效果的关键，它要求切割位点必须是该基因的重要功能区，而且还要考虑到靶RNA的二级结构。此外，核酶具有高效识别和切割RNA链上的GUC位点的特性，在mdr1 mRNA上共有37个比较重要的GUC序列，其中5′非翻译区6个，3′非翻译区3个。我们选择了21号外显子的第880处的GUC为靶位点。它位于mdr1 mRNA前部的翻译编码区，在两个ATP结合区中间，在此位点切断mdr1 mRNA将不能翻译出完整的Pgp，使其丧失泵功能[8]。本实验结果显示，在该位点切割，使得mdr1 mRNA下降80%以上，Pgp表达显著降低，ID50降低了200倍，证明靶位点选择是成功的。
根据靶位点设计相应的核酶序列。由于核酶为RNA，直接将其转入细胞内极易被细胞内RNA酶破坏，因而，我们采用含能转录核酶基因的pHBApr-1 neo/mdr1-rb载体转入细胞内，使其在细胞内转录出切割mdr1 mRNA的核酶。实验结果显示，该核酶在细胞内获得高水平的表达，产生了足够降解mdr1 mRNA的核酶。
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由于Pgp减少，使瘤细胞不能排除细胞内罗丹明。药敏试验结果显示，A549/R细胞对阿霉素的抗性几乎消失。
作者单位：陈良安(100853 北京，解放军总医院呼吸科)
刘又宁(100853 北京，解放军总医院呼吸科)
参考文献
1.Labroille G, Belloc F, Bilhou NC, et al. Cytometric study of intracellular Pgp expression and reversal of drug resistance. Cytometry, 1998,32：86-94.
2.Petriz J, Garcia LJ. Flow cytometric analysis of P-glycoprotein function using rhodaminel23. Leukemia, 1997,11：1124-1130.
, http://www.100md.com
3.Roninson IB, Abelson HT, Housman DE, et al. Amplification of specific DNA sequence correlates with MDR in Chinese hamster cell. Nature, 1984,309：626-628.
4.Gros P, Neriah YB, Croop JM, et al. Isolation and expression of a complementary DNA that confers multidrug resistance. Nature, 1986,323：728-731.
5.Stein WD. Kinetics of the multidrug transporter (P-glycoprotein) and its reversal. Physiol Rev, 1997,77：545-590.
, 百拇医药
6.Cech T. The chemistry of self-splicing RNA and RNA enzymes. Science, 1987,236：1532-1539.
7.Walter NC, Burke JM. The hairpin ribozyme: structure, assembly and catalysis. Curr Opin Chem Biol, 1998,2：24-30.
8.Branch AD, Klotman PE. Optimizing ribozyme for somatic cell gene therapy. Exp Nephrol, 1998,6：78-83.
9.Bouffard DY, Ohkawa T, Kijima H. Oligonucleotide modulation of multidrug resistance. Eur J Cancer, 1996,32A：1010-1018., http://www.100md.com
陈良安 刘又宁
摘 要 目的 探讨针对多药耐药基因(mdr1)的核酶对肺腺癌细胞多药耐药的逆转作用。方法以mdr1 mRNA 880位点为靶位点，通过脂质体介导，将抗mdr1核酶表达质粒(pH β Apr-1 neo/mdr1-Rb)导入肺腺癌耐药细胞株A549/R。分别采用RT-PCR、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及MTT方法，观察细胞的mdr1 mRNA、P糖蛋白(P-glycoprotein, Pgp)表达和对阿霉素敏感性的变化。结果 经抗mdr1核酶处理的细胞，mdr1 mRNA、Pgp明显降低，细胞内罗丹明聚集，对阿霉素的敏感性提高200倍。结论 针对多药耐药基因mdr1的核酶可明显降解mdr1 mRNA，抑制Pgp的表达，具有强大的逆转肺腺癌细胞多药耐药的作用。
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主题词：肺肿瘤；腺癌；核酶；多药耐药性
