多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体
多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体
苏明权 于文彬 马越云 谭庆荣 范金水 丁振若
摘 要:目的 建立脑膜炎多重PCR检测系统，以在一次扩增中快速、特异地同时检出新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌，用于脑膜炎病原体感染的快速诊断. 方法 根据新型隐球菌URA保守序列、脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列、结 核分枝杆菌基因组中的IS986插入基因序列片段，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用多重PCR技术，同时检出脑脊液中的新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌. 结果 应用多重P CR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；多重PCR扩增的预期结果为：单一菌感染出现一条特异性扩增区带；混合感染应出现2条或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对15份已明确诊断的脑脊液标本，分别采用常规PCR和多重PCR进行同步扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100%. 对20例临床脑脊液标本的PCR扩增结果分别为：新型隐球菌15%(3/20)、结核杆菌25%(5/20) 、脑膜炎双球菌10%(2/20). 结论 多重PCR有效地为临床病原体的混合感染 ，以及原因不明的脑膜炎患者的快速诊断，提供了快速、准确的诊断手段. 有效地减少了脑膜炎的误诊和漏诊，更提高了检验效率.
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关键词：多重PCR；新型隐球菌；结核杆菌；脑膜炎双球菌
0 引言
长期以来，对脑膜炎的实验诊断一直采用直接涂片找病原体、分离培养及免疫学等传统 的方法，由于传统的方法费时费力，敏感性和准确性受多种客观因素的影响，达不到快速、 准确诊断的目的. 尤其是对多种病原体混合感染的诊断易出现误诊，得不到及时的诊断和治 疗，严重危机患者的生命. 因此，寻找一种更加灵敏、快速、特异的脑膜炎实验诊断的方法 是关 键. 我们以脑膜炎感染最常见、发病率较高的新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌的基因 组中特定片段为目的基因建立一脑膜炎多重PCR检测系统，可在一次扩增中快速、特异地同 时检出新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌，并用于临床脑膜炎病原体感染的检测.
1 材料和方法
1.1 材料 新型隐球菌,人型结核杆菌，为本室保存菌株，脑膜炎双球菌A(29018) ,B(29021),C(29025),D(29006)，由中国药品生物制品检定所菌种保藏中心提供. 15份临床已确诊的脑膜炎患者脑脊液(其中脑膜炎双球菌性脑膜炎3例；新型隐球 菌性脑膜炎5例；结核性脑膜炎7例)由第四军医大学西京医院神经内科脑脊液细胞库提供. 2 0例未确诊原因不明的脑膜炎患者脑脊液标本，来自我院门诊及住院患者.
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1.2 方法 新型隐球菌(CN)特异性引物的设计[1]，根据gol dke Y数据库中的新型隐球 菌全基因序列分析，选取URA保守序列而设计，扩增片段为426 bp，引物序列为：CN1 5′- T AC TGC TAC AAC AGG AAG G-3′CN2 5′-TAA GAC CTC TGA ACA CCG-3′;脑膜炎双球 菌(NM)的特 异性引物的设计，根据脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列而设计，扩增片 段为858 bp,引物序列为：NM1 5′-TGA CGC TTC GAT ACG CTC TGT TTC G-3′ NM2 5′- CAG GTT TGA CAT AGT CGG-3′;结核杆菌(TB)特异性引物的设计，根据结核分枝杆菌基因组中的IS 98 6插入基因序列片段而设计，扩增片段为245 bp，引物序列为：TB1 5′-CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC-3′TB2 5′-GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA-3′,以上引物经相关计算机软件 分析后，由上海生工生物工程公司合成，PAGE法纯化. 模板DNA的制备：取脑脊液0.5～1 mL，12 000 g离心15 min，去上清，沉淀中加碱性裂 解液(2 mmol.L-1 NaOH,10 g.L-1 NP-40,10 g.L-1 Triton X-100 ,10 g.L-1 Tween 20)100 μL，98℃水浴15 min，600 g离心5 min ,取上清做模板. PCR反应总体积为50 μL，包括10 mmol.L-1 Tris-HCl(pH 8.3),5 0 mmol.L-1 KCl,2.5 μmol.L-1 MgCl2,200 μmol.L-1 4×dNTP ，寡 聚核苷酸引物各100 pmol,Taq DNA聚合酶3单位，10 μL模板DNA，无菌去离子水补足总 反应 体积，用无菌石蜡油覆盖液面，进入PCR循环. 循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 1 min,5 5℃ 1 min,72℃ 1 min,32次循环，最后72℃延伸5 min. 进行琼脂糖凝胶电泳观察结果. 如 进一步 鉴定，可用低溶点琼脂糖凝胶电泳法回收阳性扩增产物，以限制性内切酶进行酶切分析. 在上述PCR反应体系中，同时加入3对(新型隐球菌、结 核杆菌、脑膜炎双球菌)寡聚核苷酸引物，不加模板DNA，以CN,TB,NM混合物为阳性对照， 同上条件扩增及产物检测. 对35份脑脊液，按上述方法分别制备模板DNA，PCR扩增及产物鉴定， 同时设阴性、阳性对照.
