梭曼抗体酶研究Ⅱ：“潜过渡态”半抗原设计策略及其在梭曼抗体酶研究中的应用
杨日芳 恽榴红 王字玲 荣康泰
摘 要 目的：探索用化学免疫方法防治梭曼中毒。方法：提出“潜过渡态”半抗原设计策略，并据此设计、合成了新型半抗原和人工抗原。结果：该新型半抗原可成功诱导具有类酶活性的催化梭曼水解的抗体酶；还发现了一种新型的磷酰酯交换反应。结论：实验证明了该半抗原设计策略的有效性。该半抗原设计策略还可能应用于能诱生催化磷(膦)酸二酯水解的抗体酶的半抗原设计，以及应用于有类似酯酶、酰胺酶、肽酶或核苷酸活性的抗体酶的研究。
关键词：梭曼；半抗原设计策略；抗体酶；催化作用；膦酰酯交换；合成；免疫酶技术
催化抗体，又称为抗体酶(AbE)，不仅可被用作强效催化剂，也可用作治疗剂[1～3]。在催化抗体研究中，半抗原(Hap)的设计在制备AbE过程中具有较为重要的地位。现有的Hap设计策略有：稳定的过渡态类似物策略[4]、诱导-转换策略[5]、反应免疫策略[6]和互补电荷策略[7]。但通常所获得的催化抗体的活性较低，因而妨碍了其实际应用[8]。如何提高其催化活性，已成为抗体酶研究中越来越重要的课题。
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梭曼中毒能导致乙酰胆碱酯酶快速老化[9]，这种老化现象妨碍了以常用的酶重活化剂进行有效治疗[10]。以抗体作为梭曼的清除剂被认为是一种替代传统药物治疗的方法[11]，催化抗体不仅能中和，且能降解相应的抗原化合物，因此被认为是比中和抗体更有效的预防制剂[12]。
赵毅民等[13]以一个α-羟基膦酸酯P-4作为Hap，成功地获得了一个具有催化梭曼水解活性的抗体2B2B5。但这一催化抗体只有中等活性。为了提高AbE的催化活性，我们提出了一种新的半抗原设计策略，我们称之为“潜过渡态”半抗原设计策略，并据此设计、合成了一个新型半抗原。
1 “潜过渡态”半抗原设计策略及其依据
经过一个进化期或一个免疫应答的数周时间，通过产生和筛选巨大的蛋白质库，自然界解决了与分子识别相关的许多问题[14]。免疫体系赖以识别和区分外来抗原的机制就是产生巨大的、多样性抗体分子库[15]。免疫体系既能通过组合可变基因(V)、多样性基因(D)和连接基因(J)，继而亲和成熟产生巨大分子多样性；又能针对某一所需的专一性，快速筛选这一多样性[14]。这一过程与酶的自然进化有许多相似之处。酶进化也通过外显子重组和点突变产生分子多样性，并结合基于催化活性选择。只是抗体筛选是基于对稳定抗原的亲和力，酶进化则基于催化活性，而催化活性又与对高能的、瞬间的过渡态的亲和力相关[16]。自然进化和免疫应答的这些相似性提示，通过适当的化学诱导，免疫应答可沿着酶进化的同样途径产生催化抗体[16]。而免疫应答的可诱导性与短期特性，使得在数周内产生和进化高效的AbE成为可能。因此，为了开发抗体的催化潜力，必须给免疫体系提供与目标反应的限速步骤的反应过渡态相关的结构信息。
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许多研究人员认为酶催化的主要特征有以下五大类[17]：⑴酶-底物络合与底物“锚定”的熵效应，包括构象限制和接近效应；⑵将溶剂(包括作为竞争试剂的水和其他溶剂分子)从活性部位空穴中排斥出来，并产生一个有利于强化偶极-偶极、偶极-电荷和电荷-电荷相互作用的疏水腔；⑶结合能的传导，这是达到过渡态的关键因素，其中一部分结合焓以酶和(或)底物的构象限制的形式作为势能被保留，总体减少了催化所需克服的能垒，一般称为“过渡态稳定化作用”或“过渡态互补性”；⑷在酶的活性部位提供特异的化学基团，其中化学基团被固定、接近底物事实上就是速率加速因子的熵项，通常被描述为“有效浓度效应”；⑸活性部位的电子“调谐”，这依赖于蛋白结构中活性部位的环境与极性侧链的定位或多种残基所组成的偶极。
基于稳定过渡态类似物所诱生的AbE通常活性较低的主要原因可能是[8]：不能设计出可诱导理想的活性部位几何形状和官能度；底物结合与催化之间关系的脱离以及产生抗体的生物过程的功能缺陷。以稳定的过渡态类似物模拟过渡态的瞬间结构的能力缺陷通常是原因之一。过渡态结构中部分键级、延伸键长、扩展键价、扭曲键角和高度的电荷分离均不能或难以在任何稳定的有机分子中重现；而且，在任何稳定的有机分子中几乎不存在像过渡态结构中的部分键的形成与部分键的断裂，以及部分电荷形成和电荷分离。然而，酶似乎能在短距离内做到高梯度、整齐配置强作用力，而这恰是区分基态与过渡态之间微妙差异所必需的，也正是酶催化的高效所在。
