用RT-PCR方法定量检测脑内早老性痴呆有关基因的表达
魏小龙 张永祥 周金黄
摘 要 目的：建立定量检测脑内早老性痴呆有关基因表达的方法。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法定量检测了小鼠海马和皮层内早老性痴呆有关基因β-淀粉样蛋白的前体蛋白(APP)、早老蛋白1(presenilin-1，PS-1)、PS-2、apoE、tau等基因的表达水平。结果：RT-PCR具有灵敏度高、专一性好、简便快速等特点,尤其适合于定量检测微量样品和表达水平较低的基因。结论：RT-PCR是一种定量检测脑内早老性痴呆有关基因表达水平的较好方法。
关键词：逆转录聚合酶链反应；老年性痴呆；基因表达
早老性痴呆(Alzheimer′s disease，AD)已成为当今社会严重威胁老年人生命的杀手疾病之一。AD的显著特征之一是严重的中枢学习记忆功能障碍，大量神经元丢失、老年斑、神经元纤维缠结及β-淀粉样蛋白沉积是其典型的病理学特征。AD的发生发展及其病理学特征的形成与脑内β-淀粉样蛋白的前体蛋白(APP)、早老蛋白1(presenilin-1，PS-1)、PS-2、apoE、tau等基因的突变和异常表达密切相关[1～9]。目前常规检测AD有关基因表达的方法有免疫组化方法和核酸杂交方法。这些方法往往灵敏度低、易导致假阳性,且费时费力。
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我们利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)与图像分析相结合的方法定量检测了快速老化模型小鼠(senescence accelerated mouse，SAM)海马和皮层内AD有关基因表达水平的变化,并对该方法的可行性作了探讨。
1 材料和方法
1.1 动物
快速老化模型小鼠SAMP8及抗快速老化模型小鼠SAMR1,11月龄,日本京都大学引进，本院实验动物中心饲养繁殖。
1.2 试剂
总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶(5 000 U/L)、dNTP(10 mmol/L)、焦碳酸二乙酯、琼脂糖均为Promega公司产品。
1.3 仪器
, 百拇医药
9600型PCR仪为Perkin Elmer公司产品；HV3000多用电泳仪购于北京东方仪器厂；TLL-C台式冷冻离心机购于军事医学科学院实验仪器厂；图像分析仪为Kodak公司产品。
1.4 引物设计
根据GeneBank的序列,用Goldkey软件分别设计AD有关基因APP、PS-1、PS-2、apoE和tau的引物。经检验引物内部无发夹结构,引物之间无二聚体形成,引物与基因库之间无非特异性同源区域。
1.5 总RNA提取[10，11]
实验分为SAMR1对照组和SAMP8实验组，每组取双侧海马和皮层组织各0.1 g (每组4只小鼠，每鼠取0.025 g) 置5 ml离心管中，加预冷的异硫氰酸胍变性溶液1 ml，匀浆。加NaAc(2 mol/L，pH4.0) 0.1 ml，酚-氯仿-异丙醇混合液1 ml，震荡，4℃、10 000 g离心20 min。吸取上清，加等容积异丙醇，-20℃放置2 h以上，0℃、10 000 g离心15 min。吸去上清。向沉淀中加0.5 ml变性溶液，搅拌至RNA溶解。加NaAc(2 mol/L，pH4.0) 0.05 ml，酚-氯仿-异戊醇混合液0.5 ml，震荡，4℃、10 000 g离心20 min。上层水相转移到1.5 ml离心管中，加等容积异丙醇，-20℃放置2 h以上，4℃、10 000g离心15 min，以预冷的75%乙醇5 ml洗涤沉淀，并按前法离心。吸去乙醇，在真空干燥器中干燥沉淀15 min，用0.3～0.5 ml无RNA酶的水溶解沉淀，-20℃保存备用；同时进行紫外定量，用甲醛变性电泳鉴定RNA的质量。
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1.6 逆转录反应[11，12]
在0.5 ml Eppendorf管中加入rRNasin (4×107 U/L) 0.5 ml，Oligo(dt)15引物 (0.5 g/L) 1 μl，总RNA 2 μg，MgCl2 (25 mmol/L) 4 μl，10×逆转录缓冲液2 μl，AMV逆转录酶(2.5×107 U/L) 0.6 μl，补加无RNA酶的水至总反应容积为20 μl，混匀，42℃反应1 h，95℃ 5 min终止反应，冰浴冷却5 min，-70℃保存。
1.7 PCR反应[11，12]
在0.5 ml Eppendorf管中依次加入灭菌水32.5 μl，10×缓冲液5 μl，MgCl2 (25 mmol/L) 4 μl，dNTP (10 mmol/L) 1 μl，3′和5′端引物(2.5 μmol/L) 各2 μl，逆转录产物2 μl，Taq DNA聚合酶(5 000 U/L) 0.25 μl，混匀。覆盖石蜡油50 μl，稍加离心，95℃变性2 min。设置反应程序：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 15 s，共34个循环(其中PS-2为38个循环)，最后72℃延伸10 min。
