鼻咽癌形态发生过程中间质微血管的改变
鼻咽癌形态发生过程中间质微血管的改变
杨兴龙 朱明 缪露
摘 要：目的 比较间质微血管参数在鼻咽癌多阶段形态发生过程中的差异，并探讨间质微血管生成对鼻咽癌病理发展和癌生物学行为的影响作用. 方法 分别选择经病理确诊(同时分组)为①正常鼻咽粘膜上皮标本；②单纯增生/化生的鼻咽粘膜上皮标本；③异型增生/化生的鼻咽粘膜上皮标本；④鼻咽癌上皮标本各25例，进行间质微血管的免疫组化染色和计算机图像定量分析. 测试和计算4个参数：微血管计数，微血管相对面积，平均微血管面积和平均微血管周长，并比较这些参数在上述4组间的差异. 结果 ③组的微血管计数与微血管相对面积显著高于②组，而平均微血管面积和平均微血管周长均显著低于②组. 上述4个参数在①②组之间及③④组之间差异无显著性，但在②、③组之间的差异则有显著性(P<0.01).结论 异型增生/化生的鼻咽上皮组织细胞可能已经具有了癌细胞的某些生物学行为，如产生多种肿瘤血管生长因子(TAF)，刺激间质微血管的生长，为其早期转移与浸润做准备，而间质微血管的增生也可能是鼻咽上皮癌变转化过程的必需的病理改变，提示在早期的鼻咽癌筛查过程中，应注意跟踪鼻咽上皮异型增生/化生的高危人群.
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关键词：鼻咽癌；形态发生；间质微血管
0 引言
鼻咽癌(NPC)的一个显著特点是早期颈淋巴结转移与颅底浸润. 在头颈部肿瘤中NPC远处转移的发生率最高[1]，尤其是颈部巨大淋巴结者，其远处转移率高达50% ～ 57%[2]. 所以，探讨NPC早期的转移机制具有重要的意义. 近年来越来越多的证据表明，肿瘤的生长与转移是血管生长依赖性的[3]. Weidner等[4]报道可用测量肿瘤中的血管密度来评价肿瘤血管生成. 为探讨间质微血管生成对NPC病理发展和癌生物学行为的影响作用，我们用计算机图像分析系统对经von Willebrand因子(旧称Ⅷ因子)进行免疫组化染色对NPC形态发生过程中间质微血管参数作定量分析[5].
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 从第一军医大学南方医院病理科选取经病理确诊(并分组)为正常鼻咽上皮标本、单纯增生/化生的鼻咽上皮标本、异型增生/化生的鼻咽上皮标本及NPC上皮标本各25例. 连续切片，3 μm厚，做免疫组化染色.
1.2 方法 全部100例石蜡包埋标本制成了3 μm厚切片，常规脱蜡. 用鼠抗人单克隆抗体von Willebrand因子(北京中山公司产品)作为第一抗体进行LSAB法染色(LSAB试剂盒为北京中山公司产品)，苏木精复染，一抗的工作浓度为1∶150. 上皮间质的微血管经免疫组化染色后显示清楚. 每例标本先于光镜下(×40和×100)找出3个血管密度最高的区域(热点)，再将这些区域逐个进行数字图像处理. 图像分析系统的分辨度为512×768×12像素. 摄像镜头为Varo Cam单色CCD镜头(PCO Computer Optics GmbH,德国)，自动图像分析器(Kontron IBAS,德国)使用IBSA软件2.5版. 摄影镜头与Carl Zeiss Axiotro高分辨率显微镜相接，物镜选用40×0.75数值孔径. 每帧图像所观察到的血管横截面积达到和(或)超过面积为27 366 μm2判定为微血管. 图像分析过程是将256个灰阶的图像转化为二维图像，再计算如下4个参数：每帧图像中的微血管计数、全部微血管占有的相对面积(用百分比表示)、平均微血管面积和平均微血管周长. 其中需手工勾画出血管的轮廓. 对于微血管的识别不需具备完整的管腔和红细胞，只要有明显的内皮细胞染色并可与周围的组织分开，就可视为一个独立的血管. 但血管腔大于8个红细胞大小的，不予计数，偶尔成纤维细胞和肥大细胞着色，计数时就应注意加以剔除. 最后在每例标本的三帧图像中计算出各微血管参数的平均值作为一个标本的测量值.