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通过对催化抗体结合与催化的免疫根源的研究[15,16,18]可以发现，免疫体系解决分子识别依赖于许多不同策略——除了体细胞突变外，还包括构象多样性和多特异性。区分对过渡态的两类结合是有益的，即被动结合——指通常的分子识别，如氢键作用、疏水作用等，与主动结合——指在催化剂反应中心与底物之间的特殊作用；后者对催化作用至关重要，并随着反应的进行逐步地、显著地改变，有时还涉及反应中心官能团的部分共价键的形成与断裂，且常比一般分子识别的相互作用更强，于是它们代表着在结合底物和过渡态时最显著的差异[19]。
为了模拟上述性质，我们在此提出了一种新的半抗原设计策略—— “潜过渡态”半抗原设计策略，即可以设计这样一些半抗原，它们在近似生理条件下能互变异构化，或者产生一些易于进行的化学转化，其中通过一系列在结构和电子性质上均类似于目标反应过渡态的中间体或过渡态；并设想生物体能对这些中间体或过渡态作出适当的免疫应答，从而产生理想的催化抗体。
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在以Brsted酸和碱催化磷(膦)酸二酯键的断裂与异构化的动力学和机理研究中，许多RNA模拟物被设计、合成与研究。其中，在近似生理条件下，γ-或δ-羟基磷(膦)酸二酯的水解与相互转化通过一系列单阴离子或双阴离子磷(膦)烷中间体或过渡态进行[20,21]。Taira与Uchimaru等[22,23]认为，在酸与碱介质中，磷酰转移反应均通过五配位磷中间体进行，溶剂化作用可以稳定这些中间体，以致环状双阴离子磷(膦)烷可看作是有存活时间的中间体，而不只是过渡态；而相应的单阴离子中间体则更为稳定。据赵玉芬小组[24]报道，N-磷酰氨基酸与N-磷酰二肽可通过一个分子内混酐中间体——一个环状五配位磷烷自活化，并生成寡肽；还成功捕捉了一个假设的分子内磷酸-羧酸混酐中间体。
有机磷化合物如梭曼的水解被认为主要是通过一条涉及五配位三角双锥过渡态的序列关联机理进行的[25]。(氧)膦烷被认为是磷酸化反应好的过渡态类似物[26]，但这些化合物对水不稳定，因此难以将它们制成人工抗原[27]。
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我们依据“潜过渡态”半抗原设计策略设计、合成了γ-羟基膦酸二酯P-541作为半抗原(图1)，并认为在近似生理条件下，P-541可以通过一系列在结构与电学性质均类似于梭曼水解过渡态的中间体进行互变异构(图2)。我们还在半抗原制备中，应用了这种互变异构性质，进行(磷)膦酰酯交换，制备了γ-羟基混合膦酸二酯(图3)；若将γ-羟基进行苄基保护，则相应的反应不能进行。
图1 有关化合物的结构(Pin=频哪基)
图2 梭曼水解的可能机理与半抗原的互变异构
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图3 应用磷(膦)酰酯交换反应制备γ-羟基混合膦酸二酯的可能机理
2 实验部分
试剂为合格的化学试剂商品，熔点以毛细管法测定，温度计未经校正。元素分析仪型号为Carld Erba-1 106，红外光谱仪为Magna-IRTM550，核磁共振谱仪为JEOL GX400，质谱仪型号为VG ZabSpec。
2.1 2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸二甲酯
按照文献[28]的方法制备，产率95%，mp 162～164℃，文献[28]为162℃。
2.2 O1-甲基-O2-(1,2,2-三甲基丙基) 2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸(P-541)