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2 结果
2.1 寡聚核苷酸引物的相关性 3对特异性引物按所需扩增浓度混合后，加入上 述 PCR扩增体系中进行PCR扩增，结果未出现任何扩增区带，而阳性对照出现3条特异性扩增区 带. 表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果.
2.2 多重PCR扩增体系的预期结果 多重PCR扩增的预期结 果为：单一菌感染出现一条特异性 扩增区带；混合感染应出现2条或3条特异性扩增区带. 我们应用上述PCR反应体系，对单一 菌株及混合菌株进行模板制备和PCR扩增，达到预期的扩增结果(Fig 1).
图 1 多重PCR扩增结果
Fig 1 Restriction of multiple polymerase chain reaction
1:PCR Marker; 2:NM; 3:CN; 4:TB; 5:NM+CN: 6,8;NM+TB; 7:CN+TB; 9:NM+CN+TB.
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2.3 确诊脑脊液标本的PCR扩增 对15份已明确为 诊断的脑脊液标本，分别采用常 规PCR和多重PCR进行同步扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达10 0%.
2.4 临床脑脊液标本的PCR扩增 应用本PCR扩增体系，分别对20 例临床确诊不明的 脑脊液标本进行PCR扩增，结果：3例出现426 bp特异性扩增区带；2例出现858 bp的特异性 扩增区带；5例出现245 bp的特异性扩增区带，尚未见出现2条或3条特异性扩增区带者.
3 讨论
脑膜炎是人类致死率较高的感染性疾病之一[2,3]. 其发病最高、感染机会最 多的为：结核 分枝杆菌引起的结核性脑膜炎、脑膜炎双球菌引起的流行性脑脊髓膜炎、新型隐球菌引起的 隐球菌性脑膜炎. 本研究根据goldkeY数据库中的新型隐球菌全基因序列分析，选取URA保守 序 列;脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列;结核分枝杆菌基因组中的IS986插入 基因序列片段，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，经计算机分析和模拟杂交，符合特 异性实验设计要求.
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多重PCR技术是在常规PCR技术的基础上改进和发展起来的一种新的PCR扩增技术[ 4]. 可在 同一PCR反应体系内加入多对特异性引物，一次扩增多个DNA片段，从而实现多种病原体DNA 的同时快速鉴定. 常规PCR一次只能检出一种病原体，对混合病原体引起的临床感染就无能 为力，而且操作繁琐费时，成本又高. 多重PCR有效地为临床病原体的混合感染，以及原因 不明的脑膜炎患者的快速诊断，提供了快速、准确的诊断手段. 有效地减少了脑膜炎的误诊 和漏诊，更提高了检验效率.
多重PCR技术并非简单地将多对特异性引物混合在同一PCR反应体系内就可以进行P CR扩 增，因反应体系中含有多对特异性寡聚核苷酸引物，对引物的设计和选择比常规PCR反应更 为严格，必须充分考虑到各引物间的相关性和合理性，如果引物对间形成粘性末端或部分双 链，就会导致实验失败或假阳性结果. 同样也必须排除PCR扩增产物产物间可能发生的错配 ，以及反应体系中各成分的使用量、比例、反应条件的优化等问题. 均有待于在大量的临床 应用中进一步考核验证.
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基金项目：陕西省科技发展研究计划资助项目(1997K12)
作者简介：苏明权(1959-),男(汉族)，河北省平山县人. 主管技师，获 军队科技成果二等奖2项，三等奖3项，发表论文20篇. Tel.(029)3375572 Email.sumq@163 .net
苏明权(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
于文彬(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
马越云(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
范金水(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
丁振若(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
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谭庆荣(第四军医大学西京医院:神经内科，陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] 苏明权, 马越云, 谭庆荣et al. 新型隐球菌聚合酶链反应的检 测方法[J]. 第四军医大学学报,1997;18(4):336-338.
[2] 王默力, 刘宏迪, 巍岗之et al. 聚合酶链反应在结核性脑膜炎病原体 检测中的应用研究[J].中华神经精神学杂志,1993;26(4):232-234.
[3] 刘长云, 童详华, 苗乃法et al. 聚合酶链反应检测脑膜炎奈瑟氏菌DNA 片段[J].中华医学检验杂志，1996;19(2):109-110.