, 百拇医药
统计学分析:全部统计学分析用SPSS 6.0软件包完成. 用单因素方差分析分别比较4个微血管参数在各组间的分布是否一致，在进一步用Scheffe法作两两间的多重比较.
2 结果
各组间4个微血管参数的分布不一致(P<0.01，Tab 1). 统计表明①组与②组、③组与④组之间差异均无显著性，但在①组与③组、②组与③组、①组与④组、②组与④组之间的差异均有显著性(P<0.01). 微血管计数及微血管相对面积在③、④组的结果显著高于在①②组的结果(P<0.01)；平均微血管面积及平均微血管周长在①②组的结果显著高于在③④组的结果(P<0.01).
表 1 NPC标本微血管参数的比较
Tab 1 Comparison of microvasculatures parameters of NPC samples (n=25, x±s)
, 百拇医药
Groups
Counts of
Microvasculatures
(27 366 μm2)
Relative area of
microvasculatures
(%)
Average area of
microvasculatures
(μm2)
Average perimeter of
, 百拇医药
microvasculatures
(μm)
Normal
1.46±0.44bd
5.2±3.4bd
108±94bd
75±17bd
Hyper/Meta plasia
1.50±0.37bd
5.3±2.4bd
, 百拇医药
107±86bd
74±10bd
Dys-/Meta plasia
2.64±0.54
9.3±3.5
81±19
52±7
NPC
2.80±0.21
2.80±0.21
76±20
, http://www.100md.com 56±11
bP<0.01 vs Dys-/Metaplasia；dP<0.01 vs NPC.3 讨论
鼻咽癌的病理发展是一个渐进的过程[6]. 鼻咽粘膜上皮异型增生/化生者中NPC的检出率达1106/(10万.a)(前瞻性观察)[7]. 我们基于这样的观点，进行思路设计，探讨异型增生/化生鼻咽上皮间质微血管相对于正常鼻咽上皮的改变. 肿瘤间质微血管的发生与增殖对肿瘤细胞的转移与浸润具有重要的意义. 肿瘤是个典型的依赖血管型病变，缺乏血管形成对肿瘤生长受限，没有血管形成就不形成肿瘤[8]. 本结果显示，异型增生/化生的鼻咽上皮间质内微血管计数与微血管相对面积明显增加，推测该异型增生/化生的鼻咽上皮细胞可能产生了一些内源性的刺激间质微血管发生与增殖的生物因子，有待于进一步研究. 增生的血管为其上皮的异型增生的进一步异型化提供了基础，使异型增生与癌变的倾向增加，为癌变后的早期转移做好准备. 因此，在鼻咽异型增生上皮间质中出现微血管的进一步的显著增殖可能是癌前病变演变为癌的一个不可忽视的征兆，具有重要的提示作用，在临床活检取材时，若发现大量血管增生，就应警惕癌变的可能性. 平均微血管面积和平均微血管周长在转移鼻咽癌异型增生/化生的鼻咽上皮组小于单纯增生/化生的鼻咽上皮组，这可能是因为微血管形态异常更加显著，不成型的血管组织更多，单位面积内的血管内皮细胞数目较多而有效的血管腔相对较少的原因，导致均数下降. Feng等[9]以鼻咽慢性炎症上皮无明显病变者的间质血管为参照标准，提出间质微血管的血管密度、截面积、直径、周径均大于参照标准时，就应视为具有癌变风险的高危人群. Roychowdhurg等[10]报道肿瘤微血管计数有助于及早识别NPC转移的高危人群，使针对性的全身治疗可及早与局部和区域的放射治疗综合应用. 这些都提示，鼻咽上皮的异型增生/化生有可能是鼻咽上皮癌变前的一个病理改变，在这一病理改变的同时，鼻咽上皮细胞同时具备了癌细胞的一些生物学行为. 认识NPC病理发展的这一特点对于NPC预防性筛查方案的建立和高危人群的发现有重要的提示作用和临床参考价值. 在NPC的多阶段形态发生过程中，伴随间质微血管的发生、增殖的改变外，在部分新生的毛细血管之间，其周围则有或多或少的纤维组织、淋巴类细胞和嗜酸性白细胞等的浸润，甚至形成肉芽肿样结构[11]，从免疫学的角度讲，这样的组织改变是机体阻止癌细胞进一步发生、转移的积极反应. 中山医科大学的研究发现，NPC间质中淋巴细胞数量的多少与患者血清中对EB病毒的EA-IgG，VCA-IgA，VCA-IgG等滴度高低有关[12].
