次声作用后大鼠下丘脑HSP70的表达
次声作用后大鼠下丘脑HSP70的表达
黄文晋 贾克勇 张萍 肖华胜 韩良辅 陈镔复 陈景藻 鞠躬
摘 要：目的 研究大鼠经次声作用后下丘脑中HSP70的表达. 方法 SD大 鼠先经8 Hz,120 dB次声作用2 h,然后分为8组, 每组3只. 分别于次声作用 后0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6和7 h后取下丘脑, 通过Western blotting技术检测HSP70的表达. 2组对照组,1组放入次声压力仓,但无次声作用;另1组既不放入次声压力仓，也无次声作用. 结果 与2组对照比较, 次声作用2 h后, 随时间延长, HSP70表达呈升高趋势. 结论 HSP70参与了次声应激后机体的反应机制.
关键词:次声；应激；下丘脑；热休克蛋白70；Western blotting
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0 引言
振动频率范围为0.0001～20 Hz的声即为次声(infrasound). 动物受次声的影响产生非特异的应激反应，主要表现为植物神经系统和内分泌系统的功能紊乱, 进一步还可能导致脑皮质功能失调[1]. 但次声刺激后神经中枢特别是与应激反应密切相关的下丘脑发生的变化以及应激反应的分子机制尚知之甚少. 我们利用Western blotting技术, 检测了大鼠经次声作用后在下丘脑中热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)的表达, 旨在探讨HSP70在次声引起的应激反应中可能的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠, 体质量(200±25)g，由本校实验动物中心提供. 单克隆抗HSP70抗体，生物素化羊抗鼠IgG，偶联avidin的过氧化物酶，二氨基联苯胺(DAB)，NC膜和葡萄糖氧化酶为Sigma公司产品; 其他试剂为国产分析纯. 次声压力仓及次声测量系统由本校西京医院与中国科学院声学研究所及航天工业总公司第41所协作研建. 蛋白电泳及转移系统为Bio-Rad公司产品. 凝胶成像及分析系统为UVP公司生产.
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1.2 方法 将大鼠置于次声压力仓内, 8 Hz,120 dB作用2 h后取出. 随机分为8组, 每组3只, 分别于次声作用0.5, 1, 2, 3,4,5,6和7 h后, 10 g.L-1戊巴比妥钠麻醉, 断头, 迅速取出下丘脑, 液氮速冻后转移至-80℃冰箱. 对照分为2组, 每组3只. 1组置于压力仓内2 h但无次声作用, 1组不放入压力仓, 也无次声作用, 同上述方法取出下丘脑. 将下丘脑置于匀浆缓冲液(含10 mL.L-1 NP40, 5 g.L-1去氧胆酸钠, 1 g.L-1 SDS和100 mg.L-1苯环酰氟的PBS)中, 匀浆后冰浴30 min, 15 000 g离心20 min后取出上清. 用Lowry法测定蛋白含量. 上清中加等体积2×电泳样品缓冲液[100 mmol.L-1 Tris.Cl, pH 8.0; 200 mmol.L-1二硫苏糖醇, 40 g.L-1十二烷基磺酸钠(SDS), 2 g.L-1溴酚蓝, 200 mL.L-1甘油]. 100℃煮5 min后备用. 按仪器说明进行蛋白电泳，每个样品上样量为 50 μg, SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度为100 g.L-1, 交联度为3.33%. 蛋白由凝胶转移至NC膜后, 膜置于TBS+10 g.L-1 BSA中室温封闭1 h,并依次分别与抗HSP70单抗(1∶5000稀释),生物素化羊抗鼠IgG(1∶20 000稀释)和偶联avidin的过氧化物酶(1∶2000稀释)于室温孵育1 h. 最后用DAB-硫酸镍铵-氧化酶法显色. 用凝胶成像及分析系统对各时间点及2个对照组的HSP70表达进行吸光度分析. 计算各时间点吸光度值与对照组吸光度平均值的比值.
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2 结果
NC膜的DAB显色结果如Fig 1. 吸光度分析结果表明，次声作用后0.5 h大鼠下丘脑HSP70表达即开始明显升高, 随时间延长, HSP70的表达呈增高趋势. 7.0 h后HSP70表达仍呈增高状态. 次声作用0.5,1,2,3,4,5,6和7 h后，各时间点吸光度与2个对照组吸光度平均值的比值分别为1.26， 1.30， 1.33， 1.49， 1.56， 1.61， 1.72和 1.84。
图 1 次声作用后下丘脑HSP70表达的Western blotting
Fig 1 Western blotting of HSP70 in hypothylamus after exposed to infrasound
C1， C2: Control 1， Control 2；0.5～7.0 h: 0.5～7.0 h after exposed to infrasound.
