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编号:10503545
端粒酶反义RNA对人髓性白血病细胞系HL-60的作用
http://www.100md.com 《第四军医大学学报》 2000年第4期
     刘利 孙秉中 张传山 张惠中 阎严 张方信

    摘 要:目的 探讨抗端粒酶在急性白血病治疗中的意义. 方法 用脂质体介导法将pBBS212-hT R(反义端粒酶RNA真核表达载体)导入人髓性白血病细胞系HL-60中,采用TRAP法测定端粒 酶 活性,细胞生长动力学检测,电镜,DNA片段分析等方法观察其对HL-60细胞的端粒酶活性 、 细胞增殖及细胞凋亡影响. 结果 端粒酶反义RNA能显著抑制HL-60细胞的 端粒酶活性,抑制H L-60细胞的增殖并促进其凋亡. 结论 以端粒酶反义RNA抑制端粒酶活性 是治疗白血病的潜在途径.

    关键词:端粒酶;反义核酸;白血病;基因转染;细胞凋亡

    0 引言

    端粒是真核细胞染色体末端的一种保护性结构. 对维持染色体的完整性及稳定性有重要作用 . 端粒随细胞分裂而进行性缩短,最终导致细胞衰老或凋亡. 端粒酶是一种特殊的由蛋白质 与R NA组成的核糖核蛋白聚合酶,它能以自身的RNA为模板合成端粒,以弥补复制造成的端粒缩 短.端粒酶是恶性肿瘤细胞无限增殖的重要分子基础,其高表达(活化)与急性白血病等恶性 肿瘤的发生密切相关. 端粒酶已成为新的肿瘤标志物及肿瘤治疗的新靶点,端粒酶抑制剂亦 成为治疗肿瘤的新策略. 为探索抗端粒酶在急性白血病治疗中的意义,本研究采用脂质体介 导的基因转染的方法将端粒酶反义RNA导入HL-60细胞,以探讨其对HL-60细胞端粒酶活性 、生长、凋亡、及细胞周期等方面的影响.
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    1 材料和方法

    1.1 材料 ①细胞株: HL-60细胞,由本室保存培养. 人宫颈癌细胞系Hel a细胞,由唐都医院全军骨肿瘤研究所实验室提供. 人包皮成纤维细胞由本院烧伤科实验室提 供;②质粒与 菌种:大肠杆菌JM109由本校病理学教研室提供. pBBS212质粒及pBBS212-hTR(反义端粒酶RN A真核表达载体),由美国Geron Corporation,Villeponteau博士惠赠. 该质粒由一个200 b p含端粒酶RNA模板序列TRC3的反义基因片段插入至pBBS212载体的EcoRI酶切位点而构建 ,在MPSV启动子控制下表达反义hTR[1];③主要试剂:核酸内切酶购自Promeaga公 司. 端粒酶检测试剂盒(Telomerase PCR Elisa Kit)购自宝灵曼公司.脂质体转染试剂盒购 自Gibco公司.

    1.2 方法

    1.2.1 端粒酶反义RNA表达载体转染HL-60细胞 质粒DNA的扩增提取 按常规方 法进行. 把处 于对数生长期的HL-60细胞分为3组分别为:空白对照组;转染空载体pBBS212组(HL-60/pB BS 212);实验组 :转染pBBS212-hTR组(HL-60/pBBS212-hTR). 转染方法按脂质体转染试剂 盒说 明书操作步骤进行.潮霉素(HyR)200 mg.L-1筛选抗性细胞,7~10 d空白对照细胞 全部死亡, 改用150 mg.L-1维持培养2 wk后用于以下实验.
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    1.2.2 HL-60细胞的端粒酶活性检测 ① 细胞端粒酶上清提取 按文献[2,3]方 法进行. Hela细胞端粒酶上清为阳性对照,人包皮成纤维细胞及RNase处理Hela 细胞上清为阴性对照. ②RT-PCR扩增 :引物延伸:取上述提取液2 μL,加反应混合液, 置25℃,30 min,循环一次 ;端粒酶的灭活:94℃,5 min,循环1次;PCR扩增:50 μL反应体系,包括dNTP,Taq 酶、生 物素标记的引物I和引物II,置94℃ 30 s,50℃ 30 s ,72℃ 90 s,循环30次;平衡:置 7 2℃ 10 min. ③ 扩增产物的检测:ELISA法:按试剂盒说明书操作步骤进行. 测定450 nm和 655 nm的吸光度(A)值,根据A=A450-A655计算. PAGE电泳- 银染法: 配制125 g.L-1 的聚丙烯酰胺凝胶, 上样于凝胶孔内,20 V.cm-1电压下电泳6 h.取出凝胶作银染色.
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    1.2.3 细胞生长动力学检测 采用台盼蓝拒染法. 计算活细胞率,绘制细胞生长曲线 .

