基因突变的分子生物学方法检测及其在新药临床前遗传毒性评价中的应用前景
刘永学 纪学武 高沛永
摘 要 对基因突变检测的常用分子生物学方法，包括单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)检测、异源双链核酸分子分析(heteroduplex analysis, HDA)、蛋白截短试验(protein truncation test, PTT)和错配化学裂解法(chemical cleavage of mismatch, CCM)等进行了综述；详尽介绍了一种最新的基因突变检测方法——转换限制性酶切位点突变分析法(inverse restriction site mutation, iRSM)，并预测了上述突变检测方法在新药临床前遗传毒性检测中的应用前景。
关键词：基因突变；分子生物学；遗传毒性；转换限制性酶切位点突变分析法
基因突变在肿瘤及遗传病的发生、发展过程中起着重要作用，因此，基因突变的检测倍受关注。近几年，随着分子生物学理论和技术的快速发展及广泛应用，以PCR技术为核心的突变检测方法应运而生，它们在基因结构和功能的关系、疾病的基因诊断以及未知基因突变的检出等方面得到了广泛的应用[1]。现行新药临床前遗传毒性的检测亟需引入新方法和新技术，以适应新药开发和生产对安全性的更高要求，基因突变检测新技术的发展为此提供了可能。本文以最新的转换限制性酶切位点突变分析法(iRSM)为主，对当前基因突变检测的分子生物学方法进行了综述，同时对它们在新药临床前遗传毒性检测中的应用前景进行了分析。
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1 常用基因突变分析方法
1.1 单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)
1.1.1 原理及主要步骤[2] DNA的一级结构决定其构象形态，而构象不同的单链DNA片段在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中的泳动速率不同，所以一旦DNA片段的碱基组成发生变化，就可在电泳中表现出来，这正是SSCP分析法检测DNA突变的原理。将待测DNA片段进行PCR扩增后再进行SSCP分析，就是所谓的PCR-SSCP分析法。该方法的主要步骤有：模板DNA的制备；PCR扩增及产物的变性；PAGE和结果分析。PCR产物通常在甲酰胺溶液中加热变性，变性的DNA单链进行PAGE，如果电泳结果出现碱基变异的DNA带型，则可进行测序以精确定位变异碱基。
1.1.2 检测范围及不足 PCR-SSCP方法相对简单，被广泛用于未知基因的突变分析。但它同其他多数检测方法一样，不能检出所有的突变，而且，随着待检DNA片段大小的增加，迁移率的改变明显减小，因此该方法对较小DNA片段的突变检出率较高，尤其适合于200 bp以内的靶DNA，对大片段DNA突变的检出率则较低。此外，为了提高灵敏度，该方法要求较恒定的电泳温度及胶中适当的甘油浓度。鉴于此，研究者对最初的SSCP做了方法上的改进，尤其在PCR扩增引物设计和电泳产物的染色鉴定等方面改进较多[3～5]。另外，以RNA为检测靶还可明显提高大片段的突变检出率。
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1.2 异源双链核酸分子分析(heteroduplex analysis, HDA)
该方法原理与SSCP相似，但它分离的是双链，而SSCP分离单链。所谓异源双链(也称杂合双链)是指由突变和野生型DNA形成的杂合双链DNA分子，它在错配处形成一个凸起，在非变性凝胶电泳时出现与同源双链DNA不同的电泳速度，因而可将野生型和突变型双链DNA分开[6]。HDA对200～300 bp大小DNA的突变检测效果较好，且对SSCP法不敏感的DNA片段检出率很高，因此二者联合应用可大大提高突变的检出率[7]。
1.3 蛋白截短试验(protein truncation test,PTT)[8]
由于基因的表达产物是蛋白质，因此基因突变的结果往往会在蛋白质水平上有所反映。本方法就是从蛋白质水平的变化来检测基因突变，它主要检测导致开放阅读框架改变的碱基缺失或插入突变等。检测时须提取细胞mRNA，将待测靶基因逆转录为cDNA，所用逆转录引物含一段T7启动子和真核细胞翻译起始序列，逆转录产物在无细胞提取液中翻译为相应的蛋白质。如果基因突变导致了开放阅读框架的改变，那么合成的蛋白质经SDS-PAGE分离时会出现比正常蛋白质或长或短的蛋白产物。本方法的优点是突变检出率高，并可检测4～5 kb片段的突变；缺点是不能检测不影响开放阅读框架的突变，且需要抽提组织mRNA。
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1.4 错配化学裂解法(chemical cleavage of mismatch, CCM)[9]