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3 讨论
次声是生产噪声和公共噪声的重要组成部分, 由于在生产环境中采取吸声和隔声措施, 故在噪声中可听声的比重下降, 次声的比重上升. 当外界环境中的次声达到一定强度和作用时间时, 对人体可造成一定的不良影响, 从而可影响工作能力、生产能力、军事指挥能力和战斗力, 故对次声的生物效应研究值得高度重视[2].
次声作为一种应激源, 可以引起大鼠的应激反应. 我们的研究表明， HSP70参与了次声应激后机体的反应机制. 在正常情况下脑内只有少量HSP70的存在. HSP70可以被多种刺激诱导产生, 因此, 在中枢神经系统HSP70的表达是神经元兴奋的标志, 非应激的兴奋性刺激不能引起其表达. 一般认为, 细胞在不良环境因素下表达HSP是为了保护细胞不受或少受伤害[3]. 因此应激后HSP70的表达对神经元具有保护作用[4]. 研究次声作用后中枢神经系统HSP70的表达情况对指导次声的防护研究有重要的意义.
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基金项目：总后卫生部资助军队重点课题(96Z042)
作者简介：黄文晋(1966-), 男(汉族)，山西省孝义市人. 博士, 讲师. Tel.(029)3374565
黄文晋(第四军医大学 全军神经科学研究所)
贾克勇(西京医院物理治疗与康复医学科, 陕西 西安710033)
张萍(第四军医大学 全军神经科学研究所)
肖华胜(第四军医大学 全军神经科学研究所)
韩良辅(西京医院物理治疗与康复医学科, 陕西 西安710033)
陈镔复(第四军医大学 全军神经科学研究所)
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陈景藻(西京医院物理治疗与康复医学科, 陕西 西安710033)
鞠躬(第四军医大学 全军神经科学研究所)
参考文献：
[1] Naoko N, Masanobu M, Yasukiyo Y. Process and emergence on the effects of infrasonic and low frequency noise on inhibitants[J]. J Low Freq Noise Vib, 1989; 8(3):87-99.
[2] 陈景藻. 次声的产生及生物效应[A]. 见：中国人民解放军总后勤部卫生部. 医药卫生科学技术进展[M]. 北京:军事医学科学出版社, 1997:194-197.
[3] Linquist S, Bullitt E. The heat-shock proteius[J]. Annu Rev Genet, 1986; 22:631-637.
[4] Zimarino V, Wu C. Induction of sequence-specific binding of Drosophila heat shock activator protein without protein synthesis[J]. Nature, 1987; 327(6124):727-730., http://www.100md.com
黄文晋 贾克勇 张萍 肖华胜 韩良辅 陈镔复 陈景藻 鞠躬
摘 要：目的 研究大鼠经次声作用后下丘脑中HSP70的表达. 方法 SD大 鼠先经8 Hz,120 dB次声作用2 h,然后分为8组, 每组3只. 分别于次声作用 后0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6和7 h后取下丘脑, 通过Western blotting技术检测HSP70的表达. 2组对照组,1组放入次声压力仓,但无次声作用;另1组既不放入次声压力仓，也无次声作用. 结果 与2组对照比较, 次声作用2 h后, 随时间延长, HSP70表达呈升高趋势. 结论 HSP70参与了次声应激后机体的反应机制.
关键词:次声；应激；下丘脑；热休克蛋白70；Western blotting
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0 引言
振动频率范围为0.0001～20 Hz的声即为次声(infrasound). 动物受次声的影响产生非特异的应激反应，主要表现为植物神经系统和内分泌系统的功能紊乱, 进一步还可能导致脑皮质功能失调[1]. 但次声刺激后神经中枢特别是与应激反应密切相关的下丘脑发生的变化以及应激反应的分子机制尚知之甚少. 我们利用Western blotting技术, 检测了大鼠经次声作用后在下丘脑中热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)的表达, 旨在探讨HSP70在次声引起的应激反应中可能的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠, 体质量(200±25)g，由本校实验动物中心提供. 单克隆抗HSP70抗体，生物素化羊抗鼠IgG，偶联avidin的过氧化物酶，二氨基联苯胺(DAB)，NC膜和葡萄糖氧化酶为Sigma公司产品; 其他试剂为国产分析纯. 次声压力仓及次声测量系统由本校西京医院与中国科学院声学研究所及航天工业总公司第41所协作研建. 蛋白电泳及转移系统为Bio-Rad公司产品. 凝胶成像及分析系统为UVP公司生产.
