细胞间粘附分子重组蛋白的表达与单克隆抗体的制备
细胞间粘附分子重组蛋白的表达与单克隆抗体的制备
孔祥英 罗振革 彭虹 陈志华 易绍琼 高杰英
关键词：细胞粘连分子；重组蛋白类；抗体，单克隆
细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是属于免疫球蛋白超家族的一类粘附分子,其配体是β2整合素的两个成员:LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)。ICAM-1与其配体的结合具有重要的免疫学功能:首先它介导了T细胞和NK细胞对靶细胞的杀伤作用;其次它还是T细胞激活的共刺激信号之一，在白细胞与血管内皮细胞的粘附中起重要作用;另外ICAM-1是鼻病毒的受体,还参与肿瘤细胞的转移。ICAM-1已成为抗炎症治疗的重要靶标。本文报道了重组ICAM-1的表达及单克隆抗体的制备及鉴定。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 质粒
pEX31c,大肠杆菌融合蛋白表达载体；pPUC/ICAM-1,含有人ICAM-1的全长cDNA。
1.2 菌株
E.coli W6用于pEX-ICAM-1重组质粒的构建；E.coli RR1(pCI857)用于重组蛋白的表达。
1.3 单克隆抗体
anti-hICAM-1单克隆抗体购自Santa Cruz公司,能阻断LFA-1/ICAM-1依赖的细胞粘附,用于重组ICAM-1免疫原性的鉴定。
1.4 ICAM-1表达载体的构建
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用BamHⅠ和BglⅡ将ICAM-1的胞外区cDNA片段切出,克隆到经同样酶切处理的pEX31c质粒,转化E.coli W6,即构成重组质粒pEX/ICAM-1。
1.5 ICAM-1重组蛋白的表达、纯化与鉴定
将pEX/ICAM-1导入E.coli RR1(pCI857),30℃培养，而后转入42℃，进行温控诱导，SDS-PAGE分析ICAM-1重组蛋白的表达；将有MS2-ICAM-1融合蛋白表达的培养菌用超声裂解，离心后，经数次洗涤，将包涵体溶于8 mol/L尿素中，获得初步纯化的重组蛋白。用ELISA和蛋白质印迹法检测重组蛋白的免疫原性。
1.6 ICAM-1单克隆抗体的制备与鉴定
用初步纯化的ICAM-1重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，以具有共同载体部分的MS2-CD44重组蛋白为阴性对照筛选阳性克隆。为了分析制备的单克隆抗体是否与天然ICAM-1分子结合，用免疫荧光法进行鉴定。用终浓度为10 μg/ml的PMA诱导U937细胞48 h,与终浓度10 μg/ml的单克隆抗体结合(无关抗体为阴性对照)，而后用FITC-羊抗鼠IgG进行染色，流式细胞术进行观察。
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2 结果和讨论
2.1 重组ICAM-1的表达
本室曾将ICAM-1完整的cDNA克隆到pGEX-3X表达载体中,导入E.coli并经IPTG诱导后没有获得重组蛋白的表达。我们分析ICAM-1跨膜区富含疏水性氨基酸,可能影响重组蛋白的表达。因此去掉ICAM-1的跨膜区和胞内区部分,将其编码胞外区的cDNA片段克隆到pEX-31c质粒中,构建了表达载体pEX/ICAM-1,将其导入含有pCI857阻遏子质粒的大肠杆菌RR1,经42℃温控诱导获得了重组蛋白的表达(图1),此蛋白为MS2聚合酶与ICAM-1胞外区的融合蛋白,相对分子质量为66 000,与预期大小一致,在宿主中以包涵体的形式存在,对包涵体进行了初步纯化。
2.2 重组ICAM-1免疫原性的鉴定
重组蛋白溶于8 mol/L尿素未经复性,只保留一级结构决定簇。鉴定用的单克隆抗体能阻断LFA-1与ICAM-1的结合,识别的是活性表位。ELISA和蛋白质印迹结果均显示重组ICAM-1蛋白能与抗ICAM-1的单克隆抗体发生特异反应,证明大肠杆菌中表达的ICAM-1分子具有天然ICAM-1的抗原决定簇,能用于ICAM-1抗体的制备及进一步的功能研究。同时也间接证明其中的一级结构表位介入了LFA-1/ICAM-1的相互作用。
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图1 SDS-PAGE分析重组蛋白表达