突变DNA与野生DNA混合变性杂交时，因突变点的存在，双链不能完全结合并出现错配游离部位。错配的C可被羟胺和哌叮切割；错配的T能被四氧化锇切割，切割产物经凝胶电泳分析即可确定有否突变。其优点是能对长达2 kb的片段进行突变部位分析，缺点是步骤繁琐，所需化学试剂对人体有害。碳化二亚胺 (carbodiimide, CDI)检测、酶促错配切割(enzyme mismatch cleavage, EMC)与CCM原理类似，都是针对双链错配部位而进行的核酸片段突变检测手段。
除上述几种常用突变检测手段外，近几年围绕限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)方法改进较多，也相应地形成了灵敏度高、特异性强的突变检测手段，如切割片段长度多态性(cleavage fragment length polymorphism, CFLP)分析以及转换限制性酶切位点突变(iRSM)分析法。此外，DNA芯片技术的进一步发展和完善也会在未来大规模基因突变检测中大显身手。
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2 转换限制性酶切位点突变分析法(inverse restriction site mutation, iRSM)
iRSM方法由英国威尔士大学分子遗传和毒理中心建立并完善，于1999年首次公开发表[10]。该方法是在限制性片段长度多态性(RFLP)和限制性位点突变(RSM)分析方法基础上发展而来的，但RFLP仅能检测出明显突变所致的多态性，即它只能检测出大于1%的突变率，远远不能满足某些低突变发生率位点的检测要求[11,12]；RSM主要检测因突变所致原酶切识别位点不被识别的变化，尚不能直接确定突变碱基的性质改变[13,14]；iRSM则可检测因突变致使原酶切位点转换为另一新的酶切位点的变化，而且检测步骤简化，检出效率提高，因此，iRSM既快速敏感，又能直接确定突变碱基的性质，应当说是一种较具实用价值和生命力的突变检测手段，尤其在致突性质相对固定的化学致突剂所致突变的检测中将会得到较大的应用。
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2.1 原理和主要步骤
iRSM工作的基础是DNA的碱基变化发生在某些限制性酶切位点序列内，而这些突变又导致了新的限制性酶切位点的产生。图1以ApaⅠ→AvaⅡ突变检测为例描述了iRSM方法的原理和主要步骤:即提取细胞DN，对照组含有野生型ApaⅠ位点，实验组DNA除ApaⅠ外还有突变体AvaⅡ位点。首先，以ApaⅠ限制性核酸内切酶将DNA进行消化，消化产物中ApaⅠ位点被破坏，AvaⅡ位点被保留，从而使AvaⅡ位点易于被鉴定；第二，以消化产物为模板，以跨酶切位点区域的引物进行PCR扩增，实验组扩增产物含有残留的未被切割的ApaⅠ位点和大量的突变体AvaⅡ位点；第三，再以AvaⅡ内切酶对扩增产物进行酶切反应，实验组因含有大量的AvaⅡ位点而被切割，最后通过PAGE分离就可以将AvaⅡ酶切产物予以鉴定。其他突变位点的检测原理和步骤与之类似。理论上推算，iRSM的检测灵敏度为3×10-6，但要在凝胶上明显地辨认酶切产物，约需含有10个突变体的DNA模板，因此，实际上该法的灵敏度在10-5数量级，若结合其他位点分析，还可以将突变检测灵敏度大大提高。
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图1 iRSM检测ApaⅠ→AvaⅡ酶切位点转换突变的原理和主要步骤
2.2 应用范围
iRSM适用于快速检测诱变剂所致体内外DNA的突变，但这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点。该方法建立者Jenkins等首先将iRSM应用于化学诱变剂所致动物体内p53基因的突变检测，取得了良好的结果：小鼠分别口服N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3 d后，以iRSM方法相应地检测小鼠脾、骨髓和肝组织p53基因第6内含子区域的ApaⅠ→AvaⅡ位点转换突变。结果表明ENU诱发肝组织p53基因突变的发生率为33%，DMH诱发骨髓突变的发生率为13%，2-AAF使肝组织突变的发生率为25%，这一阳性突变率反映出了不同诱变剂对相应组织的致突作用强度，进一步验证了该方法的高灵敏度和准确性。为了比较iRSM与RFLP的灵敏度，Jenkins等在同一条件下以RFLP法对ENU处理组小鼠肝组织进行了p53基因突变的检测，结果显示RFLP不能检测到相应的突变；此外，利用iRSM还对小鼠p53基因其他多个位点突变(HaeⅢ→AvaⅡ, MspⅠ→EcoRⅠ, NarⅠ→HaeⅢ等)进行了成功的检测，多位点的检测可以大大提高诱变剂致突作用的检出率。我们正将该方法应用于动物体内及体外培养细胞DNA突变的检测，希望能将iRSM的应用范围进一步扩展，以期用于某些类别化合物的致突作用检测。