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1.2 方法 将大鼠置于次声压力仓内, 8 Hz,120 dB作用2 h后取出. 随机分为8组, 每组3只, 分别于次声作用0.5, 1, 2, 3,4,5,6和7 h后, 10 g.L-1戊巴比妥钠麻醉, 断头, 迅速取出下丘脑, 液氮速冻后转移至-80℃冰箱. 对照分为2组, 每组3只. 1组置于压力仓内2 h但无次声作用, 1组不放入压力仓, 也无次声作用, 同上述方法取出下丘脑. 将下丘脑置于匀浆缓冲液(含10 mL.L-1 NP40, 5 g.L-1去氧胆酸钠, 1 g.L-1 SDS和100 mg.L-1苯环酰氟的PBS)中, 匀浆后冰浴30 min, 15 000 g离心20 min后取出上清. 用Lowry法测定蛋白含量. 上清中加等体积2×电泳样品缓冲液[100 mmol.L-1 Tris.Cl, pH 8.0; 200 mmol.L-1二硫苏糖醇, 40 g.L-1十二烷基磺酸钠(SDS), 2 g.L-1溴酚蓝, 200 mL.L-1甘油]. 100℃煮5 min后备用. 按仪器说明进行蛋白电泳，每个样品上样量为 50 μg, SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度为100 g.L-1, 交联度为3.33%. 蛋白由凝胶转移至NC膜后, 膜置于TBS+10 g.L-1 BSA中室温封闭1 h,并依次分别与抗HSP70单抗(1∶5000稀释),生物素化羊抗鼠IgG(1∶20 000稀释)和偶联avidin的过氧化物酶(1∶2000稀释)于室温孵育1 h. 最后用DAB-硫酸镍铵-氧化酶法显色. 用凝胶成像及分析系统对各时间点及2个对照组的HSP70表达进行吸光度分析. 计算各时间点吸光度值与对照组吸光度平均值的比值.
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2 结果
NC膜的DAB显色结果如Fig 1. 吸光度分析结果表明，次声作用后0.5 h大鼠下丘脑HSP70表达即开始明显升高, 随时间延长, HSP70的表达呈增高趋势. 7.0 h后HSP70表达仍呈增高状态. 次声作用0.5,1,2,3,4,5,6和7 h后，各时间点吸光度与2个对照组吸光度平均值的比值分别为1.26， 1.30， 1.33， 1.49， 1.56， 1.61， 1.72和 1.84。
图 1 次声作用后下丘脑HSP70表达的Western blotting
Fig 1 Western blotting of HSP70 in hypothylamus after exposed to infrasound
C1， C2: Control 1， Control 2；0.5～7.0 h: 0.5～7.0 h after exposed to infrasound.
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3 讨论
次声是生产噪声和公共噪声的重要组成部分, 由于在生产环境中采取吸声和隔声措施, 故在噪声中可听声的比重下降, 次声的比重上升. 当外界环境中的次声达到一定强度和作用时间时, 对人体可造成一定的不良影响, 从而可影响工作能力、生产能力、军事指挥能力和战斗力, 故对次声的生物效应研究值得高度重视[2].
次声作为一种应激源, 可以引起大鼠的应激反应. 我们的研究表明， HSP70参与了次声应激后机体的反应机制. 在正常情况下脑内只有少量HSP70的存在. HSP70可以被多种刺激诱导产生, 因此, 在中枢神经系统HSP70的表达是神经元兴奋的标志, 非应激的兴奋性刺激不能引起其表达. 一般认为, 细胞在不良环境因素下表达HSP是为了保护细胞不受或少受伤害[3]. 因此应激后HSP70的表达对神经元具有保护作用[4]. 研究次声作用后中枢神经系统HSP70的表达情况对指导次声的防护研究有重要的意义.
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基金项目：总后卫生部资助军队重点课题(96Z042)
作者简介：黄文晋(1966-), 男(汉族)，山西省孝义市人. 博士, 讲师. Tel.(029)3374565
黄文晋(第四军医大学 全军神经科学研究所)
贾克勇(西京医院物理治疗与康复医学科, 陕西 西安710033)
张萍(第四军医大学 全军神经科学研究所)
肖华胜(第四军医大学 全军神经科学研究所)
韩良辅(西京医院物理治疗与康复医学科, 陕西 西安710033)
陈镔复(第四军医大学 全军神经科学研究所)
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陈景藻(西京医院物理治疗与康复医学科, 陕西 西安710033)
鞠躬(第四军医大学 全军神经科学研究所)
参考文献：
[1] Naoko N, Masanobu M, Yasukiyo Y. Process and emergence on the effects of infrasonic and low frequency noise on inhibitants[J]. J Low Freq Noise Vib, 1989; 8(3):87-99.
[2] 陈景藻. 次声的产生及生物效应[A]. 见：中国人民解放军总后勤部卫生部. 医药卫生科学技术进展[M]. 北京:军事医学科学出版社, 1997:194-197.
[3] Linquist S, Bullitt E. The heat-shock proteius[J]. Annu Rev Genet, 1986; 22:631-637.
[4] Zimarino V, Wu C. Induction of sequence-specific binding of Drosophila heat shock activator protein without protein synthesis[J]. Nature, 1987; 327(6124):727-730., http://www.100md.com