, 百拇医药
1.8 PCR产物定量
PCR反应产物12 μl加3 μl载样缓冲液，以1×TBE为电泳缓冲液，在1.5% 琼脂糖凝胶上电泳约1 h(电压50 V)。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶用图像分析仪进行图像分析。然后计算待测基因与β-肌动蛋白(β-actin)光密度的比值，比较各组间基因/β-肌动蛋白比值的大小。
1.9 统计学处理
数据以
±s表示，两组间均数比较用t检验，P<0.05时差异有统计学意义。
2 结果
2.1 总RNA的鉴定
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获得相当纯度和完整的RNA是核酸杂交成功的前提,本实验提取的RNA经紫外测得D260/D280及D260/D230比值分别为1.75～1.85及2.20～2.30,表明所提RNA纯度高、污染低。从甲醛变性凝胶电泳上可清晰看到28S和18S两条带(图1),其亮度之比约为2∶1,并隐约可见5S条带。表明RNA带完整,没有降解,可作为逆转录反应的模板。
图1 总RNA甲醛变性凝胶电泳图谱
1.SAMR1海马；2.SAMP8海马；
3.SAMR1皮层；4.SAMP8皮层
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2.2 样品的检测结果
利用RT-PCR技术和设定的两对引物,在上述选定的实验条件下,分别得到APP(331 bp)、PS-1(403 bp)、PS-2(469 bp)、apoE(401 bp)、tau(489 bp)和β-肌动蛋白(742 bp)的扩增产物(图 2)。然后对琼脂糖凝胶电泳图谱上基因条带进行图像分析,计算基因与β-肌动蛋白吸收峰面积之比值。每组4只小鼠，实验重复3次。与SAMR1对照组相比,SAMP8海马内apoE的表达水平明显降低，PS-2和tau的表达水平明显升高，统计学处理有显著性差异(图 3)。
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图2 早老性痴呆有关基因RT-PCR产物的电泳图谱
A：1.PCR标志物；2，4，6，8，10.分别代表SAMR1海马内PS-1，PS-2，apoE,tau和APP；3，5，7，9，11.分别代表SAMP8
海马内PS-1，PS-2，apoE,tau和APP；B：1，2.分别代表SAMR1，SAMP8海马β-肌动蛋白
图3 11月龄快速老化模型小鼠(SAM)海马和皮层中早老性痴呆有关基因的表达水平
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A.海马；B.皮层.±s，n=3；与SAMP1相比：*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
与常规的免疫组化方法和核酸杂交方法相比，用RT-PCR定量检测脑内AD有关基因的表达灵敏度高、特异性好、简便快速,尤其适合于检测微量样品和表达水平很低的基因[13]。我们选择了在大多数细胞内均为高表达的β-肌动蛋白作为对照,避免了诸多因素的干扰,保证了测定结果的准确和可靠。
SAMP8是SAM的亚系之一，具有类似于AD的某些特征，随增龄发生进行性快速老化。出生后4月龄即出现中枢学习记忆功能衰退，10～11月龄时已发生明显老化，海马功能受到明显损伤，中枢学习记忆功能明显低下[14～17]。RT-PCR检测结果表明,与同龄SAMR1对照组相比，11月龄SAMP8海马PS-2和tau的表达水平明显升高、apoE的表达水平明显降低，反映了脑老化和中枢学习记忆功能衰退的趋势。近年来大量研究表明，AD患者的脑内存在APP、PS、apoE、tau等基因的突变或表达异常，提示AD的发生与脑内多种调控基因的失调有关[18]。在本实验中，SAMP8海马和皮层APP和PS-1的表达水平没有明显的变化。实验结果表明SAMP8具有部分AD的某些特征，是一个AD较好的替代模型，亦说明RT-PCR是一种较好的定量检测脑内AD有关基因表达水平的方法。此外,该实验也为建立定量检测脑内微量样品中其他基因的表达奠定了基础。
, 百拇医药
本研究得到本所魏婉丽博士，徐海同志及放射医学研究所郭树华博士在实验技术方面的帮助，特此致谢。
[基金项目]国家重点基础研究发展规划项目(G1999054401)；国家自然科学基金重点资助项目(39830450)；“九五”国家攀登计划预选项目
[作者简介]魏小龙(1964-)，男，江苏常州人，助理研究员，博士。
魏小龙(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
张永祥(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
周金黄(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
参考文献
, 百拇医药