    活细胞率(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数),1.2.4 细胞凋亡的鉴定 ① 形态学观察 倒置显微镜下观察;透射电 镜观察:1×106个细胞用PBS洗2次,用4 mL.L-1戊二醛固定,锇酸后固定,脱水, 包埋,超 薄切片,醋 酸双氧铀和柠檬酸铅染色,电镜下观察并照相.② 流式细胞仪检测. 收集不同处理的HL-60 细 胞,上机检测. 测定细胞周期,观察G1期,S期,G2期细胞各占百分比. 观察是否存在凋亡 细 胞及所占比例. ③ DNA片段分析:收集约1×107个细胞,提取DNA琼脂糖凝胶电泳,紫外 灯下观察DNA电泳结果,设标准DNA分子量λDNA(EcoRI+HindⅢ)和未处理HL-60细 胞及空载体pBBS212转染的HL-60细胞作对照.

    1.2.5 统计学方法 采用t检验.
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    2 结果

    纯化质粒DNA经紫外分光光度仪测A260/280吸光度,其比值分别为1.82,1.90 . 取少量DNA用EcoRI酶切及20 g.L-1琼脂糖电泳,片段大小与pBBS212的背景资料图 谱完全一 致. 表明该载体纯度好,反义hTR基因仍克隆在pBBS212载体中,可用于细胞的质粒DNA转染.

    2.1 端粒酶反义RNA转染前后HL-60细胞的端粒酶活性改变 TRA P-ELISA法结果显示. 转染前HL-60细胞表达高水平的端粒酶活性,吸光度A 值为3.016 ,而转染后HL-60细胞端粒酶活性,吸光度A值仅为0.315. TRAP-PAGE电泳 -银染法结果显示转染前HL-60细胞出现多条间隔6 bp的特征性阶梯性条带,而转染后HL- 60细胞仅出现1~2条阶梯性条带,与ELISA方法检测的结果相符(Fig 1).t51901.gif (15219 字节)
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    图 1 TRAP-PAGE法检测端粒酶活性结果

    Fig 1 Detection of activity by TRAP-PAGE

    1.Marker; 2.HL-60 cells; 3.HL-60/pBBS212-hTR cells; 4.HL-60/p BBS212 cells; 5.Hela cells; 6.HL-60 cells treated by RNA enzyme; 7.Fibroblastic cells.

    2.2 端粒酶反义RNA对HL-60细胞生长的影响 HL-60细胞的倍增时间为24~36 h,4 d以内呈对数生长,5 d以后死亡细胞逐渐增多 ,活细胞数下降.而HL-60/pBBS212-hTR细胞培养后48 h即可出现端粒酶反义RNA对其明显 的持续的 抑制作用,与HL-60/pBBS212,HL-60细胞相比有显著差异(P<0.05). 细胞倍增时 间延长至60~72 h(Fig 2).
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    2.3 端粒酶反义RNA对HL-60细胞的促凋亡作用 ①形态学观察:光镜下观察HL-60/pBBS2 12-hTR细胞大部分形态正常与亲本HL-60 细胞形态上无显著差别,但细胞生长缓慢,有一 些 死细胞漂浮并可见有的细胞体积缩小,染色质浓缩,密度增高呈粗颗粒状浓集于核膜周围, 胞质出现颗粒样物质,空载体pBBS212转染的HL-60 细胞(pBBS212/HL-60)与亲本HL-60 细 胞形态上无显著差别. 电镜下观察HL-60/pBBS212-hTR细胞可见轮廓清楚,质地致密的染 色质 团块并边集,细胞骨架崩解,形成膜包裹的致密的凋亡小体. ②流式细胞仪检测结果:检测 出 HL-60/ pBBS212-hTR细胞在G1期前有一亚二倍体的凋亡峰,凋亡细胞占全部检测细胞的15 .8% ,G1 期细胞数明显高于对照组,且S期细胞数明显减少. 而对照组未出现凋亡峰. ③DNA片段分析结果:紫外灯下观察,HL-60/pBBS212-hTR细胞DNA出现典型的梯状电泳条 带.而对照组未出现典型的梯状电泳条带(Fig 3).t52001.gif (2286 字节)
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    图 2 转染端粒酶反义RNA对HL-60细胞增殖的影响

    Fig 2 The effect of telomerase antisense RNA on HL-60 cells

    aP<0.05 vs HL-6o; aP<0.05 vs HL-6o/pBBS212t52002.gif (3948 字节)