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编辑 袁天峰
作者简介：杨兴龙(1972-)，男(汉族)，陕西省咸阳市人. 硕士生(导师申 洪). Tel.(029)3375024 Email. kyd.@fmmu.cdu.cn
杨兴龙(第四军医大学西京医院医教部, 陕西 西安 710033)
朱明(第一军医大学珠江医院耳鼻喉科)
缪露(第四军医大学西京医院科研部)
参考文献：
[1]Fandi A, Altrun M, Azli N et al. Nasopharyngeal cancer: Epidemiology, staging and treatment[J]. Semin Oncol, 1994;21(3):382-397.
, 百拇医药
[2]Lee AWM, Poon YF, Foo W et al. Retrospective analysis of 5037 patients with nasopharyngeal carcinoma treated during 1976-1985:overall survival and patterns of failure[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1992;23(2):261-270.
[3]Fox SB, Gatter KC, Harris AL. Tumor angiogenesis[J]. J Pathol, 1996;179(3):232-237.
[4]Weidner N, Semple JP, Welech WR et al. Tumor angiogenesis and metastasis: correlation in invasive breast carcinoma[J]. N Engl J Med, 1991;324(3):1-8.
, http://www.100md.com
[5]Kohlberger PD, Obermair A, Sliutz G et al. Quantitative immunohistochemistry of factor VⅢ-related antigen in breast carcinoma: a comparison of computer-assisted image analysis with established counting methods[J]. Am J Clin Pathol, 1996;105(6):705-710.
[6]宗永生,杨传民,张昌卿et al. 用原位杂交技术探讨EBV在NPC发生中的作用[J]. 中华病理学杂志,1993;66(3):330-332.
[7]闵华庆,黄腾波. EBV与NPC相关的前瞻性观察[J]. 癌症,1991;10(5):367-370.
[8]Folkman J.What is the evidence that tumour are angiogenesis dependent[J]? J Natl Cancer Inst, 1990;82(4):4-6.
, 百拇医药
[9]Feng BC, Liu kL. A morphological study of stromal microvasculature of nasopharyngeal precancerous lesions[J]. Chin Med J, 1991;104(5):422-424.
[10]Roychowdhury DF, Tseng A, Fu KK et al. New prognostic factors in nasopharyngeal carcinoma: tumor angiogenesis and C-arb132 expression[J]. Cancer, 1996;77(3):1419-1426.
[11]Blood CH, Zetter BR. Tumor interaction with the vasculature: angiogenesis and metastasis[J]. Biochem Biophys Acta,1990;732(1):89-92.
[12]Zong Ys, Zhang CQ, Zhang F et al. Infiltrating lymphocytes and accessory cells in nasopharyngeal carcinoma[J]. Jpn J Cancer Res, 1993;84(8):900-905., 百拇医药
杨兴龙 朱明 缪露
摘 要：目的 比较间质微血管参数在鼻咽癌多阶段形态发生过程中的差异，并探讨间质微血管生成对鼻咽癌病理发展和癌生物学行为的影响作用. 方法 分别选择经病理确诊(同时分组)为①正常鼻咽粘膜上皮标本；②单纯增生/化生的鼻咽粘膜上皮标本；③异型增生/化生的鼻咽粘膜上皮标本；④鼻咽癌上皮标本各25例，进行间质微血管的免疫组化染色和计算机图像定量分析. 测试和计算4个参数：微血管计数，微血管相对面积，平均微血管面积和平均微血管周长，并比较这些参数在上述4组间的差异. 结果 ③组的微血管计数与微血管相对面积显著高于②组，而平均微血管面积和平均微血管周长均显著低于②组. 上述4个参数在①②组之间及③④组之间差异无显著性，但在②、③组之间的差异则有显著性(P<0.01).结论 异型增生/化生的鼻咽上皮组织细胞可能已经具有了癌细胞的某些生物学行为，如产生多种肿瘤血管生长因子(TAF)，刺激间质微血管的生长，为其早期转移与浸润做准备，而间质微血管的增生也可能是鼻咽上皮癌变转化过程的必需的病理改变，提示在早期的鼻咽癌筛查过程中，应注意跟踪鼻咽上皮异型增生/化生的高危人群.