[1]Kennedy AM,Newman S,McCaddon A，et al.Familial Alzheimer′s disease.A pedigree with a mis-sense mutation in the amyloid precursor protein gene (amyloid precursor protein 717 valine?glycine)[J].Brain,1993,116(2):309.
[2]Nitta A,Itoh A,Hasegawa T，et al.beta-Amyloid protein-induced Alzheimer′s disease animal model[J].Neurosci Lett,1994,170(1):63.
[3]Rogaev EI,Sherrington R,Rogaeva EA，et al.Familial Alzheimer′s disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer′s disease type 3 gene[J].Nature,1995,376(6543):775.
, 百拇医药
[4]Levy-Lahad E,Wasco W,Poorkaj P，et al.Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer′s disease locus[J].Science,1995,269(5226):973.
[5]Borchelt DR.Metabolism of presenilin 1:influence of presenilin 1 on amyloid precursor protein processing[J].Neurobiol Aging,1998,19(Suppl 1):S15.
[6]Poirier J.Apolipoprotein E in animal models of CNS injury and in Alzheimer′s disease[J].Trends Neurosci,1994,17(12):525.
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[7]Chen Y,Lomnitski L,Michaelson DM，et al.Motor and cognitive deficits in apolipoprotein E-deficient mice after closed head injury[J].Neuroscience,1997,80(4):1255.
[8]Mandelkow EM,Biernat J,Drewes G，et al.Microtubule-associated protein tau,paired helical filaments,and phosphorylation[J].Ann N Y Acad Sci,1993,695(1):209.
[9]Gotz J,Probst A,Spillantini MG，et al.Somatodendritic localization and hyperphosphorylation of tau protein in transgenic mice expressing the longest human brain tau isoform[J].EMBO J,1995,14(7):1304.
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[10]Chomczynski P ,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem,1987,162(1):156.
[11]魏小龙，茹祥斌.低分子量地黄多糖对p53基因表达的影响[J].中国药理学报，1997,18(5):71.
[12]Dukas K,Sarfati P,Vaysse N，et al.Quantitation of changes in the expression of multiple genes by simultaneous polymerase chain reaction[J].Anal Biochem,1993,215(1):66.
[13]魏小龙，茹祥斌，王青定，等.用竞争性RT-PCR方法定量检测p53基因的表达[J].军事医学科学院院刊,1999,23(2):107.
, http://www.100md.com
[14]Mann DM.The neuropathology of Alzheimer′s disease:a review with pathogenetic,aetiological and therapeutic considerations[J].Mech Ageing Dev,1985,31(3):213.
[15]Wisniewski HM,Merz GS.Neuropathology of the aging brain and dementia of the Alzheimer′s disease[M].In:Gaitz CM ,Samorajski T eds.Our health care destiny.Vol 1.Biomedical Issues.New York:Springer-Verlag,1985.231～243.