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2.3 优点及局限性
从iRSM分析方法的工作原理不难看出，它具有灵敏度高、快速、操作简便以及突变检测部位明确等优点。例如，iRSM检测突变的灵敏度是RFLP的1 000倍，而且只要结合其他酶切位点，分析还可进一步提高灵敏度；在操作步骤上仅需两次PCR扩增和一次PAGE检测；由于检测的突变变化部位是酶切位点之间的变化，因而碱基突变类型明确。但是，iRSM的不足之处是仅能检测诱发限制性酶切位点转换的DNA突变。根据文献资料分析，化合物致突的发生具有一定的规律性，并非随机出现在任意部位，即结构类似的一组化合物常常引起一些特定序列较固定的碱基改变。例如，烷化剂和芳香胺类最易使一连串鸟嘌呤(G)的3′端G发生突变[15,16]，这可能与该部位电荷密集有关，多数活性氧生成物质的DNA致突作用也具有类似规律[17]；CpG二核苷常常是DNA加成物的致突作用部位[18]，所以CpG突变的检测在化合物致突检测中具有重要意义，而CpG突变常引发某些固定酶切位点的变化。很显然，iRSM可较广泛地应用于遗传毒性化合物致突作用的检测。
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3 现行突变检测手段与新药临床前遗传毒性评价
随着肿瘤分子生物学的发展和人类基因组计划的逐步实施，各国对新药开发过程中临床前遗传毒性的检测备加重视。如果说药物的急、慢毒性作用较为短暂的话，那么药物的遗传毒性作用则更为深远，也更为严重，因此遗传毒性的检测也就显得更加重要。由于现行新药临床前遗传毒性检测方法仅能从最终生物学效应对突变作用进行认定，还不能确定突变部位和类型，更不能从突变发生的根本机制上检测药物的致突作用，因此，现行检测方法需要进一步深化和完善。目前，西方发达国家在新药安全性评价中要求引入最新的分子生物学方法和技术，加强“三致”试验的检测。上述分子生物学突变检测方法各有优点，但又存在各自的局限性，难以适应所有药物致突作用的检测和评价。可见，要建立完全替代现行致突检测手段的新的分子生物学方法，还有赖于分子生物学及相关学科理论和技术的进一步发展。可以肯定，在不久的将来，利用某一个或一组分子生物学突变检测方法来完善、替代现行新药遗传毒性检测手段，是本研究领域的发展方向和必然。
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[作者简介] 刘永学(1966-)，男，山东安丘人，副研究员，博士。
刘永学(军事医学科学院放射医学研究所, 北京 100850)
纪学武(解放军37221部队)
高沛永(军事医学科学院放射医学研究所, 北京 100850)
参考文献
[1] Ceccherini I, Seri M, Romeo G. Strategies for the identification of intron-exon boundaries and of point mutations: the example of the RET proto-oncogene[J]. Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1996, 9(1): 98.
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[2] Orita M, Iwahana H, Hayashi K，et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation polymorphisms[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(8): 2766.
[3] Reeve MA, Fuller CW. A novel thermostable polymerase for DNA sequencing[J]. Nature, 1995, 376(6534): 796.
[4] Chadwick RB, Conrad MP, McGinnis MD，et al. Heterozygote and mutation detection by direct automated fluorescent DNA sequencing using a mutant Taq DNA polymerase[J]. BioTechniques, 1996, 20(4): 676.
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[5] Chiarelli I, Porfirio B, Mattiuz Pl，et al. A method for point mutation analysis that links SSCP and dye primer fluorescent sequencing[J]. Mol Cell Probes, 1998, 12(3):125.
