风湿性二尖瓣关闭不全患者血清胶原末端肽前体的变化意义
风湿性二尖瓣关闭不全患者血清胶原末端肽前体的变化意义
张近宝 刘维永 任崇雷 卢保弼
摘 要： 目的 探讨检测风心病患者血清中Ⅰ,Ⅲ型前胶原PCⅠ, PCⅢ含量作为临 床判断风心病 心肌纤维化程度时血清标志物的价值. 方法 用放射免疫法检测患者血清 中PCⅠ, PCⅢ含量 , 用免疫组化法检测患者心肌中Ⅰ,Ⅲ型胶原表达量， 并将二者进行相关性分析. 结果 风湿 性二尖瓣关闭不全患者血清中PCⅠ,PCⅢ含量较正常对照明显升高， 且与心肌中Ⅰ,Ⅲ型胶 原 表达量呈正相关. 结论 用放射免疫法测定血清中Ⅰ,Ⅲ型胶原前体水平， 能较好反应心肌纤维化程度.
关键词：风湿性心脏病；胶原；胶原前体
, http://www.100md.com
0 引言
目前临床上对于心肌纤维化病变程度的判断.仅能通过心肌活检进行. 而取材困难、取 材部位受限和潜在危险性，使其应用受到很大限制. 近年报道,血清中Ⅰ,Ⅲ型前胶原羧端肽 (PIP, PⅢP)，能在扩张型心肌病和高血压心脏病中较好反应心肌中Ⅰ,Ⅲ型胶原的合成状态 [1,2]. 在风心病中的改变未见报道. 而Ⅰ,Ⅲ型前胶原(PCⅠ,PCⅢ)分别是PIP,PⅢ P的前 体物质,因而也能较好反映Ⅰ,Ⅲ型胶原的合成[3，4]. 为使临床上对风心病心 肌病变，特别 是心肌纤维化程度有较为客观的评估指标而设计了本实验，旨在探讨检测血清中Ⅰ，Ⅲ型胶 原前体(PCⅠ，PCⅢ)作为临床风心病心肌纤维化时血清标志物的价值.
1 材料和方法
1.1 材料 实验组：风湿性二尖瓣关闭不全为主组(瓣口面积>1.5 cm2， 血流量>6 mL, n=12) 选自本院1998-09-12确诊并经病理诊断证实除外合并二尖瓣狭窄(瓣口面积<1.2 cm2， 返 流量<3 mL)及主动脉瓣病变者，其中男5例，女7例，年龄23～56 (38.3±12.6)岁；心功 能 Ⅱ级2例，Ⅲ级7例，Ⅳ级3例；病史1～22 (12.5±8.3) a. 对照组：选取健康成人20(男1 0，女10)例，年龄25～58 (40.5±12.6)岁，作正常人对照. 主要试剂: PCI，PCⅢ放免试 剂盒购于重庆肿瘤研究所，ColⅠ，Ⅲ型胶原单抗购于北京中山生物公司. 血清学标本：实 验组及对照组均为晨起空腹静脉血3 mL. 血液标本分别经760 r.min-1离心15 min， 分离出血清 ，将血清放置于-20℃密闭冰箱中待检. 心肌标本：实验组均在手术中取左室乳头肌标本， 标本离体后迅速用40 mL.L-1多聚甲醛固定4～6 min，常规石蜡包埋，连续切片厚4 μm，作HE，Masson染色及免疫组化检测.
, 百拇医药
1.2 方法 放射免疫法测血清中PCI，PCⅢ含量，按试剂盒 中说明书进行操作. 用微机控制 的自动γ计数仪测定得出B值，以标准浓度为横坐标，相应结合率为纵坐标，用3/2次方程拟 合标准曲线，通过样品B值得到测定浓度. HE，Masson染色及免疫组化步骤按常规方法进行 . 免疫组化以PBS替代一抗为阴性对照，抗5-HT多抗替代一抗为替代对照. 免疫组化阳性结 果为棕黄色颗粒，定位于胞质及间质. 免疫组化图像输入自动图像分析仪，每张切片按随机 数字法选取6个视野，按光密度法计算ColⅠ，Ⅲ型胶原蛋白半定量值.
统计学方法：数据以均数±标准差(X±s)表示，采用我校SPLM统计程序包 进行单因素方差分析及t检验，部分资料进行相关性分析.
2 结果
2.1 血清PCI，PCⅢ含量 放射免疫法测得病变组与正常人血清中PCⅠ : (61±21) μg.L-1, (50±17) μg.L-1; PCⅢ: (130±40) μg.L-1 , (70±16) μg.L-1，两组相差显著(P<0.05). 结果提示风心病患者血清中 PCI，PCⅢ含量明显高于正常对照组.
