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编号:10503333
复合多聚酶链快速检测淋病奈瑟菌和溶脲脲原体
http://www.100md.com 《中华医院感染学杂志》 2000年第2期
     郭兆彪 杨瑞馥 张敏丽 汪晓辉

     摘 要: 目的 评价用PCR同时检测标本中的淋球菌和溶脲脲原体。方法 通过筛选不同引物,确定了两引物对的最佳浓度配比。 结果 特异性和敏感性评价表明,该复合系统是淋球菌和溶脲脲原体特异的,可分别检出270fg和64fg的相应DNA。结论 临床标本检测证明,复合PCR检测淋球菌与单一PCR结果符合率达100%,检测溶脲脲原体与单一PCR结果符合率达99%。

    关键词:复合PCR;淋球菌;溶脲脲原体;临床标本

    淋病奈瑟氏菌(NG)和溶脲脲原体(UU)是引起性传播疾病的主要病原体。传统的临床诊断方法主要依赖培养,且需要时间长[1]。随着医学分子微生物学的不断发展,近几年研制出的单一PCR检测病原体的方法,已在许多临床实验室中开展,并显示出了较突出的优点,但仍摆脱不了检测1种病原,需要1种器皿的模式,还达不到简单的目的。为此,我们在研究单一PCR方法的基础上[2~3],又研制出了复合PCR快速检测NG和UU的新方法,它可在同一反应管内,用两对不同的引物同时检测出两种病原的存在。此方法的建立使PCR检测技术向新的高度迈进了一步。
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    1 材料与方法

    1.1 菌种 标准的奈瑟氏菌种和溶脲脲原体14个血清型分别购自卫生部药品生物制品检定所和首都儿科研究所,其它受试菌均为本实验室保存。

    1.2 引物的设计 检测淋病奈瑟氏菌的引物是以其随机克隆片段ORF-1基因为依据[4],选择了1对各为20mer的寡核苷酸作为引物;扩增片段长度为594bp,检测溶脲脲原体的引物,以其尿素酶基因序列为依据[5],选择了1对各为21mer的寡核苷酸为引物,扩增片段为418bp(引物由国家生物医学中心DNA合成与测序实验室合成)。

    1.3 PCR模板的制备 采用Nal裂解、玻璃粉吸附法提取标本中的DNA:用牛奶保存的冻干菌种,先加500μl无菌生理盐水将其溶解,然后4 000rpm离心1~2分钟,取上清100μl进行模板制备,临床采集的宫颈或男性尿道分泌物,先悬浮在0.5ml无菌生理盐水中,取100μl悬浮液进行模板制备。
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    1.4 复合PCR反应 首先配制10倍PCR反应液dNTPS0.7mm/L,NG引物各为0.9μm/L;UU引物各为1.5μm/L(10×PCR缓冲液:0.1mol/L Tris-HCL pH8.3;0.5mol/L KCl;0.025mol/L;MgCl2;0.15mmol/L酒石磺;0.1%BSA。向反应管内加入10倍PCR反应液3μl,Taq DNA聚合酶(Biomedcal公司)2μl(1u/μl),真空干燥,制成单人、单管的复合PCR反应系统,直接取上述制备好的模板30μl混匀,加石蜡油1滴,置DNA热循环仪(PTC-51本院生产)上94℃预变性3min,然后进入PCR循环94℃40s、58℃40s、72℃40s共35个循环。最后一循环延伸后,再于72℃延伸5min,取15μl反应液于1.5%琼脂糖凝胶电泳,60~80V电压;15~30min,在紫外灯下观察结果并拍照。

    1.5 PCR敏感度试验 用Nal固相吸附法分别提取溶脲脲原体第8血清型和淋病奈瑟氏菌29106的DNA,紫外分光光度计测定含量,稀释成不同的浓度,进行PCR扩增。
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    2 结 果

    2.1 引物特异性和敏感度 特异性和敏感度是衡量PCR引物是否能够应用到病原体检测的两个重要指标。引物在计算机上设计合理,不等于在实践中好用,为了证明引物是否特异敏感,我们选用了溶脲脲原体14个血清型的标准株;淋病奈瑟氏菌5株标准菌种及其它的菌种,在同一条件下,进行DNA扩增。结果表明:各对引物只与各自的菌种发生阳性扩增,而与其它菌株均不发生阳性反应。引物的敏感度实验结果表明,设计的UU、NG引物分别可检测到64fg和270fg。