[4] Van Den Brule AJ, Meijer CJ,Bakels V et al. Rapid detect ion of HPV in cervical scrapes by combined general primer medrated and type-spe cific PCR[J]. J Clin Microbiol, 1990;28(3):2739-2741., 百拇医药
苏明权 于文彬 马越云 谭庆荣 范金水 丁振若
摘 要:目的 建立脑膜炎多重PCR检测系统，以在一次扩增中快速、特异地同时检出新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌，用于脑膜炎病原体感染的快速诊断. 方法 根据新型隐球菌URA保守序列、脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列、结 核分枝杆菌基因组中的IS986插入基因序列片段，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用多重PCR技术，同时检出脑脊液中的新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌. 结果 应用多重P CR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；多重PCR扩增的预期结果为：单一菌感染出现一条特异性扩增区带；混合感染应出现2条或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对15份已明确诊断的脑脊液标本，分别采用常规PCR和多重PCR进行同步扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100%. 对20例临床脑脊液标本的PCR扩增结果分别为：新型隐球菌15%(3/20)、结核杆菌25%(5/20) 、脑膜炎双球菌10%(2/20). 结论 多重PCR有效地为临床病原体的混合感染 ，以及原因不明的脑膜炎患者的快速诊断，提供了快速、准确的诊断手段. 有效地减少了脑膜炎的误诊和漏诊，更提高了检验效率.
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关键词：多重PCR；新型隐球菌；结核杆菌；脑膜炎双球菌
0 引言
长期以来，对脑膜炎的实验诊断一直采用直接涂片找病原体、分离培养及免疫学等传统 的方法，由于传统的方法费时费力，敏感性和准确性受多种客观因素的影响，达不到快速、 准确诊断的目的. 尤其是对多种病原体混合感染的诊断易出现误诊，得不到及时的诊断和治 疗，严重危机患者的生命. 因此，寻找一种更加灵敏、快速、特异的脑膜炎实验诊断的方法 是关 键. 我们以脑膜炎感染最常见、发病率较高的新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌的基因 组中特定片段为目的基因建立一脑膜炎多重PCR检测系统，可在一次扩增中快速、特异地同 时检出新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌，并用于临床脑膜炎病原体感染的检测.
1 材料和方法
1.1 材料 新型隐球菌,人型结核杆菌，为本室保存菌株，脑膜炎双球菌A(29018) ,B(29021),C(29025),D(29006)，由中国药品生物制品检定所菌种保藏中心提供. 15份临床已确诊的脑膜炎患者脑脊液(其中脑膜炎双球菌性脑膜炎3例；新型隐球 菌性脑膜炎5例；结核性脑膜炎7例)由第四军医大学西京医院神经内科脑脊液细胞库提供. 2 0例未确诊原因不明的脑膜炎患者脑脊液标本，来自我院门诊及住院患者.
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1.2 方法 新型隐球菌(CN)特异性引物的设计[1]，根据gol dke Y数据库中的新型隐球 菌全基因序列分析，选取URA保守序列而设计，扩增片段为426 bp，引物序列为：CN1 5′- T AC TGC TAC AAC AGG AAG G-3′CN2 5′-TAA GAC CTC TGA ACA CCG-3′;脑膜炎双球 菌(NM)的特 异性引物的设计，根据脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列而设计，扩增片 段为858 bp,引物序列为：NM1 5′-TGA CGC TTC GAT ACG CTC TGT TTC G-3′ NM2 5′- CAG GTT TGA CAT AGT CGG-3′;结核杆菌(TB)特异性引物的设计，根据结核分枝杆菌基因组中的IS 98 6插入基因序列片段而设计，扩增片段为245 bp，引物序列为：TB1 5′-CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC-3′TB2 5′-GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA-3′,以上引物经相关计算机软件 分析后，由上海生工生物工程公司合成，PAGE法纯化. 模板DNA的制备：取脑脊液0.5～1 mL，12 000 g离心15 min，去上清，沉淀中加碱性裂 解液(2 mmol.L-1 NaOH,10 g.L-1 NP-40,10 g.L-1 Triton X-100 ,10 g.L-1 Tween 20)100 μL，98℃水浴15 min，600 g离心5 min ,取上清做模板. PCR反应总体积为50 μL，包括10 mmol.L-1 Tris-HCl(pH 8.3),5 0 mmol.L-1 KCl,2.5 μmol.L-1 MgCl2,200 μmol.L-1 4×dNTP ，寡 聚核苷酸引物各100 pmol,Taq DNA聚合酶3单位，10 μL模板DNA，无菌去离子水补足总 反应 体积，用无菌石蜡油覆盖液面，进入PCR循环. 循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 1 min,5 5℃ 1 min,72℃ 1 min,32次循环，最后72℃延伸5 min. 进行琼脂糖凝胶电泳观察结果. 如 进一步 鉴定，可用低溶点琼脂糖凝胶电泳法回收阳性扩增产物，以限制性内切酶进行酶切分析. 在上述PCR反应体系中，同时加入3对(新型隐球菌、结 核杆菌、脑膜炎双球菌)寡聚核苷酸引物，不加模板DNA，以CN,TB,NM混合物为阳性对照， 同上条件扩增及产物检测. 对35份脑脊液，按上述方法分别制备模板DNA，PCR扩增及产物鉴定， 同时设阴性、阳性对照.