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称取3.8 g(0.014 5 mol) 2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸二甲酯，置入反应瓶中，加入催化量的4-二甲氨基吡啶及35 ml干燥的乙二醇二甲醚，装上短分馏装置，在搅拌下加热，缓缓蒸出溶剂，使蒸出物沸点低于80℃，反应20 h，蒸去大部分溶剂，加入5 ml 2 mol/L HCl和水，以CH2Cl2(35 ml×4)提取，合并有机层，水洗一次；以20%K2CO3(25 ml×4)反提，少量水洗两次，合并水液，再以浓盐酸酸化至pH 1～2，再以CH2Cl2(40 ml×4)提取，合并有机层，水洗一次，然后无水硫酸钠干燥，回收溶剂，硅胶柱层析，CHCl3-AcOEt-AcOH(40∶2∶1)洗脱，第二组分即产物，得4.2 g，产率87.5%，mp 108～110℃；元素分析(C14H22NO6P):计算值(%) C 50.76,H 6.69,N 4.23;实测值(%) C 50.67,H 6.61,N4.31。 NMR(ppm,CDCl3) δH:0.8631 0.9455(2×s,9H,t-Bu),1.153 1.326(dd,3H,J3=6.11Hz,JH-P=18.97 Hz,CH3-C),3.20 ～3.30(m,2H,JH-P=21.36Hz),3.74～3.79(m,3H,CH3-O),4.20～4.32(m,1H,CH-O),6.90～6.94(dd,1H,J3=9.16Hz,J4=3.67 Hz,Ar-H),7.97～8.05(m,2H,Ar-H2);MS(m/z，FAB+):663.1(2M+H)+,332.1(M+H)+,316.1(M+H-O)+,302.1(M+H-OCH3)+,248.0[100%,(M+2H-Pin)+],231.0(M+H-OPin)+。
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2.3 人工抗原的制备
2.3.1 检测抗原 称取25 mg P-541,溶于10 ml甲醇,加入6 mg 10%Pd-C,于常温常压及搅拌下氢化12 h，滤去催化剂，少量醇洗涤，旋转蒸发溶剂；然后溶于5 ml 0.5 mol/L HCl,在搅拌及冰浴冷却下，滴入溶有16 mg亚硝酸钠的1 ml水液，滴毕，再反应1 h，即得重氮盐溶液；继而在搅拌下将上述溶液滴到溶有120 mg BSA(牛血清白蛋白)和400 mg碳酸
钠的5 ml水液，再反应1 h，然后以稀盐酸中和至pH 7，透析，冷冻干燥，即得检测抗原。
2.3.2 免疫抗原 称取15 mg P-541,溶于10 ml甲醇,加入4 mg 10%Pd-C,于常温常压及搅拌下氢化12 h，滤去催化剂，少量醇洗涤，旋转蒸发溶剂；然后溶于3 ml 0.5 mol/L HCl,在搅拌及冰冷下，滴入溶有10 mg亚硝酸钠的1 ml水液，滴毕，再反应1 h，即得重氮盐溶液；继而在搅拌下将上述溶液滴到溶有55 mg LPH(鲎血蓝蛋白)和267 mg碳酸钠的5 ml水液，再反应1 h，然后以稀盐酸中和至pH7，透析，冷冻干燥，即得免疫抗原。
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2.4 抗体酶EP6的制备
以免疫抗原主动免疫小鼠，分离总mRNA，制备cDNA，再应用噬菌体单链抗体组合库技术制备单链抗体库，经过以检测抗原筛选和酶联免疫竞争抑制实验评价，得到70株可结合梭曼的噬菌体抗体，其中11株能催化梭曼水解，经过凝胶过滤和离子交换的进一步纯化，得到相对分子质量为31 000单链抗体EP6；详细方法已另作报道[29]。
3 结果
3.1 EP6对梭曼水解的催化活性
应用HI93729氟离子检测仪检测梭曼水解生成的氟离子，发现抗体EP6催化梭曼水解符合米氏饱和动力学，其动力学参数见表1。
表1 抗体EP6和2B2B5的动力学参数
, http://www.100md.com 抗 体
Km(mol/L)
kuncat(s-1)
kcat(s-1)
kcat/kuncat
kcat/Km
(L.mol-1.s-1)
KTS=Km.kuncat/kcat
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(mol/L)
2B2B5
2.8×10-3
4.1×10-5
3.8×10-3
9.2×102
13.6
3.04×10-6
EP6
3.09×10-5
2.70×10-5
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3.30
1.22×105
1.07×105