, 百拇医药
b 心肌纤维化与血清PCI，PCⅢ含量的相关性 将用Masson染色(Fig 1)测得的病变组心肌纤 维化面积与血清学中PCⅠ,PCⅢ含量进行对比, 结果提示血清PCI，PCⅢ的含量与心肌间质纤 维化呈明显正相关，即表明PCI，PCⅢ可在一定程度上直接反映间质胶原网络改建(Tab 1).
表1 心肌纤维正面积与血清中前胶原含量对比
Tab 1 Myocardial fibrosis area vs serum precollagen contents
Item
n1
n2
n3
, 百拇医药
n4
n5
n6
n7
n8
n9
n10
X±s
A(fibrosis)/mm2
27.9
30.6
, 百拇医药
1 8.1
21.9
33.4
18.4
34.3
40.1
16.8
22.4
26.4± 8.0
ρ(precollagen)/(μg.L-1)
232
241
, 百拇医药
210
198
229
180
215
260
129
217
211 ±86
2.3 免疫组化及与血清学的相关性 免疫组化结果显示：病变组心肌中Ⅰ,Ⅲ 型胶原蛋白的 表达量均较正常人明显增强(Fig 2). 而血清学检测结果也提示PCI,PCⅢ含量较正常人有明 显 升高. 将病变组血清中PCI,PCⅢ含量与心肌中I,Ⅲ型胶原蛋白表达强度进行对比及相关性分 析,PCI,PCⅢ含量与I, Ⅲ型胶原表达量相关系数分别为r=0.88和0.78， P<0.00 1. 结果表明心肌组织中的胶原表达强度与血清学中PCI,PCⅢ含量有较好的相关性(Tab 2) .
, 百拇医药
图1 风心病心肌间质纤维增生，血管内膜增生，管壁增厚，管腔狭窄
Fig 1 Myocardium interstitium hyperplasia markedly and the degree of fibrosis and vascular wall thickness with lumen stenosis (immunhistochemical 3.3×4 .0)
图2 病理组心肌中Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白的表达量均较正常人明显增强
Fig 2 The expression of Ⅰ, Ⅲ types collagen protein were significantly higher in the pathology myocardium than the normal
A: The expression of types Ⅰ collagen was weak in normal myocardium; B: The positive expression of type Ⅰ collagen upregulation; C: The expression of types Ⅲ collagen was wea k in normal myocardium; D: The positive expression of type Ⅲ collagen upregulation (immunhistoch emical 3.3×4.0).
, 百拇医药
表2 心肌中Ⅰ，Ⅲ型胶原表达量与血清中前胶原含量对比
Tab 2 Myocardial collagen Ⅰ,Ⅲ expressions vs serum precollagen contents
ρ/(μg.L-1)
n1
n2
n3
n4
n 5
n6
, http://www.100md.com
n7
n8
n9
n10
X±s
Col Ⅰ
154
137
94
102
70
89
, 百拇医药
1 11
118
142
99
112±26
Col Ⅲ
96
80
67
69
54
61
76
, 百拇医药
82
79
73
73 ±11
PC Ⅰ
87
70
64
75
54
60
69
74
, http://www.100md.com 91
63
71±1 1
PC Ⅲ
178
167
114
127
98
73
107
143
154
, 百拇医药 79
124±36
3 讨论
风心病心肌纤维化程度直接影响手术疗效[5，6]，故对心肌纤维化程度的判 断可指导 手术时机选择及对预后的判断. 本结果表明风湿性二尖瓣关闭不全患者血清中PCI,PCⅢ的含 量明显高于正常人. 在这组风心病患者心肌中胶原阳性表达与血清学中的PCI,PCⅢ含量有较 好相关性，表明血清学的检测PCI,PCⅢ可在一定程度上反映心肌中间质胶原网络的改建.
风心病心肌中胶原表达量和外周血液中PCI，PCⅢ两者有着较好的相关性，主要是由于 前胶原在细胞内合成后分泌到细胞外，其氨基末端和羧基末端都附有肽端，在特殊肽链内切 酶的作用下，使这些肽段脱离前胶原以游离片断出现于外周血中，并随胶原纤维合成的活跃 而增多[7，8]. 故检测前胶原末端肽的前体PCI，PCⅢ能较好反应胶原合成状态， 直接明确 心肌间质纤维化程度，使其在临床风心病术前判断病情上有较好应用前景. 本结果表明放免 方法测定血清中Ⅰ,Ⅲ型胶原前体水平，能较好反应心肌纤维化程度，作为评价慢性风心病 心肌间质胶原增生程度，是一个较为合理和有实用前景的临床指标.