[6] Nagamine CM, Chan K, Lau CYF. A PCR artifact: generation of heteroduplexes[J]. Am J Human Genet, 1989, 45(2): 337.
[7] Axton RA, Hanson IM, Love J ，et al. Combined SSCP/heteroduplex analysis in the screening for PAX mutation[J]. Mol Cell Probes, 1997, 11(4):287.
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[15] Richardsen FC, Richardsen KK. Sequence dependent formation of alkyl-DNA adducts: a review of methods, results and biological correlates[J]. Mutat Res, 1990, 233(1-2): 127.
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[16] Sendowski K, Rajewki MF. DNA sequence dependence of guanine O-6 alkylation by the N-nitroso carcinogens N-methyl-N-nitrosourea and N-ethyl-N-nitrosourea[J]. Mutat Res, 1991, 250(1-2): 153.
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摘 要 对基因突变检测的常用分子生物学方法，包括单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)检测、异源双链核酸分子分析(heteroduplex analysis, HDA)、蛋白截短试验(protein truncation test, PTT)和错配化学裂解法(chemical cleavage of mismatch, CCM)等进行了综述；详尽介绍了一种最新的基因突变检测方法——转换限制性酶切位点突变分析法(inverse restriction site mutation, iRSM)，并预测了上述突变检测方法在新药临床前遗传毒性检测中的应用前景。
关键词：基因突变；分子生物学；遗传毒性；转换限制性酶切位点突变分析法
基因突变在肿瘤及遗传病的发生、发展过程中起着重要作用，因此，基因突变的检测倍受关注。近几年，随着分子生物学理论和技术的快速发展及广泛应用，以PCR技术为核心的突变检测方法应运而生，它们在基因结构和功能的关系、疾病的基因诊断以及未知基因突变的检出等方面得到了广泛的应用[1]。现行新药临床前遗传毒性的检测亟需引入新方法和新技术，以适应新药开发和生产对安全性的更高要求，基因突变检测新技术的发展为此提供了可能。本文以最新的转换限制性酶切位点突变分析法(iRSM)为主，对当前基因突变检测的分子生物学方法进行了综述，同时对它们在新药临床前遗传毒性检测中的应用前景进行了分析。
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1 常用基因突变分析方法
1.1 单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)
1.1.1 原理及主要步骤[2] DNA的一级结构决定其构象形态，而构象不同的单链DNA片段在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中的泳动速率不同，所以一旦DNA片段的碱基组成发生变化，就可在电泳中表现出来，这正是SSCP分析法检测DNA突变的原理。将待测DNA片段进行PCR扩增后再进行SSCP分析，就是所谓的PCR-SSCP分析法。该方法的主要步骤有：模板DNA的制备；PCR扩增及产物的变性；PAGE和结果分析。PCR产物通常在甲酰胺溶液中加热变性，变性的DNA单链进行PAGE，如果电泳结果出现碱基变异的DNA带型，则可进行测序以精确定位变异碱基。
1.1.2 检测范围及不足 PCR-SSCP方法相对简单，被广泛用于未知基因的突变分析。但它同其他多数检测方法一样，不能检出所有的突变，而且，随着待检DNA片段大小的增加，迁移率的改变明显减小，因此该方法对较小DNA片段的突变检出率较高，尤其适合于200 bp以内的靶DNA，对大片段DNA突变的检出率则较低。此外，为了提高灵敏度，该方法要求较恒定的电泳温度及胶中适当的甘油浓度。鉴于此，研究者对最初的SSCP做了方法上的改进，尤其在PCR扩增引物设计和电泳产物的染色鉴定等方面改进较多[3～5]。另外，以RNA为检测靶还可明显提高大片段的突变检出率。