2.53×10-10
酶
10-4～10-7
10～104
106～1017
105～108
10-11～10-24
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3.2 EP6对梭曼的抗毒活性
当将1.1×LD95梭曼与0.16 mg/kg EP6共孵1 h，然后皮下注射小鼠，所有的动物均存活；而注射同样剂量梭曼和磷酸缓冲溶液的对照组动物则在30 min内全部死亡。
当静脉注射10.9 mg/kg EP6 15 min后，给予1×LD95梭曼，该抗体酶能延长动物痉挛发作和死亡的迟滞时间。
4 讨论
从表1中可以看出，抗体酶EP6不仅成功地提高了催化速率kcat，同时还降低了Km值，即提高了对底物的亲和力，从而大大提高了催化活性；这也能从KTS降低了约4个数量级中得到体现——提示EP6对梭曼水解的反应过渡态亲和力大大得到提高；而纯粹以分子生物学方法进行催化抗体的离体进化，所得的成熟抗体一般在提高催化速率的同时，也提高了Km值，即牺牲了对底物的亲和力，总体而言对反应过渡态的亲和力提高不大[30]。然而，抗体酶的催化效率不仅与kcat相关，而且还与Km相关，当底物是一个毒物时，降低Km值，即提高对底物的亲和力，对于抗体酶的应用就显得更为实用[1]；这可从EP6所表现的整体动物抗毒效价中得到证明。
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实验结果证实，策略性应用自动反应或易于进行的反应，可以大大提高所诱生的催化抗体的催化活性，这一策略可能是成功模拟过渡态结构中部分键级、延伸键长、扩展键价、扭曲键角和高度的电荷分离的有效方法。这种潜过渡态半抗原设计策略也可能应用于核苷酸中磷酸二酯键的水解，还可能扩展到酯、氨基甲酸酯、酰胺与肽的水解反应中有关半抗原的设计；而在催化抗体的研究中，磷酸二酯键与肽键的形成与裂解具有更大的应用前景，却又是较难成功的领域。
[基金项目]总后重点基金资助项目(96Z015)
[作者简介]杨日芳(1968-)，男，湖南绥宁人，助理研究员，硕士。
杨日芳(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
恽榴红(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
, 百拇医药 王字玲(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
荣康泰(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
参考文献
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关键词：梭曼；半抗原设计策略；抗体酶；催化作用；膦酰酯交换；合成；免疫酶技术
催化抗体，又称为抗体酶(AbE)，不仅可被用作强效催化剂，也可用作治疗剂[1～3]。在催化抗体研究中，半抗原(Hap)的设计在制备AbE过程中具有较为重要的地位。现有的Hap设计策略有：稳定的过渡态类似物策略[4]、诱导-转换策略[5]、反应免疫策略[6]和互补电荷策略[7]。但通常所获得的催化抗体的活性较低，因而妨碍了其实际应用[8]。如何提高其催化活性，已成为抗体酶研究中越来越重要的课题。
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1 “潜过渡态”半抗原设计策略及其依据
经过一个进化期或一个免疫应答的数周时间，通过产生和筛选巨大的蛋白质库，自然界解决了与分子识别相关的许多问题[14]。免疫体系赖以识别和区分外来抗原的机制就是产生巨大的、多样性抗体分子库[15]。免疫体系既能通过组合可变基因(V)、多样性基因(D)和连接基因(J)，继而亲和成熟产生巨大分子多样性；又能针对某一所需的专一性，快速筛选这一多样性[14]。这一过程与酶的自然进化有许多相似之处。酶进化也通过外显子重组和点突变产生分子多样性，并结合基于催化活性选择。只是抗体筛选是基于对稳定抗原的亲和力，酶进化则基于催化活性，而催化活性又与对高能的、瞬间的过渡态的亲和力相关[16]。自然进化和免疫应答的这些相似性提示，通过适当的化学诱导，免疫应答可沿着酶进化的同样途径产生催化抗体[16]。而免疫应答的可诱导性与短期特性，使得在数周内产生和进化高效的AbE成为可能。因此，为了开发抗体的催化潜力，必须给免疫体系提供与目标反应的限速步骤的反应过渡态相关的结构信息。