, 百拇医药
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870790)
作者简介：张近宝(1964-)， 男(汉族)， 黑龙江省齐齐哈尔 市人. 博士, 主治医师, 讲师.
Tel.(029)3375312 Email.zjbwyw@fmmu.edu.cn
张近宝(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
任崇雷(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
卢保弼(检验科，陕西 西安 710033)
参考文献：
, http://www.100md.com
[1] Klappacher G, Franzen P, Haab D et al. Measuring extracell ular matrix turnover i n the serum of patients with idiopathic or ischemic dilated cardiomyopathy and i mpact on diagnosis and prognosis [J]. Am J Cardiol, 1995;75(14):913-918.
[2] Diez J, Laviades C, Mayor G et al. Increased serum concentration of procolla gen peptides in essential hypertension. Relation to cardiac alterations [J]. Circulation, 1995;91(5):1450-1454.
, 百拇医药 [3] Galambos MR, Collins DC, Galambos JT. A radioimmunoassay procedure f or type Ⅲ procollagen: Its use in the detection of hepatic fibrosis [J]. Hepatol,1 985;5(1):38-42.
[4] 刘兴明，林 丁，李伟道et al. 人I型前胶原放射免疫分析法的研究[J ]. 中华核医学杂志，1997;17(5):247-248.
[5] Chevalier B, Callens-el-Amrani F, Heymes C et al. Molecular ba si s of regression of cardiac hypertrophy [J]. Am J Cardiol, 1994;73(10):11C- 17C.
[6] Weber KT, Brilla CG, Janicki JS et al. Myocardial fibrosis: Func tio nal signficance and regulatory factors [J].Cardiovasc Res,1993;271(3):341- 348.
, 百拇医药
[7] Pedersen BJ, Bonder T. Purification of human procollagen I arboxylte rminal pr opeptide elevated as in vivo from procollagen and use to calibrate a radioim munoassay of propeptide [J]. Clin Chem, 1994;40(5):811-816.
[8] Klappacher G, Franzen P, Haab D et al. Measuring extracellular m atrix turnov er in the serum of patients with idiopathic or ischemic dilated cardiomyopathy a nd impact on diagnosis and prognosis [J]. Am J Cardiol, 1995;75(14):913-91 8., 百拇医药
张近宝 刘维永 任崇雷 卢保弼
摘 要： 目的 探讨检测风心病患者血清中Ⅰ,Ⅲ型前胶原PCⅠ, PCⅢ含量作为临 床判断风心病 心肌纤维化程度时血清标志物的价值. 方法 用放射免疫法检测患者血清 中PCⅠ, PCⅢ含量 , 用免疫组化法检测患者心肌中Ⅰ,Ⅲ型胶原表达量， 并将二者进行相关性分析. 结果 风湿 性二尖瓣关闭不全患者血清中PCⅠ,PCⅢ含量较正常对照明显升高， 且与心肌中Ⅰ,Ⅲ型胶 原 表达量呈正相关. 结论 用放射免疫法测定血清中Ⅰ,Ⅲ型胶原前体水平， 能较好反应心肌纤维化程度.
关键词：风湿性心脏病；胶原；胶原前体
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0 引言
目前临床上对于心肌纤维化病变程度的判断.仅能通过心肌活检进行. 而取材困难、取 材部位受限和潜在危险性，使其应用受到很大限制. 近年报道,血清中Ⅰ,Ⅲ型前胶原羧端肽 (PIP, PⅢP)，能在扩张型心肌病和高血压心脏病中较好反应心肌中Ⅰ,Ⅲ型胶原的合成状态 [1,2]. 在风心病中的改变未见报道. 而Ⅰ,Ⅲ型前胶原(PCⅠ,PCⅢ)分别是PIP,PⅢ P的前 体物质,因而也能较好反映Ⅰ,Ⅲ型胶原的合成[3，4]. 为使临床上对风心病心 肌病变，特别 是心肌纤维化程度有较为客观的评估指标而设计了本实验，旨在探讨检测血清中Ⅰ，Ⅲ型胶 原前体(PCⅠ，PCⅢ)作为临床风心病心肌纤维化时血清标志物的价值.