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1.2 异源双链核酸分子分析(heteroduplex analysis, HDA)
该方法原理与SSCP相似，但它分离的是双链，而SSCP分离单链。所谓异源双链(也称杂合双链)是指由突变和野生型DNA形成的杂合双链DNA分子，它在错配处形成一个凸起，在非变性凝胶电泳时出现与同源双链DNA不同的电泳速度，因而可将野生型和突变型双链DNA分开[6]。HDA对200～300 bp大小DNA的突变检测效果较好，且对SSCP法不敏感的DNA片段检出率很高，因此二者联合应用可大大提高突变的检出率[7]。
1.3 蛋白截短试验(protein truncation test,PTT)[8]
由于基因的表达产物是蛋白质，因此基因突变的结果往往会在蛋白质水平上有所反映。本方法就是从蛋白质水平的变化来检测基因突变，它主要检测导致开放阅读框架改变的碱基缺失或插入突变等。检测时须提取细胞mRNA，将待测靶基因逆转录为cDNA，所用逆转录引物含一段T7启动子和真核细胞翻译起始序列，逆转录产物在无细胞提取液中翻译为相应的蛋白质。如果基因突变导致了开放阅读框架的改变，那么合成的蛋白质经SDS-PAGE分离时会出现比正常蛋白质或长或短的蛋白产物。本方法的优点是突变检出率高，并可检测4～5 kb片段的突变；缺点是不能检测不影响开放阅读框架的突变，且需要抽提组织mRNA。
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1.4 错配化学裂解法(chemical cleavage of mismatch, CCM)[9]
突变DNA与野生DNA混合变性杂交时，因突变点的存在，双链不能完全结合并出现错配游离部位。错配的C可被羟胺和哌叮切割；错配的T能被四氧化锇切割，切割产物经凝胶电泳分析即可确定有否突变。其优点是能对长达2 kb的片段进行突变部位分析，缺点是步骤繁琐，所需化学试剂对人体有害。碳化二亚胺 (carbodiimide, CDI)检测、酶促错配切割(enzyme mismatch cleavage, EMC)与CCM原理类似，都是针对双链错配部位而进行的核酸片段突变检测手段。
除上述几种常用突变检测手段外，近几年围绕限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)方法改进较多，也相应地形成了灵敏度高、特异性强的突变检测手段，如切割片段长度多态性(cleavage fragment length polymorphism, CFLP)分析以及转换限制性酶切位点突变(iRSM)分析法。此外，DNA芯片技术的进一步发展和完善也会在未来大规模基因突变检测中大显身手。
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2 转换限制性酶切位点突变分析法(inverse restriction site mutation, iRSM)
iRSM方法由英国威尔士大学分子遗传和毒理中心建立并完善，于1999年首次公开发表[10]。该方法是在限制性片段长度多态性(RFLP)和限制性位点突变(RSM)分析方法基础上发展而来的，但RFLP仅能检测出明显突变所致的多态性，即它只能检测出大于1%的突变率，远远不能满足某些低突变发生率位点的检测要求[11,12]；RSM主要检测因突变所致原酶切识别位点不被识别的变化，尚不能直接确定突变碱基的性质改变[13,14]；iRSM则可检测因突变致使原酶切位点转换为另一新的酶切位点的变化，而且检测步骤简化，检出效率提高，因此，iRSM既快速敏感，又能直接确定突变碱基的性质，应当说是一种较具实用价值和生命力的突变检测手段，尤其在致突性质相对固定的化学致突剂所致突变的检测中将会得到较大的应用。
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2.1 原理和主要步骤
iRSM工作的基础是DNA的碱基变化发生在某些限制性酶切位点序列内，而这些突变又导致了新的限制性酶切位点的产生。图1以ApaⅠ→AvaⅡ突变检测为例描述了iRSM方法的原理和主要步骤:即提取细胞DN，对照组含有野生型ApaⅠ位点，实验组DNA除ApaⅠ外还有突变体AvaⅡ位点。首先，以ApaⅠ限制性核酸内切酶将DNA进行消化，消化产物中ApaⅠ位点被破坏，AvaⅡ位点被保留，从而使AvaⅡ位点易于被鉴定；第二，以消化产物为模板，以跨酶切位点区域的引物进行PCR扩增，实验组扩增产物含有残留的未被切割的ApaⅠ位点和大量的突变体AvaⅡ位点；第三，再以AvaⅡ内切酶对扩增产物进行酶切反应，实验组因含有大量的AvaⅡ位点而被切割，最后通过PAGE分离就可以将AvaⅡ酶切产物予以鉴定。其他突变位点的检测原理和步骤与之类似。理论上推算，iRSM的检测灵敏度为3×10-6，但要在凝胶上明显地辨认酶切产物，约需含有10个突变体的DNA模板，因此，实际上该法的灵敏度在10-5数量级，若结合其他位点分析，还可以将突变检测灵敏度大大提高。
