EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中通过IκBα的降解活化NF-κB
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中国病理生理杂志 2000年第10期第16卷 第七届肿瘤和第
作者：殷莉群 廖伟 唐敏 顾焕华 李晓艳 曹亚
单位：湖南医科大学肿瘤研究所，湖南 长沙 410078
关键词：
中国病理生理杂志0010211
目的：EB病毒是一类与鼻咽癌等肿瘤密切相关的DNA致瘤病毒，其具体致瘤机制至今未明。EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LMP1)被确证具有瘤基因功能，它所介导的信号传导途径，尤其是LMP1通过活化核转录因子NF-κB调控下游靶基因的表达，在细胞增殖、分化、转化与凋亡中发挥着重要的生物学作用，因而在鼻咽癌发病机制的研究中备受瞩目。静息状态下，NF-κB二聚体与抑制子IκBs结合而存留在胞浆内。活化信号通常通过信号传导途径导致IκBs与NF-κB的分离，NF-κB得以进入胞核结合特异的识别序列，并反式激活靶基因转录。我们先前的研究表明在鼻咽癌细胞中LMP1能够活化NF-κB，并且导入NF-κB的反义寡聚核苷酸能部分逆转鼻咽癌细胞的恶性表型。由于细胞内信号传导是一个一系列激酶级联活化的过程，为进一步阐明LMP1在鼻咽癌细胞中激活核转录因子NF-κB的内在机制。方法：以时间为顺序，利用强力霉素Dox可控表达LMP1的鼻咽癌细胞株Tet-on-LMP1-HNE2为实验模型，首先应用Western blotting分析测定Dox诱导后不同时相LMP1的表达动力学。在确定LMP1诱导性表达的动力学特征后检测IκBs蛋白量及功能的改变。进而用间接免疫荧光法检测继IκBs蛋白功能改变后NF-κB的亚细胞定位。最后采用瞬间共转染及报道基因活性分析检测NF-κB的活性。结果：在鼻咽癌细胞Tet-on-LMP1-HNE2中，Dox处理15 min后LMP1的表达迅速升高并维持与较高水平直至120 min。LMP1的诱导性表达并未引起IκBα、IκBβ蛋白总量的改变。由于IκBα基因受NF-κB调控，活化的NF-κB可以启动IκBα的重新组合成，经蛋白合成抑制剂CHX阻断IκBα的重头合成后发现，LMP1的诱导性表达导致IκBα的磷酸化并降解，但IκBβ蛋白水平始终无变化。继IκBα的磷酸化并降解后，NF-κB发生自胞浆至胞核的易位。报道基因活性分析显示NF-κB的活性升高，并且，LMP1诱导的NF-κB活性能被IκBα的显性负性突变子完全抑制。结论：在鼻咽癌细胞Tet-on-LMP1-HNF2中，LMP1通过IκBα的磷酸化并降解激活核转录因子NF-κB的活性，并且，LMP1诱导的NF-κB活性能被IκBα的显性负性突变子完全抑制。IκBβ在此信号传导途径中无改变。LMP1表达前后IκBα蛋白总量维持恒定可能是由于NF-κB的活化迅速启动了IκBα的重头合成这一自身调节环路所致。
国家重点基础研究发展规划项目(973) (No:G1998051201) 资助
通信作者： 湖南省长沙市 湖南医科大学肿瘤研究所 410078 Tel:0731-4805448
Fax:0731-4470589 E-mail:ycao98@public.cs.hn.cn, http://www.100md.com
单位：湖南医科大学肿瘤研究所，湖南 长沙 410078
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中国病理生理杂志0010211
目的：EB病毒是一类与鼻咽癌等肿瘤密切相关的DNA致瘤病毒，其具体致瘤机制至今未明。EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LMP1)被确证具有瘤基因功能，它所介导的信号传导途径，尤其是LMP1通过活化核转录因子NF-κB调控下游靶基因的表达，在细胞增殖、分化、转化与凋亡中发挥着重要的生物学作用，因而在鼻咽癌发病机制的研究中备受瞩目。静息状态下，NF-κB二聚体与抑制子IκBs结合而存留在胞浆内。活化信号通常通过信号传导途径导致IκBs与NF-κB的分离，NF-κB得以进入胞核结合特异的识别序列，并反式激活靶基因转录。我们先前的研究表明在鼻咽癌细胞中LMP1能够活化NF-κB，并且导入NF-κB的反义寡聚核苷酸能部分逆转鼻咽癌细胞的恶性表型。由于细胞内信号传导是一个一系列激酶级联活化的过程，为进一步阐明LMP1在鼻咽癌细胞中激活核转录因子NF-κB的内在机制。方法：以时间为顺序，利用强力霉素Dox可控表达LMP1的鼻咽癌细胞株Tet-on-LMP1-HNE2为实验模型，首先应用Western blotting分析测定Dox诱导后不同时相LMP1的表达动力学。在确定LMP1诱导性表达的动力学特征后检测IκBs蛋白量及功能的改变。进而用间接免疫荧光法检测继IκBs蛋白功能改变后NF-κB的亚细胞定位。最后采用瞬间共转染及报道基因活性分析检测NF-κB的活性。结果：在鼻咽癌细胞Tet-on-LMP1-HNE2中，Dox处理15 min后LMP1的表达迅速升高并维持与较高水平直至120 min。LMP1的诱导性表达并未引起IκBα、IκBβ蛋白总量的改变。由于IκBα基因受NF-κB调控，活化的NF-κB可以启动IκBα的重新组合成，经蛋白合成抑制剂CHX阻断IκBα的重头合成后发现，LMP1的诱导性表达导致IκBα的磷酸化并降解，但IκBβ蛋白水平始终无变化。继IκBα的磷酸化并降解后，NF-κB发生自胞浆至胞核的易位。报道基因活性分析显示NF-κB的活性升高，并且，LMP1诱导的NF-κB活性能被IκBα的显性负性突变子完全抑制。结论：在鼻咽癌细胞Tet-on-LMP1-HNF2中，LMP1通过IκBα的磷酸化并降解激活核转录因子NF-κB的活性，并且，LMP1诱导的NF-κB活性能被IκBα的显性负性突变子完全抑制。IκBβ在此信号传导途径中无改变。LMP1表达前后IκBα蛋白总量维持恒定可能是由于NF-κB的活化迅速启动了IκBα的重头合成这一自身调节环路所致。
国家重点基础研究发展规划项目(973) (No:G1998051201) 资助
通信作者： 湖南省长沙市 湖南医科大学肿瘤研究所 410078 Tel:0731-4805448
Fax:0731-4470589 E-mail:ycao98@public.cs.hn.cn, http://www.100md.com