1 材料和方法
1.1 材料 实验组：风湿性二尖瓣关闭不全为主组(瓣口面积>1.5 cm2， 血流量>6 mL, n=12) 选自本院1998-09-12确诊并经病理诊断证实除外合并二尖瓣狭窄(瓣口面积<1.2 cm2， 返 流量<3 mL)及主动脉瓣病变者，其中男5例，女7例，年龄23～56 (38.3±12.6)岁；心功 能 Ⅱ级2例，Ⅲ级7例，Ⅳ级3例；病史1～22 (12.5±8.3) a. 对照组：选取健康成人20(男1 0，女10)例，年龄25～58 (40.5±12.6)岁，作正常人对照. 主要试剂: PCI，PCⅢ放免试 剂盒购于重庆肿瘤研究所，ColⅠ，Ⅲ型胶原单抗购于北京中山生物公司. 血清学标本：实 验组及对照组均为晨起空腹静脉血3 mL. 血液标本分别经760 r.min-1离心15 min， 分离出血清 ，将血清放置于-20℃密闭冰箱中待检. 心肌标本：实验组均在手术中取左室乳头肌标本， 标本离体后迅速用40 mL.L-1多聚甲醛固定4～6 min，常规石蜡包埋，连续切片厚4 μm，作HE，Masson染色及免疫组化检测.
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1.2 方法 放射免疫法测血清中PCI，PCⅢ含量，按试剂盒 中说明书进行操作. 用微机控制 的自动γ计数仪测定得出B值，以标准浓度为横坐标，相应结合率为纵坐标，用3/2次方程拟 合标准曲线，通过样品B值得到测定浓度. HE，Masson染色及免疫组化步骤按常规方法进行 . 免疫组化以PBS替代一抗为阴性对照，抗5-HT多抗替代一抗为替代对照. 免疫组化阳性结 果为棕黄色颗粒，定位于胞质及间质. 免疫组化图像输入自动图像分析仪，每张切片按随机 数字法选取6个视野，按光密度法计算ColⅠ，Ⅲ型胶原蛋白半定量值.
统计学方法：数据以均数±标准差(X±s)表示，采用我校SPLM统计程序包 进行单因素方差分析及t检验，部分资料进行相关性分析.
2 结果
2.1 血清PCI，PCⅢ含量 放射免疫法测得病变组与正常人血清中PCⅠ : (61±21) μg.L-1, (50±17) μg.L-1; PCⅢ: (130±40) μg.L-1 , (70±16) μg.L-1，两组相差显著(P<0.05). 结果提示风心病患者血清中 PCI，PCⅢ含量明显高于正常对照组.
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b 心肌纤维化与血清PCI，PCⅢ含量的相关性 将用Masson染色(Fig 1)测得的病变组心肌纤 维化面积与血清学中PCⅠ,PCⅢ含量进行对比, 结果提示血清PCI，PCⅢ的含量与心肌间质纤 维化呈明显正相关，即表明PCI，PCⅢ可在一定程度上直接反映间质胶原网络改建(Tab 1).
表1 心肌纤维正面积与血清中前胶原含量对比
Tab 1 Myocardial fibrosis area vs serum precollagen contents
Item
n1
n2
n3
, 百拇医药
n4
n5
n6
n7
n8
n9
n10
X±s
A(fibrosis)/mm2
27.9
30.6
, 百拇医药
1 8.1
21.9
33.4
18.4
34.3
40.1
16.8
22.4
26.4± 8.0
ρ(precollagen)/(μg.L-1)
232
241
, 百拇医药
210
198
229
180
215
260
129
217
211 ±86
2.3 免疫组化及与血清学的相关性 免疫组化结果显示：病变组心肌中Ⅰ,Ⅲ 型胶原蛋白的 表达量均较正常人明显增强(Fig 2). 而血清学检测结果也提示PCI,PCⅢ含量较正常人有明 显 升高. 将病变组血清中PCI,PCⅢ含量与心肌中I,Ⅲ型胶原蛋白表达强度进行对比及相关性分 析,PCI,PCⅢ含量与I, Ⅲ型胶原表达量相关系数分别为r=0.88和0.78， P<0.00 1. 结果表明心肌组织中的胶原表达强度与血清学中PCI,PCⅢ含量有较好的相关性(Tab 2) .
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图1 风心病心肌间质纤维增生，血管内膜增生，管壁增厚，管腔狭窄
Fig 1 Myocardium interstitium hyperplasia markedly and the degree of fibrosis and vascular wall thickness with lumen stenosis (immunhistochemical 3.3×4 .0)
图2 病理组心肌中Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白的表达量均较正常人明显增强
Fig 2 The expression of Ⅰ, Ⅲ types collagen protein were significantly higher in the pathology myocardium than the normal
A: The expression of types Ⅰ collagen was weak in normal myocardium; B: The positive expression of type Ⅰ collagen upregulation; C: The expression of types Ⅲ collagen was wea k in normal myocardium; D: The positive expression of type Ⅲ collagen upregulation (immunhistoch emical 3.3×4.0).