    2.2 引物的浓度配伍 复合PCR引物浓度比例是否合适,直接影响PCR检测结果。为此,我们将两对引物配制成几组不同的浓度,在相同的反应条件下,先用单一PCR扩增出的阳性标本,然后用不同浓度的复合PCR引物进行扩增,选出引物最佳浓度配伍。在我们实验条件下NG∶UU为1∶1.5。

    2.3 单一PCR与复合PCR直接检测临床样品的比较 对天津长征医院检验科采集的152例可疑为淋球菌或溶脲脲原体感染的标本,分别用单一PCR、复合PCR直接进行检测,单一PCR检出淋球菌阳性61份,检出溶脲脲原体阳性55例,复合PCR检出淋球菌与单一PCR检测结果完全一致;检测溶脲脲原体除1份标本漏检外,其余均相同(图1)。
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    图1 复合PCR直接检测临床标本的实验结果

    3 讨 论

    选择引物基因序列是否准确,是PCR成败的重要因素之一。根据检测目的不同,引物设计的基因位点也不同,在同一个基因上设计选择不同对的引物,其敏感度可相差10~1 000倍[6],所以作为检测病原用的PCR引物,应该在特异性、敏感性上下功夫。

    目前PCR引物均借助计算机核酸软件库来辅助设计。我们在工作中发现,计算机上设计的引物可行,不等于在实践中好用,这需要设计多对引物来相互比较,真正经得起实践的检验。用计算机辅助引物设计时,有多种程序供选择,不同程序分析的参数略有差异,我们在实践中发现,引物序列是决定PCR敏感性的关键因素之一。通过比较引物G+C含量、Tm值、自由能、发夹结构及模板的相应参数,发现引物的自由能谱是影响PCR敏感性的主要因素(另文发表)。只有在选择的单一PCR引物较完美的情况下,才能考虑复合PCR的配伍。
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    复合PCR引物的配伍,是一个非常复杂的问题,目前还没有什么规律可循。几种单一PCR好用的引物,组合成复合PCR反应体系后可能会因引物间相互作用影响结果[7]。我们在研制复合PCR的过程中先后更换了10多对引物,最终才找到两对理想的复合PCR引物。

    在PCR的反应系统中,Taq DNA聚合酶的选择也是不可忽视的因素,酶活性和纯度的高低,对PCR的影响也是至关重要的。我们在研究过程中发现,在PCR反应体系和反应条件均相同,TaqDNA聚合酶不同其结果差别甚大,在复合PCR反应中TaqDNA聚合酶的选择显得尤为重要。

    优化各种条件后,我们对采集于天津长征医院的152份标本,用单一PCR和复合PCR同时检测,复合PCR除漏检1份UU外,其余结果两者完全相同。漏检的原因可能是实验操作误差和复合PCR反应条件严格等原因所致。总之,复合PCR在实际应用中是可行的,且会为临床实验室带来更大的方便。
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    郭兆彪(军事医学科学院微生物流行病研究所,国家生物医学中心分析微生物实验室,北京 100071)

    杨瑞馥(军事医学科学院微生物流行病研究所,国家生物医学中心分析微生物实验室,北京 100071)

    张敏丽(军事医学科学院微生物流行病研究所,国家生物医学中心分析微生物实验室,北京 100071)

    汪晓辉(军事医学科学院微生物流行病研究所,国家生物医学中心分析微生物实验室,北京 100071)

    参考文献

    1,Chapin-Robertson K. Use of Molecular Dignostics in Sexually Transmitted Diseases[J]. Critical Assessment. Dign Microbiol lnfect Dis, 1993, 16: 173.
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    2,郭兆彪, 杨瑞馥,李银太, 等. PCR快速检测淋球菌方法的建立及初步应用[J]. 中华流行病学杂志, 1993,14(特刊): 171.

    3,郭兆彪, 杨瑞馥,李银太, 等. 解脲支原体PCR检测方法的建立及临床初步应用[J]. 中华流行病学杂志, 1993,14(特刊): 193.

    4,Garrett Midyada and Teresa L. Born. A DNA sequence for the discrimination of Neisseria gonorrhoeae from other Neisseria species[J]. Mol Cell Probes, 1991, 5: 327.

    5,Blanchard, A. Ureaplasma urealyticum urease genes; use of a UGA tryptophan codon[J]. Mol Microbiol, 1990, 4: 669.

    6,Wang, L. Fliegel, C. E. Cass, et al. Primers are decisive for sensitivity of PCR[J]. Biotechniques, 1994, 17: 82.

    7,Wong, K. C. B. S. W. Ho, et al. Duplex PCR system for simultaneous detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in clinical specimens[J], H, Clin. Pathol, 1995, 48: 101., http://www.100md.com