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许多研究人员认为酶催化的主要特征有以下五大类[17]：⑴酶-底物络合与底物“锚定”的熵效应，包括构象限制和接近效应；⑵将溶剂(包括作为竞争试剂的水和其他溶剂分子)从活性部位空穴中排斥出来，并产生一个有利于强化偶极-偶极、偶极-电荷和电荷-电荷相互作用的疏水腔；⑶结合能的传导，这是达到过渡态的关键因素，其中一部分结合焓以酶和(或)底物的构象限制的形式作为势能被保留，总体减少了催化所需克服的能垒，一般称为“过渡态稳定化作用”或“过渡态互补性”；⑷在酶的活性部位提供特异的化学基团，其中化学基团被固定、接近底物事实上就是速率加速因子的熵项，通常被描述为“有效浓度效应”；⑸活性部位的电子“调谐”，这依赖于蛋白结构中活性部位的环境与极性侧链的定位或多种残基所组成的偶极。
基于稳定过渡态类似物所诱生的AbE通常活性较低的主要原因可能是[8]：不能设计出可诱导理想的活性部位几何形状和官能度；底物结合与催化之间关系的脱离以及产生抗体的生物过程的功能缺陷。以稳定的过渡态类似物模拟过渡态的瞬间结构的能力缺陷通常是原因之一。过渡态结构中部分键级、延伸键长、扩展键价、扭曲键角和高度的电荷分离均不能或难以在任何稳定的有机分子中重现；而且，在任何稳定的有机分子中几乎不存在像过渡态结构中的部分键的形成与部分键的断裂，以及部分电荷形成和电荷分离。然而，酶似乎能在短距离内做到高梯度、整齐配置强作用力，而这恰是区分基态与过渡态之间微妙差异所必需的，也正是酶催化的高效所在。
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通过对催化抗体结合与催化的免疫根源的研究[15,16,18]可以发现，免疫体系解决分子识别依赖于许多不同策略——除了体细胞突变外，还包括构象多样性和多特异性。区分对过渡态的两类结合是有益的，即被动结合——指通常的分子识别，如氢键作用、疏水作用等，与主动结合——指在催化剂反应中心与底物之间的特殊作用；后者对催化作用至关重要，并随着反应的进行逐步地、显著地改变，有时还涉及反应中心官能团的部分共价键的形成与断裂，且常比一般分子识别的相互作用更强，于是它们代表着在结合底物和过渡态时最显著的差异[19]。
为了模拟上述性质，我们在此提出了一种新的半抗原设计策略—— “潜过渡态”半抗原设计策略，即可以设计这样一些半抗原，它们在近似生理条件下能互变异构化，或者产生一些易于进行的化学转化，其中通过一系列在结构和电子性质上均类似于目标反应过渡态的中间体或过渡态；并设想生物体能对这些中间体或过渡态作出适当的免疫应答，从而产生理想的催化抗体。
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在以Brsted酸和碱催化磷(膦)酸二酯键的断裂与异构化的动力学和机理研究中，许多RNA模拟物被设计、合成与研究。其中，在近似生理条件下，γ-或δ-羟基磷(膦)酸二酯的水解与相互转化通过一系列单阴离子或双阴离子磷(膦)烷中间体或过渡态进行[20,21]。Taira与Uchimaru等[22,23]认为，在酸与碱介质中，磷酰转移反应均通过五配位磷中间体进行，溶剂化作用可以稳定这些中间体，以致环状双阴离子磷(膦)烷可看作是有存活时间的中间体，而不只是过渡态；而相应的单阴离子中间体则更为稳定。据赵玉芬小组[24]报道，N-磷酰氨基酸与N-磷酰二肽可通过一个分子内混酐中间体——一个环状五配位磷烷自活化，并生成寡肽；还成功捕捉了一个假设的分子内磷酸-羧酸混酐中间体。
有机磷化合物如梭曼的水解被认为主要是通过一条涉及五配位三角双锥过渡态的序列关联机理进行的[25]。(氧)膦烷被认为是磷酸化反应好的过渡态类似物[26]，但这些化合物对水不稳定，因此难以将它们制成人工抗原[27]。
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我们依据“潜过渡态”半抗原设计策略设计、合成了γ-羟基膦酸二酯P-541作为半抗原(图1)，并认为在近似生理条件下，P-541可以通过一系列在结构与电学性质均类似于梭曼水解过渡态的中间体进行互变异构(图2)。我们还在半抗原制备中，应用了这种互变异构性质，进行(磷)膦酰酯交换，制备了γ-羟基混合膦酸二酯(图3)；若将γ-羟基进行苄基保护，则相应的反应不能进行。