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2 结果
2.1 寡聚核苷酸引物的相关性 3对特异性引物按所需扩增浓度混合后，加入上 述 PCR扩增体系中进行PCR扩增，结果未出现任何扩增区带，而阳性对照出现3条特异性扩增区 带. 表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果.
2.2 多重PCR扩增体系的预期结果 多重PCR扩增的预期结 果为：单一菌感染出现一条特异性 扩增区带；混合感染应出现2条或3条特异性扩增区带. 我们应用上述PCR反应体系，对单一 菌株及混合菌株进行模板制备和PCR扩增，达到预期的扩增结果(Fig 1).
图 1 多重PCR扩增结果
Fig 1 Restriction of multiple polymerase chain reaction
1:PCR Marker; 2:NM; 3:CN; 4:TB; 5:NM+CN: 6,8;NM+TB; 7:CN+TB; 9:NM+CN+TB.
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2.3 确诊脑脊液标本的PCR扩增 对15份已明确为 诊断的脑脊液标本，分别采用常 规PCR和多重PCR进行同步扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达10 0%.
2.4 临床脑脊液标本的PCR扩增 应用本PCR扩增体系，分别对20 例临床确诊不明的 脑脊液标本进行PCR扩增，结果：3例出现426 bp特异性扩增区带；2例出现858 bp的特异性 扩增区带；5例出现245 bp的特异性扩增区带，尚未见出现2条或3条特异性扩增区带者.
3 讨论
脑膜炎是人类致死率较高的感染性疾病之一[2,3]. 其发病最高、感染机会最 多的为：结核 分枝杆菌引起的结核性脑膜炎、脑膜炎双球菌引起的流行性脑脊髓膜炎、新型隐球菌引起的 隐球菌性脑膜炎. 本研究根据goldkeY数据库中的新型隐球菌全基因序列分析，选取URA保守 序 列;脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列;结核分枝杆菌基因组中的IS986插入 基因序列片段，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，经计算机分析和模拟杂交，符合特 异性实验设计要求.
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多重PCR技术是在常规PCR技术的基础上改进和发展起来的一种新的PCR扩增技术[ 4]. 可在 同一PCR反应体系内加入多对特异性引物，一次扩增多个DNA片段，从而实现多种病原体DNA 的同时快速鉴定. 常规PCR一次只能检出一种病原体，对混合病原体引起的临床感染就无能 为力，而且操作繁琐费时，成本又高. 多重PCR有效地为临床病原体的混合感染，以及原因 不明的脑膜炎患者的快速诊断，提供了快速、准确的诊断手段. 有效地减少了脑膜炎的误诊 和漏诊，更提高了检验效率.
多重PCR技术并非简单地将多对特异性引物混合在同一PCR反应体系内就可以进行P CR扩 增，因反应体系中含有多对特异性寡聚核苷酸引物，对引物的设计和选择比常规PCR反应更 为严格，必须充分考虑到各引物间的相关性和合理性，如果引物对间形成粘性末端或部分双 链，就会导致实验失败或假阳性结果. 同样也必须排除PCR扩增产物产物间可能发生的错配 ，以及反应体系中各成分的使用量、比例、反应条件的优化等问题. 均有待于在大量的临床 应用中进一步考核验证.
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基金项目：陕西省科技发展研究计划资助项目(1997K12)
作者简介：苏明权(1959-),男(汉族)，河北省平山县人. 主管技师，获 军队科技成果二等奖2项，三等奖3项，发表论文20篇. Tel.(029)3375572 Email.sumq@163 .net
苏明权(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
于文彬(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
马越云(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
范金水(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
丁振若(第四军医大学西京医院:检验科，陕西 西安 710033)
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谭庆荣(第四军医大学西京医院:神经内科，陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] 苏明权, 马越云, 谭庆荣et al. 新型隐球菌聚合酶链反应的检 测方法[J]. 第四军医大学学报,1997;18(4):336-338.
[2] 王默力, 刘宏迪, 巍岗之et al. 聚合酶链反应在结核性脑膜炎病原体 检测中的应用研究[J].中华神经精神学杂志,1993;26(4):232-234.
[3] 刘长云, 童详华, 苗乃法et al. 聚合酶链反应检测脑膜炎奈瑟氏菌DNA 片段[J].中华医学检验杂志，1996;19(2):109-110.
[4] Van Den Brule AJ, Meijer CJ,Bakels V et al. Rapid detect ion of HPV in cervical scrapes by combined general primer medrated and type-spe cific PCR[J]. J Clin Microbiol, 1990;28(3):2739-2741., 百拇医药