肺癌的多药耐药(multidrug resistance, MDR)一直严重影响着肺癌的化疗效果和预后。而传统的MDR逆转剂是作用在P糖蛋白(P-glycoprotein， Pgp)水平，效率低，副作用大。随着分子生物学发展，尤其是对核酶(ribozyme)的研究为肺癌MDR的逆转提供了新的策略。核酶通过碱基配对，特异地与靶mRNA结合，并切割分解靶mRNA。其突出的高效率、高特异性、少副作用，被誉为分子剪刀，为从基因水平逆转MDR展示了良好的前景。本研究旨在探讨用这一先进技术来逆转MDR的可能性。
材料与方法
一、材料
Pgp抗体、罗丹明为中山公司产品，PCR、RT-PCR试剂为鼎国公司产品，MTT为Sigma公司产品，G418、脂质体为Gibco公司产品。肺腺癌耐药细胞系A549/R(对阿霉素、长春新碱和丝裂霉素等多种抗癌药耐药)由第三军医大学提供。mdr1核酶表达质粒pH β Apr-1 neo/mdr1-Rb由美国Scanlon教授提供。
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二、方法
1.质粒：pH β Apr-1 neo/mdr1-Rb质粒DNA的制备，DNA、RNA提取，PCR，RT-PCR按常规方法进行。
2.A549/R细胞的转染和筛选：取6孔培养板，每孔种入约1×105A549/R细胞，细胞生长汇合达70%时开始转染。质粒DNA 5 μg，脂质体10 μl，孵育时间6 h。分别设置转染组(A组)和未转染组(B组)。待转染细胞生长72 h后，细胞接近融合时，按1∶3密度传代；继续培养至细胞密度达80%融合时，加浓度为80 μg/ml的G418培养液进行筛选，以未转染的细胞做筛选对照。当对照细胞绝大部分死亡时，再更换一次转染细胞的筛选培养液(浓度为800 μg/ml)，2 d后，将G418浓度降至400 μg/ml维持筛选；3周后可见抗性克隆形成，消化收集克隆后继续培养待测各种指标。
3.mdr1基因表达水平的测定：Pgp的流式细胞术检测、罗丹明试验按文献[1，2]方法进行。
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4.细胞药敏试验(MTT试验)：将细胞数调整至3×104/ml，取96孔板，每孔加入200 μl细胞悬液，培养箱中过夜；去掉培养液，加入用1640配制的不同浓度的阿霉素溶液(每ml分别含0.000 01，0.000 1，0.001，0.01，0.1，1，10，100 μg)200 μl/孔，细胞培养箱中48 h后，每孔加入MTT 20 μl(10 mg/ml)，保温4 h。弃上清，加入二甲亚砜200 μl/孔，酶标仪上测出570 nm值，算出ID50并做图。
结果
一、细胞A549/R的MDR特性
1.DNA水平：PCR在A549/R细胞可扩增出mdr1基因片断(图1)，证明该细胞内有mdr1基因存在。
M：相对分子质量标准；Pc：阳性对照；Nc：阴性对照；A：A549/R细胞
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图1 A549/R细胞mdr1 PCR
2.mRNA水平：RT-PCR证实A549/R有mdr1-mRNA表达(图2)，提示该细胞内已有mdr1基因转录。
M：相对分子质量标准；Pc:阳性对照；Nc：阴性对照；B：对照细胞；A：Ribozyme处理细胞
图2 两组细胞mdr1 RT-PCR比较
3.Pgp水平：流式细胞术证明A549/R有Pgp的存在，提示该细胞在蛋白质水平表达mdr1。
二、mdr1核酶对MDR的逆转效果
1.mdr1 mRNA：由图2可见，A组mRNA水平明显低于B组。经密度扫描证实，A组mRNA水平下降85%。
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2.Pgp表达：流式细胞术证明A组细胞荧光强度显著低于B组(A组相对荧光强度5.87%，B组相对荧光强度12.24%)，表明A组细胞Pgp含量低于B组，提示Pgp的表达受到极大的阻滞。
3.Pgp功能测试——罗丹明试验：罗丹明流式细胞术结果提示，A组细胞荧光强度显著高于B组(A组相对荧光强度159.95%，B组相对荧光强度70.36%)。罗丹明是Pgp的特异性荧光底物，能被Pgp从细胞内泵出，A组细胞由于Pgp的含量减少，排出罗丹明的功能下降，细胞内罗丹明聚积，故荧光强度明显高于B组。
4.药敏试验：A组和B组细胞的ID50分别为0.001 μg/ml和0.2 μg/ml，即A组细胞对阿霉素的敏感性是B组细胞的200倍，极大地恢复了细胞对阿霉素的敏感性。随着阿霉素浓度的增加，A组细胞的存活率明显下降。
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mdr1基因[3-5]是导致MDR最直接的原因，它编码1 280个氨基酸的Pgp，后者能将细胞内药物泵出，降低胞内药物浓度，增加对药物的抗性 。从分子生物学理解MDR形成过程是：mdr1基因→转录→mdr1 mRNA→翻译→Pgp→泵出胞内抗癌药物→MDR表型。显然，在这一过程的上游阻止其发展效果最好，而传统的MDR逆转剂均在最下游拮抗Pgp，较为被动，效率低，副作用大，难以进入临床。本研究试图用抗mdr1核酶在mRNA水平阻止MDR的形成，提高肺腺癌细胞对抗癌药的敏感性。