    图 3 DNA片段分析结果

    Fig 3 Agarose gel electrophorosis of DNA

    1.Marker; 2.HL-60 cells; 3.HL-60/pBBS212 cells; 4.HL-60/pBBS212- hTR cells
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    3 讨论

    大量的研究表明,绝大多数的肿瘤组织和肿瘤细胞表达端粒酶活性,而在绝大多数正常 细胞中却检测不到端粒酶活性,端粒酶的活化与癌症的发生密切相关,通过抑制端粒酶活性 来抑制肿瘤的生长是肿瘤治疗的新策略. 有研究报道,端粒酶RNA的反义核酸、肽核酸(PNA) 及二脂类可以抑制端粒酶活性,从而抑制肿瘤细胞的增殖. Greider等[4]早就发现 ,将与四膜虫端粒酶RNA互补的寡核苷酸加入其提取液中,能使四膜虫的端粒酶失活. Feng 等[1]及Kan azwa等[5]针对hTR(人端粒酶RNA)设计反义hTR及核酶(teloRZ),构建真核表达载体 ,分别转 染Hela细胞及HepG2/Huh-7肝癌细胞,均观察到它们对端粒酶活性的抑制作用. 白血病细胞 株和白血病原代细胞中,端粒酶活性普遍高表达[6,7]. 为探索抗端粒酶对急性白 血病治疗 的意义,我们研究了反义RNA对端粒酶活性的影响.结果发现,转染前HL-60细胞表达高水平 的端粒酶活性,吸光度A值为3.016 ,而转染后HL-60细胞端粒酶活性降低,吸光度A 值 仅为0.315,表明端粒酶反义RNA能够有效地封闭或抑制端粒酶活性.细胞生长动力学显示端 粒酶反 义RNA能够明显地抑制细胞增殖,延长细胞倍增时间;HL-60/pBBS212-hTR细胞FCM分析, 发 现 G1期前有亚二倍体峰出现,占15.8%.而在未转染及转染空载体的对照组细胞中无此亚G1 峰出现;电镜同步观察可见部分HL-60/pBBS212-hTR细胞出现染色质边集或形成凋亡小体 ;D NA片段分析可见典型的梯状电泳条带;而其他对照组细胞未见上述变化. 表明应用反义hTR 封 闭合成端粒的模板,除了抑制端粒酶活性外,还可以抑制肿瘤细胞的增殖,诱导白血病细胞 的程序化死亡. 抗端粒酶治疗可以避免对缺乏端粒酶活性的正常体细胞产生副作用. 另外由 于原始干细胞端粒酶活性低于其子代细胞,故对端粒酶的靶向治疗可能对干细胞的抑制作用 较低. 由此可见,抗端粒酶治疗在白血病的治疗中将具有潜在的应用前景.
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    作者简介:刘利(1966-),男(汉族), 吉林省集安市人. 博士 ,发表论文10篇.

    Tel.(029)3577151(H);(029)3375579(O)

    刘利(第四军医大学:西京医院血液科,陕西 西安 710033,第四军医大学)

    孙秉中(第四军医大学:西京医院血液科,陕西 西安 710033,第四军医大学)

    张传山(第四军医大学基础部病理学教研室,陕西 西安 710033,第四军医大学)

    张惠中(唐都医院全军骨肿瘤研究所)

    阎严(唐都医院基础部微生物教研室)

    张方信(兰州军区总医 院消化科)
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    参考文献:

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    [2] Kim NW,Mieczyslaw A,Pialyszek MA et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J]. Science,1994;266(5193):2011-2015.

    [3] Piatyszek MA, Kim NW, Weinrich SL et al. Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocal (TRAP)[J]. Method Cell Science,199 5;17(1):1-15.
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    [4] Greider CW, Blacburn EH. A telomere sequence in the RNA of tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis[J]. Nature,1989;337(6205):331-337.

    [5] Kanazwa Y, Ohkawak, Ueda K. Hammerhead ribozyme-mediated inhibition of telomerase activity in extracts of human hepatocellul ar carcinoma[J]. Biochem Biophy Res Com,1996;225(2):570-576.

    [6] Seol JG, Kim ES, Park WH et al. Telomerase activity in acu te myelogenous leukemia : clinical and biological implications[J]. Br J Hematol,1998;100(1):156-165.

    [7] Ohyashiki JH, Ohyashiki K, Iwama H et al. Clinical implica tions of telomerase activity levels in acute leukemia[J]. Clin Ca ncer Res,1997;3(4):619-625., 百拇医药