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表2 心肌中Ⅰ，Ⅲ型胶原表达量与血清中前胶原含量对比
Tab 2 Myocardial collagen Ⅰ,Ⅲ expressions vs serum precollagen contents
ρ/(μg.L-1)
n1
n2
n3
n4
n 5
n6
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n7
n8
n9
n10
X±s
Col Ⅰ
154
137
94
102
70
89
, 百拇医药
1 11
118
142
99
112±26
Col Ⅲ
96
80
67
69
54
61
76
, 百拇医药
82
79
73
73 ±11
PC Ⅰ
87
70
64
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, http://www.100md.com 91
63
71±1 1
PC Ⅲ
178
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114
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98
73
107
143
154
, 百拇医药 79
124±36
3 讨论
风心病心肌纤维化程度直接影响手术疗效[5，6]，故对心肌纤维化程度的判 断可指导 手术时机选择及对预后的判断. 本结果表明风湿性二尖瓣关闭不全患者血清中PCI,PCⅢ的含 量明显高于正常人. 在这组风心病患者心肌中胶原阳性表达与血清学中的PCI,PCⅢ含量有较 好相关性，表明血清学的检测PCI,PCⅢ可在一定程度上反映心肌中间质胶原网络的改建.
风心病心肌中胶原表达量和外周血液中PCI，PCⅢ两者有着较好的相关性，主要是由于 前胶原在细胞内合成后分泌到细胞外，其氨基末端和羧基末端都附有肽端，在特殊肽链内切 酶的作用下，使这些肽段脱离前胶原以游离片断出现于外周血中，并随胶原纤维合成的活跃 而增多[7，8]. 故检测前胶原末端肽的前体PCI，PCⅢ能较好反应胶原合成状态， 直接明确 心肌间质纤维化程度，使其在临床风心病术前判断病情上有较好应用前景. 本结果表明放免 方法测定血清中Ⅰ,Ⅲ型胶原前体水平，能较好反应心肌纤维化程度，作为评价慢性风心病 心肌间质胶原增生程度，是一个较为合理和有实用前景的临床指标.
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870790)
作者简介：张近宝(1964-)， 男(汉族)， 黑龙江省齐齐哈尔 市人. 博士, 主治医师, 讲师.
Tel.(029)3375312 Email.zjbwyw@fmmu.edu.cn
张近宝(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
任崇雷(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
卢保弼(检验科，陕西 西安 710033)
参考文献：
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[1] Klappacher G, Franzen P, Haab D et al. Measuring extracell ular matrix turnover i n the serum of patients with idiopathic or ischemic dilated cardiomyopathy and i mpact on diagnosis and prognosis [J]. Am J Cardiol, 1995;75(14):913-918.
[2] Diez J, Laviades C, Mayor G et al. Increased serum concentration of procolla gen peptides in essential hypertension. Relation to cardiac alterations [J]. Circulation, 1995;91(5):1450-1454.
, 百拇医药 [3] Galambos MR, Collins DC, Galambos JT. A radioimmunoassay procedure f or type Ⅲ procollagen: Its use in the detection of hepatic fibrosis [J]. Hepatol,1 985;5(1):38-42.
[4] 刘兴明，林 丁，李伟道et al. 人I型前胶原放射免疫分析法的研究[J ]. 中华核医学杂志，1997;17(5):247-248.
[5] Chevalier B, Callens-el-Amrani F, Heymes C et al. Molecular ba si s of regression of cardiac hypertrophy [J]. Am J Cardiol, 1994;73(10):11C- 17C.
[6] Weber KT, Brilla CG, Janicki JS et al. Myocardial fibrosis: Func tio nal signficance and regulatory factors [J].Cardiovasc Res,1993;271(3):341- 348.
, 百拇医药
[7] Pedersen BJ, Bonder T. Purification of human procollagen I arboxylte rminal pr opeptide elevated as in vivo from procollagen and use to calibrate a radioim munoassay of propeptide [J]. Clin Chem, 1994;40(5):811-816.
[8] Klappacher G, Franzen P, Haab D et al. Measuring extracellular m atrix turnov er in the serum of patients with idiopathic or ischemic dilated cardiomyopathy a nd impact on diagnosis and prognosis [J]. Am J Cardiol, 1995;75(14):913-91 8., 百拇医药