图1 有关化合物的结构(Pin=频哪基)
图2 梭曼水解的可能机理与半抗原的互变异构
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图3 应用磷(膦)酰酯交换反应制备γ-羟基混合膦酸二酯的可能机理
2 实验部分
试剂为合格的化学试剂商品，熔点以毛细管法测定，温度计未经校正。元素分析仪型号为Carld Erba-1 106，红外光谱仪为Magna-IRTM550，核磁共振谱仪为JEOL GX400，质谱仪型号为VG ZabSpec。
2.1 2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸二甲酯
按照文献[28]的方法制备，产率95%，mp 162～164℃，文献[28]为162℃。
2.2 O1-甲基-O2-(1,2,2-三甲基丙基) 2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸(P-541)
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称取3.8 g(0.014 5 mol) 2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸二甲酯，置入反应瓶中，加入催化量的4-二甲氨基吡啶及35 ml干燥的乙二醇二甲醚，装上短分馏装置，在搅拌下加热，缓缓蒸出溶剂，使蒸出物沸点低于80℃，反应20 h，蒸去大部分溶剂，加入5 ml 2 mol/L HCl和水，以CH2Cl2(35 ml×4)提取，合并有机层，水洗一次；以20%K2CO3(25 ml×4)反提，少量水洗两次，合并水液，再以浓盐酸酸化至pH 1～2，再以CH2Cl2(40 ml×4)提取，合并有机层，水洗一次，然后无水硫酸钠干燥，回收溶剂，硅胶柱层析，CHCl3-AcOEt-AcOH(40∶2∶1)洗脱，第二组分即产物，得4.2 g，产率87.5%，mp 108～110℃；元素分析(C14H22NO6P):计算值(%) C 50.76,H 6.69,N 4.23;实测值(%) C 50.67,H 6.61,N4.31。 NMR(ppm,CDCl3) δH:0.8631 0.9455(2×s,9H,t-Bu),1.153 1.326(dd,3H,J3=6.11Hz,JH-P=18.97 Hz,CH3-C),3.20 ～3.30(m,2H,JH-P=21.36Hz),3.74～3.79(m,3H,CH3-O),4.20～4.32(m,1H,CH-O),6.90～6.94(dd,1H,J3=9.16Hz,J4=3.67 Hz,Ar-H),7.97～8.05(m,2H,Ar-H2);MS(m/z，FAB+):663.1(2M+H)+,332.1(M+H)+,316.1(M+H-O)+,302.1(M+H-OCH3)+,248.0[100%,(M+2H-Pin)+],231.0(M+H-OPin)+。
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2.3 人工抗原的制备
2.3.1 检测抗原 称取25 mg P-541,溶于10 ml甲醇,加入6 mg 10%Pd-C,于常温常压及搅拌下氢化12 h，滤去催化剂，少量醇洗涤，旋转蒸发溶剂；然后溶于5 ml 0.5 mol/L HCl,在搅拌及冰浴冷却下，滴入溶有16 mg亚硝酸钠的1 ml水液，滴毕，再反应1 h，即得重氮盐溶液；继而在搅拌下将上述溶液滴到溶有120 mg BSA(牛血清白蛋白)和400 mg碳酸
钠的5 ml水液，再反应1 h，然后以稀盐酸中和至pH 7，透析，冷冻干燥，即得检测抗原。
2.3.2 免疫抗原 称取15 mg P-541,溶于10 ml甲醇,加入4 mg 10%Pd-C,于常温常压及搅拌下氢化12 h，滤去催化剂，少量醇洗涤，旋转蒸发溶剂；然后溶于3 ml 0.5 mol/L HCl,在搅拌及冰冷下，滴入溶有10 mg亚硝酸钠的1 ml水液，滴毕，再反应1 h，即得重氮盐溶液；继而在搅拌下将上述溶液滴到溶有55 mg LPH(鲎血蓝蛋白)和267 mg碳酸钠的5 ml水液，再反应1 h，然后以稀盐酸中和至pH7，透析，冷冻干燥，即得免疫抗原。