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关键词：鼻咽癌；形态发生；间质微血管
0 引言
鼻咽癌(NPC)的一个显著特点是早期颈淋巴结转移与颅底浸润. 在头颈部肿瘤中NPC远处转移的发生率最高[1]，尤其是颈部巨大淋巴结者，其远处转移率高达50% ～ 57%[2]. 所以，探讨NPC早期的转移机制具有重要的意义. 近年来越来越多的证据表明，肿瘤的生长与转移是血管生长依赖性的[3]. Weidner等[4]报道可用测量肿瘤中的血管密度来评价肿瘤血管生成. 为探讨间质微血管生成对NPC病理发展和癌生物学行为的影响作用，我们用计算机图像分析系统对经von Willebrand因子(旧称Ⅷ因子)进行免疫组化染色对NPC形态发生过程中间质微血管参数作定量分析[5].
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 从第一军医大学南方医院病理科选取经病理确诊(并分组)为正常鼻咽上皮标本、单纯增生/化生的鼻咽上皮标本、异型增生/化生的鼻咽上皮标本及NPC上皮标本各25例. 连续切片，3 μm厚，做免疫组化染色.
1.2 方法 全部100例石蜡包埋标本制成了3 μm厚切片，常规脱蜡. 用鼠抗人单克隆抗体von Willebrand因子(北京中山公司产品)作为第一抗体进行LSAB法染色(LSAB试剂盒为北京中山公司产品)，苏木精复染，一抗的工作浓度为1∶150. 上皮间质的微血管经免疫组化染色后显示清楚. 每例标本先于光镜下(×40和×100)找出3个血管密度最高的区域(热点)，再将这些区域逐个进行数字图像处理. 图像分析系统的分辨度为512×768×12像素. 摄像镜头为Varo Cam单色CCD镜头(PCO Computer Optics GmbH,德国)，自动图像分析器(Kontron IBAS,德国)使用IBSA软件2.5版. 摄影镜头与Carl Zeiss Axiotro高分辨率显微镜相接，物镜选用40×0.75数值孔径. 每帧图像所观察到的血管横截面积达到和(或)超过面积为27 366 μm2判定为微血管. 图像分析过程是将256个灰阶的图像转化为二维图像，再计算如下4个参数：每帧图像中的微血管计数、全部微血管占有的相对面积(用百分比表示)、平均微血管面积和平均微血管周长. 其中需手工勾画出血管的轮廓. 对于微血管的识别不需具备完整的管腔和红细胞，只要有明显的内皮细胞染色并可与周围的组织分开，就可视为一个独立的血管. 但血管腔大于8个红细胞大小的，不予计数，偶尔成纤维细胞和肥大细胞着色，计数时就应注意加以剔除. 最后在每例标本的三帧图像中计算出各微血管参数的平均值作为一个标本的测量值.
, 百拇医药
统计学分析:全部统计学分析用SPSS 6.0软件包完成. 用单因素方差分析分别比较4个微血管参数在各组间的分布是否一致，在进一步用Scheffe法作两两间的多重比较.
2 结果
各组间4个微血管参数的分布不一致(P<0.01，Tab 1). 统计表明①组与②组、③组与④组之间差异均无显著性，但在①组与③组、②组与③组、①组与④组、②组与④组之间的差异均有显著性(P<0.01). 微血管计数及微血管相对面积在③、④组的结果显著高于在①②组的结果(P<0.01)；平均微血管面积及平均微血管周长在①②组的结果显著高于在③④组的结果(P<0.01).