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图1 iRSM检测ApaⅠ→AvaⅡ酶切位点转换突变的原理和主要步骤
2.2 应用范围
iRSM适用于快速检测诱变剂所致体内外DNA的突变，但这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点。该方法建立者Jenkins等首先将iRSM应用于化学诱变剂所致动物体内p53基因的突变检测，取得了良好的结果：小鼠分别口服N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3 d后，以iRSM方法相应地检测小鼠脾、骨髓和肝组织p53基因第6内含子区域的ApaⅠ→AvaⅡ位点转换突变。结果表明ENU诱发肝组织p53基因突变的发生率为33%，DMH诱发骨髓突变的发生率为13%，2-AAF使肝组织突变的发生率为25%，这一阳性突变率反映出了不同诱变剂对相应组织的致突作用强度，进一步验证了该方法的高灵敏度和准确性。为了比较iRSM与RFLP的灵敏度，Jenkins等在同一条件下以RFLP法对ENU处理组小鼠肝组织进行了p53基因突变的检测，结果显示RFLP不能检测到相应的突变；此外，利用iRSM还对小鼠p53基因其他多个位点突变(HaeⅢ→AvaⅡ, MspⅠ→EcoRⅠ, NarⅠ→HaeⅢ等)进行了成功的检测，多位点的检测可以大大提高诱变剂致突作用的检出率。我们正将该方法应用于动物体内及体外培养细胞DNA突变的检测，希望能将iRSM的应用范围进一步扩展，以期用于某些类别化合物的致突作用检测。
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2.3 优点及局限性
从iRSM分析方法的工作原理不难看出，它具有灵敏度高、快速、操作简便以及突变检测部位明确等优点。例如，iRSM检测突变的灵敏度是RFLP的1 000倍，而且只要结合其他酶切位点，分析还可进一步提高灵敏度；在操作步骤上仅需两次PCR扩增和一次PAGE检测；由于检测的突变变化部位是酶切位点之间的变化，因而碱基突变类型明确。但是，iRSM的不足之处是仅能检测诱发限制性酶切位点转换的DNA突变。根据文献资料分析，化合物致突的发生具有一定的规律性，并非随机出现在任意部位，即结构类似的一组化合物常常引起一些特定序列较固定的碱基改变。例如，烷化剂和芳香胺类最易使一连串鸟嘌呤(G)的3′端G发生突变[15,16]，这可能与该部位电荷密集有关，多数活性氧生成物质的DNA致突作用也具有类似规律[17]；CpG二核苷常常是DNA加成物的致突作用部位[18]，所以CpG突变的检测在化合物致突检测中具有重要意义，而CpG突变常引发某些固定酶切位点的变化。很显然，iRSM可较广泛地应用于遗传毒性化合物致突作用的检测。
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3 现行突变检测手段与新药临床前遗传毒性评价
随着肿瘤分子生物学的发展和人类基因组计划的逐步实施，各国对新药开发过程中临床前遗传毒性的检测备加重视。如果说药物的急、慢毒性作用较为短暂的话，那么药物的遗传毒性作用则更为深远，也更为严重，因此遗传毒性的检测也就显得更加重要。由于现行新药临床前遗传毒性检测方法仅能从最终生物学效应对突变作用进行认定，还不能确定突变部位和类型，更不能从突变发生的根本机制上检测药物的致突作用，因此，现行检测方法需要进一步深化和完善。目前，西方发达国家在新药安全性评价中要求引入最新的分子生物学方法和技术，加强“三致”试验的检测。上述分子生物学突变检测方法各有优点，但又存在各自的局限性，难以适应所有药物致突作用的检测和评价。可见，要建立完全替代现行致突检测手段的新的分子生物学方法，还有赖于分子生物学及相关学科理论和技术的进一步发展。可以肯定，在不久的将来，利用某一个或一组分子生物学突变检测方法来完善、替代现行新药遗传毒性检测手段，是本研究领域的发展方向和必然。
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[作者简介] 刘永学(1966-)，男，山东安丘人，副研究员，博士。
刘永学(军事医学科学院放射医学研究所, 北京 100850)
纪学武(解放军37221部队)
高沛永(军事医学科学院放射医学研究所, 北京 100850)
参考文献
[1] Ceccherini I, Seri M, Romeo G. Strategies for the identification of intron-exon boundaries and of point mutations: the example of the RET proto-oncogene[J]. Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1996, 9(1): 98.
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