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2.4 抗体酶EP6的制备
以免疫抗原主动免疫小鼠，分离总mRNA，制备cDNA，再应用噬菌体单链抗体组合库技术制备单链抗体库，经过以检测抗原筛选和酶联免疫竞争抑制实验评价，得到70株可结合梭曼的噬菌体抗体，其中11株能催化梭曼水解，经过凝胶过滤和离子交换的进一步纯化，得到相对分子质量为31 000单链抗体EP6；详细方法已另作报道[29]。
3 结果
3.1 EP6对梭曼水解的催化活性
应用HI93729氟离子检测仪检测梭曼水解生成的氟离子，发现抗体EP6催化梭曼水解符合米氏饱和动力学，其动力学参数见表1。
表1 抗体EP6和2B2B5的动力学参数
, http://www.100md.com 抗 体
Km(mol/L)
kuncat(s-1)
kcat(s-1)
kcat/kuncat
kcat/Km
(L.mol-1.s-1)
KTS=Km.kuncat/kcat
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(mol/L)
2B2B5
2.8×10-3
4.1×10-5
3.8×10-3
9.2×102
13.6
3.04×10-6
EP6
3.09×10-5
2.70×10-5
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3.30
1.22×105
1.07×105
2.53×10-10
酶
10-4～10-7
10～104
106～1017
105～108
10-11～10-24
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3.2 EP6对梭曼的抗毒活性
当将1.1×LD95梭曼与0.16 mg/kg EP6共孵1 h，然后皮下注射小鼠，所有的动物均存活；而注射同样剂量梭曼和磷酸缓冲溶液的对照组动物则在30 min内全部死亡。
当静脉注射10.9 mg/kg EP6 15 min后，给予1×LD95梭曼，该抗体酶能延长动物痉挛发作和死亡的迟滞时间。
4 讨论
从表1中可以看出，抗体酶EP6不仅成功地提高了催化速率kcat，同时还降低了Km值，即提高了对底物的亲和力，从而大大提高了催化活性；这也能从KTS降低了约4个数量级中得到体现——提示EP6对梭曼水解的反应过渡态亲和力大大得到提高；而纯粹以分子生物学方法进行催化抗体的离体进化，所得的成熟抗体一般在提高催化速率的同时，也提高了Km值，即牺牲了对底物的亲和力，总体而言对反应过渡态的亲和力提高不大[30]。然而，抗体酶的催化效率不仅与kcat相关，而且还与Km相关，当底物是一个毒物时，降低Km值，即提高对底物的亲和力，对于抗体酶的应用就显得更为实用[1]；这可从EP6所表现的整体动物抗毒效价中得到证明。
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实验结果证实，策略性应用自动反应或易于进行的反应，可以大大提高所诱生的催化抗体的催化活性，这一策略可能是成功模拟过渡态结构中部分键级、延伸键长、扩展键价、扭曲键角和高度的电荷分离的有效方法。这种潜过渡态半抗原设计策略也可能应用于核苷酸中磷酸二酯键的水解，还可能扩展到酯、氨基甲酸酯、酰胺与肽的水解反应中有关半抗原的设计；而在催化抗体的研究中，磷酸二酯键与肽键的形成与裂解具有更大的应用前景，却又是较难成功的领域。
[基金项目]总后重点基金资助项目(96Z015)
[作者简介]杨日芳(1968-)，男，湖南绥宁人，助理研究员，硕士。
杨日芳(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
恽榴红(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
, 百拇医药 王字玲(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
荣康泰(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
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