表 1 NPC标本微血管参数的比较
Tab 1 Comparison of microvasculatures parameters of NPC samples (n=25, x±s)
, 百拇医药
Groups
Counts of
Microvasculatures
(27 366 μm2)
Relative area of
microvasculatures
(%)
Average area of
microvasculatures
(μm2)
Average perimeter of
, 百拇医药
microvasculatures
(μm)
Normal
1.46±0.44bd
5.2±3.4bd
108±94bd
75±17bd
Hyper/Meta plasia
1.50±0.37bd
5.3±2.4bd
, 百拇医药
107±86bd
74±10bd
Dys-/Meta plasia
2.64±0.54
9.3±3.5
81±19
52±7
NPC
2.80±0.21
2.80±0.21
76±20
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bP<0.01 vs Dys-/Metaplasia；dP<0.01 vs NPC.3 讨论
鼻咽癌的病理发展是一个渐进的过程[6]. 鼻咽粘膜上皮异型增生/化生者中NPC的检出率达1106/(10万.a)(前瞻性观察)[7]. 我们基于这样的观点，进行思路设计，探讨异型增生/化生鼻咽上皮间质微血管相对于正常鼻咽上皮的改变. 肿瘤间质微血管的发生与增殖对肿瘤细胞的转移与浸润具有重要的意义. 肿瘤是个典型的依赖血管型病变，缺乏血管形成对肿瘤生长受限，没有血管形成就不形成肿瘤[8]. 本结果显示，异型增生/化生的鼻咽上皮间质内微血管计数与微血管相对面积明显增加，推测该异型增生/化生的鼻咽上皮细胞可能产生了一些内源性的刺激间质微血管发生与增殖的生物因子，有待于进一步研究. 增生的血管为其上皮的异型增生的进一步异型化提供了基础，使异型增生与癌变的倾向增加，为癌变后的早期转移做好准备. 因此，在鼻咽异型增生上皮间质中出现微血管的进一步的显著增殖可能是癌前病变演变为癌的一个不可忽视的征兆，具有重要的提示作用，在临床活检取材时，若发现大量血管增生，就应警惕癌变的可能性. 平均微血管面积和平均微血管周长在转移鼻咽癌异型增生/化生的鼻咽上皮组小于单纯增生/化生的鼻咽上皮组，这可能是因为微血管形态异常更加显著，不成型的血管组织更多，单位面积内的血管内皮细胞数目较多而有效的血管腔相对较少的原因，导致均数下降. Feng等[9]以鼻咽慢性炎症上皮无明显病变者的间质血管为参照标准，提出间质微血管的血管密度、截面积、直径、周径均大于参照标准时，就应视为具有癌变风险的高危人群. Roychowdhurg等[10]报道肿瘤微血管计数有助于及早识别NPC转移的高危人群，使针对性的全身治疗可及早与局部和区域的放射治疗综合应用. 这些都提示，鼻咽上皮的异型增生/化生有可能是鼻咽上皮癌变前的一个病理改变，在这一病理改变的同时，鼻咽上皮细胞同时具备了癌细胞的一些生物学行为. 认识NPC病理发展的这一特点对于NPC预防性筛查方案的建立和高危人群的发现有重要的提示作用和临床参考价值. 在NPC的多阶段形态发生过程中，伴随间质微血管的发生、增殖的改变外，在部分新生的毛细血管之间，其周围则有或多或少的纤维组织、淋巴类细胞和嗜酸性白细胞等的浸润，甚至形成肉芽肿样结构[11]，从免疫学的角度讲，这样的组织改变是机体阻止癌细胞进一步发生、转移的积极反应. 中山医科大学的研究发现，NPC间质中淋巴细胞数量的多少与患者血清中对EB病毒的EA-IgG，VCA-IgA，VCA-IgG等滴度高低有关[12].
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编辑 袁天峰
作者简介：杨兴龙(1972-)，男(汉族)，陕西省咸阳市人. 硕士生(导师申 洪). Tel.(029)3375024 Email. kyd.@fmmu.cdu.cn
杨兴龙(第四军医大学西京医院医教部, 陕西 西安 710033)
朱明(第一军医大学珠江医院耳鼻喉科)
缪露(第四军医大学西京医院科研部)
参考文献：
[1]Fandi A, Altrun M, Azli N et al. Nasopharyngeal cancer: Epidemiology, staging and treatment[J]. Semin Oncol, 1994;21(3):382-397.
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[5]Kohlberger PD, Obermair A, Sliutz G et al. Quantitative immunohistochemistry of factor VⅢ-related antigen in breast carcinoma: a comparison of computer-assisted image analysis with established counting methods[J]. Am J Clin Pathol, 1996;105(6):705-710.
[6]宗永生,杨传民,张昌卿et al. 用原位杂交技术探讨EBV在NPC发生中的作用[J]. 中华病理学杂志,1993;66(3):330-332.
[7]闵华庆,黄腾波. EBV与NPC相关的前瞻性观察[J]. 癌症,1991;10(5):367-370.
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[9]Feng BC, Liu kL. A morphological study of stromal microvasculature of nasopharyngeal precancerous lesions[J]. Chin Med J, 1991;104(5):422-424.
[10]Roychowdhury DF, Tseng A, Fu KK et al. New prognostic factors in nasopharyngeal carcinoma: tumor angiogenesis and C-arb132 expression[J]. Cancer, 1996;77(3):1419-1426.
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