1.相对分子质量标准；2,3.空载受体菌阴性对照；
4.温控诱导2 h重组蛋白表达；5.温控诱导4 h重组蛋白表达
2.3 ICAM-1单克隆抗体的制备
共获得14株抗ICAM-1重组蛋白的单克隆抗体，分属IgG1、2a、2b亚类，这些单克隆抗体与MS2-ICAM-1呈阳性结合，与MS2-CD44不能结合，说明识别的是重组蛋白的ICAM-1部分。
2.4 ICAM-1单克隆抗体的鉴定
据文献报道，U937细胞经PMA诱导，其ICAM-1的表达大大提高。因此，用PMA诱导的U937细胞鉴定制备的单克隆抗体是否与天然ICAM-1结合。结果显示，14株单克隆抗体中12株均显示与诱导的U937结合，荧光强度阳性率从20.52%至78.04%不等，说明各株单克隆抗体识别表位在天然ICAM-1分子上的暴露情况有区别。图2显示4E5 单克隆抗体的流式细胞术结果，荧光阳性率为78.04%。本项工作为ICAM-1分子结构与功能研究奠定了基础。
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图2 流式细胞术分析ICAM-1单克隆抗体与U937细胞的结合
A.经PMA诱导的U937细胞+FITC-羊抗鼠IgG;B.经PMA诱导的U937细胞+4E5单克隆抗体+FITC-羊抗鼠IgG
[作者简介] 孔祥英(1943-)，女，江苏兴化人，高级实验师。
孔祥英(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
罗振革(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
彭虹(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
陈志华(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
易绍琼(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
高杰英(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850), http://www.100md.com
孔祥英 罗振革 彭虹 陈志华 易绍琼 高杰英
关键词：细胞粘连分子；重组蛋白类；抗体，单克隆
细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是属于免疫球蛋白超家族的一类粘附分子,其配体是β2整合素的两个成员:LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)。ICAM-1与其配体的结合具有重要的免疫学功能:首先它介导了T细胞和NK细胞对靶细胞的杀伤作用;其次它还是T细胞激活的共刺激信号之一，在白细胞与血管内皮细胞的粘附中起重要作用;另外ICAM-1是鼻病毒的受体,还参与肿瘤细胞的转移。ICAM-1已成为抗炎症治疗的重要靶标。本文报道了重组ICAM-1的表达及单克隆抗体的制备及鉴定。
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1 材料与方法
1.1 质粒
pEX31c,大肠杆菌融合蛋白表达载体；pPUC/ICAM-1,含有人ICAM-1的全长cDNA。
1.2 菌株
E.coli W6用于pEX-ICAM-1重组质粒的构建；E.coli RR1(pCI857)用于重组蛋白的表达。
1.3 单克隆抗体
anti-hICAM-1单克隆抗体购自Santa Cruz公司,能阻断LFA-1/ICAM-1依赖的细胞粘附,用于重组ICAM-1免疫原性的鉴定。
1.4 ICAM-1表达载体的构建
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用BamHⅠ和BglⅡ将ICAM-1的胞外区cDNA片段切出,克隆到经同样酶切处理的pEX31c质粒,转化E.coli W6,即构成重组质粒pEX/ICAM-1。
1.5 ICAM-1重组蛋白的表达、纯化与鉴定
将pEX/ICAM-1导入E.coli RR1(pCI857),30℃培养，而后转入42℃，进行温控诱导，SDS-PAGE分析ICAM-1重组蛋白的表达；将有MS2-ICAM-1融合蛋白表达的培养菌用超声裂解，离心后，经数次洗涤，将包涵体溶于8 mol/L尿素中，获得初步纯化的重组蛋白。用ELISA和蛋白质印迹法检测重组蛋白的免疫原性。