核酶由Cech等[6]首次发现。目前，对其结构、功能和生物学特征有了深入了解，正在向应用方向发展[7，8]。其本质是RNA，具有与RNA特异性结合和催化功能，俗称为分子剪刀，与其他反义物比较有如下特征和优势[9]：(1)其作用底物主要是RNA分子；(2)与底物通过碱基互补配对而且有高度特异性；(3)一个分子核酶在切割靶RNA后，可以从杂交链上解脱下来，再对新的RNA进行切割反应，可循环使用，故有较高的效率；(4)有特定的切割位点识别序列，其中GUC为最常见的切割位点；(5)核酶可迅速与底物RNA结合形成高级结构，从而防止了核酸酶的降解，在细胞内比其他反义物稳定。
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切割位点的选择是影响核酶作用效果的关键，它要求切割位点必须是该基因的重要功能区，而且还要考虑到靶RNA的二级结构。此外，核酶具有高效识别和切割RNA链上的GUC位点的特性，在mdr1 mRNA上共有37个比较重要的GUC序列，其中5′非翻译区6个，3′非翻译区3个。我们选择了21号外显子的第880处的GUC为靶位点。它位于mdr1 mRNA前部的翻译编码区，在两个ATP结合区中间，在此位点切断mdr1 mRNA将不能翻译出完整的Pgp，使其丧失泵功能[8]。本实验结果显示，在该位点切割，使得mdr1 mRNA下降80%以上，Pgp表达显著降低，ID50降低了200倍，证明靶位点选择是成功的。
根据靶位点设计相应的核酶序列。由于核酶为RNA，直接将其转入细胞内极易被细胞内RNA酶破坏，因而，我们采用含能转录核酶基因的pHBApr-1 neo/mdr1-rb载体转入细胞内，使其在细胞内转录出切割mdr1 mRNA的核酶。实验结果显示，该核酶在细胞内获得高水平的表达，产生了足够降解mdr1 mRNA的核酶。
, 百拇医药
由于Pgp减少，使瘤细胞不能排除细胞内罗丹明。药敏试验结果显示，A549/R细胞对阿霉素的抗性几乎消失。
作者单位：陈良安(100853 北京，解放军总医院呼吸科)
刘又宁(100853 北京，解放军总医院呼吸科)
参考文献
1.Labroille G, Belloc F, Bilhou NC, et al. Cytometric study of intracellular Pgp expression and reversal of drug resistance. Cytometry, 1998,32：86-94.
2.Petriz J, Garcia LJ. Flow cytometric analysis of P-glycoprotein function using rhodaminel23. Leukemia, 1997,11：1124-1130.
, http://www.100md.com
3.Roninson IB, Abelson HT, Housman DE, et al. Amplification of specific DNA sequence correlates with MDR in Chinese hamster cell. Nature, 1984,309：626-628.
4.Gros P, Neriah YB, Croop JM, et al. Isolation and expression of a complementary DNA that confers multidrug resistance. Nature, 1986,323：728-731.
5.Stein WD. Kinetics of the multidrug transporter (P-glycoprotein) and its reversal. Physiol Rev, 1997,77：545-590.
, 百拇医药
6.Cech T. The chemistry of self-splicing RNA and RNA enzymes. Science, 1987,236：1532-1539.
7.Walter NC, Burke JM. The hairpin ribozyme: structure, assembly and catalysis. Curr Opin Chem Biol, 1998,2：24-30.
8.Branch AD, Klotman PE. Optimizing ribozyme for somatic cell gene therapy. Exp Nephrol, 1998,6：78-83.
9.Bouffard DY, Ohkawa T, Kijima H. Oligonucleotide modulation of multidrug resistance. Eur J Cancer, 1996,32A：1010-1018., http://www.100md.com