1.6 ICAM-1单克隆抗体的制备与鉴定
用初步纯化的ICAM-1重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，以具有共同载体部分的MS2-CD44重组蛋白为阴性对照筛选阳性克隆。为了分析制备的单克隆抗体是否与天然ICAM-1分子结合，用免疫荧光法进行鉴定。用终浓度为10 μg/ml的PMA诱导U937细胞48 h,与终浓度10 μg/ml的单克隆抗体结合(无关抗体为阴性对照)，而后用FITC-羊抗鼠IgG进行染色，流式细胞术进行观察。
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2 结果和讨论
2.1 重组ICAM-1的表达
本室曾将ICAM-1完整的cDNA克隆到pGEX-3X表达载体中,导入E.coli并经IPTG诱导后没有获得重组蛋白的表达。我们分析ICAM-1跨膜区富含疏水性氨基酸,可能影响重组蛋白的表达。因此去掉ICAM-1的跨膜区和胞内区部分,将其编码胞外区的cDNA片段克隆到pEX-31c质粒中,构建了表达载体pEX/ICAM-1,将其导入含有pCI857阻遏子质粒的大肠杆菌RR1,经42℃温控诱导获得了重组蛋白的表达(图1),此蛋白为MS2聚合酶与ICAM-1胞外区的融合蛋白,相对分子质量为66 000,与预期大小一致,在宿主中以包涵体的形式存在,对包涵体进行了初步纯化。
2.2 重组ICAM-1免疫原性的鉴定
重组蛋白溶于8 mol/L尿素未经复性,只保留一级结构决定簇。鉴定用的单克隆抗体能阻断LFA-1与ICAM-1的结合,识别的是活性表位。ELISA和蛋白质印迹结果均显示重组ICAM-1蛋白能与抗ICAM-1的单克隆抗体发生特异反应,证明大肠杆菌中表达的ICAM-1分子具有天然ICAM-1的抗原决定簇,能用于ICAM-1抗体的制备及进一步的功能研究。同时也间接证明其中的一级结构表位介入了LFA-1/ICAM-1的相互作用。
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图1 SDS-PAGE分析重组蛋白表达
1.相对分子质量标准；2,3.空载受体菌阴性对照；
4.温控诱导2 h重组蛋白表达；5.温控诱导4 h重组蛋白表达
2.3 ICAM-1单克隆抗体的制备
共获得14株抗ICAM-1重组蛋白的单克隆抗体，分属IgG1、2a、2b亚类，这些单克隆抗体与MS2-ICAM-1呈阳性结合，与MS2-CD44不能结合，说明识别的是重组蛋白的ICAM-1部分。
2.4 ICAM-1单克隆抗体的鉴定
据文献报道，U937细胞经PMA诱导，其ICAM-1的表达大大提高。因此，用PMA诱导的U937细胞鉴定制备的单克隆抗体是否与天然ICAM-1结合。结果显示，14株单克隆抗体中12株均显示与诱导的U937结合，荧光强度阳性率从20.52%至78.04%不等，说明各株单克隆抗体识别表位在天然ICAM-1分子上的暴露情况有区别。图2显示4E5 单克隆抗体的流式细胞术结果，荧光阳性率为78.04%。本项工作为ICAM-1分子结构与功能研究奠定了基础。
, 百拇医药
图2 流式细胞术分析ICAM-1单克隆抗体与U937细胞的结合
A.经PMA诱导的U937细胞+FITC-羊抗鼠IgG;B.经PMA诱导的U937细胞+4E5单克隆抗体+FITC-羊抗鼠IgG
[作者简介] 孔祥英(1943-)，女，江苏兴化人，高级实验师。
孔祥英(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
罗振革(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
彭虹(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
陈志华(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
易绍琼(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850)
高杰英(军事医学科学院微生物学流行病学研究所, 北京 100850), http://www.100md.com