[16]宋 涛，张永祥，周金黄.六味地黄汤口服4个月对早衰小鼠(SAM)学习记忆的影响[J].中国药理学通讯，1996,13(3):21.
[17]Jucker M,Walker LC,Kuo H，et al.Age-related fibrillard deposits in brains of C57BL/6 mice.A review of localization,staining characteristics,and strain specificity[J].Mol Neurobiol,1994,9(1-3):125.
[18]魏小龙，张永祥.老年性痴呆相关的脑内调控基因[J].中国药理学通报,1999,15(2):119., http://www.100md.com
摘 要 目的：建立定量检测脑内早老性痴呆有关基因表达的方法。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法定量检测了小鼠海马和皮层内早老性痴呆有关基因β-淀粉样蛋白的前体蛋白(APP)、早老蛋白1(presenilin-1，PS-1)、PS-2、apoE、tau等基因的表达水平。结果：RT-PCR具有灵敏度高、专一性好、简便快速等特点,尤其适合于定量检测微量样品和表达水平较低的基因。结论：RT-PCR是一种定量检测脑内早老性痴呆有关基因表达水平的较好方法。
关键词：逆转录聚合酶链反应；老年性痴呆；基因表达
早老性痴呆(Alzheimer′s disease，AD)已成为当今社会严重威胁老年人生命的杀手疾病之一。AD的显著特征之一是严重的中枢学习记忆功能障碍，大量神经元丢失、老年斑、神经元纤维缠结及β-淀粉样蛋白沉积是其典型的病理学特征。AD的发生发展及其病理学特征的形成与脑内β-淀粉样蛋白的前体蛋白(APP)、早老蛋白1(presenilin-1，PS-1)、PS-2、apoE、tau等基因的突变和异常表达密切相关[1～9]。目前常规检测AD有关基因表达的方法有免疫组化方法和核酸杂交方法。这些方法往往灵敏度低、易导致假阳性,且费时费力。
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我们利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)与图像分析相结合的方法定量检测了快速老化模型小鼠(senescence accelerated mouse，SAM)海马和皮层内AD有关基因表达水平的变化,并对该方法的可行性作了探讨。
1 材料和方法
1.1 动物
快速老化模型小鼠SAMP8及抗快速老化模型小鼠SAMR1,11月龄,日本京都大学引进，本院实验动物中心饲养繁殖。
1.2 试剂
总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶(5 000 U/L)、dNTP(10 mmol/L)、焦碳酸二乙酯、琼脂糖均为Promega公司产品。
1.3 仪器
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9600型PCR仪为Perkin Elmer公司产品；HV3000多用电泳仪购于北京东方仪器厂；TLL-C台式冷冻离心机购于军事医学科学院实验仪器厂；图像分析仪为Kodak公司产品。
1.4 引物设计
根据GeneBank的序列,用Goldkey软件分别设计AD有关基因APP、PS-1、PS-2、apoE和tau的引物。经检验引物内部无发夹结构,引物之间无二聚体形成,引物与基因库之间无非特异性同源区域。
1.5 总RNA提取[10，11]
实验分为SAMR1对照组和SAMP8实验组，每组取双侧海马和皮层组织各0.1 g (每组4只小鼠，每鼠取0.025 g) 置5 ml离心管中，加预冷的异硫氰酸胍变性溶液1 ml，匀浆。加NaAc(2 mol/L，pH4.0) 0.1 ml，酚-氯仿-异丙醇混合液1 ml，震荡，4℃、10 000 g离心20 min。吸取上清，加等容积异丙醇，-20℃放置2 h以上，0℃、10 000 g离心15 min。吸去上清。向沉淀中加0.5 ml变性溶液，搅拌至RNA溶解。加NaAc(2 mol/L，pH4.0) 0.05 ml，酚-氯仿-异戊醇混合液0.5 ml，震荡，4℃、10 000 g离心20 min。上层水相转移到1.5 ml离心管中，加等容积异丙醇，-20℃放置2 h以上，4℃、10 000g离心15 min，以预冷的75%乙醇5 ml洗涤沉淀，并按前法离心。吸去乙醇，在真空干燥器中干燥沉淀15 min，用0.3～0.5 ml无RNA酶的水溶解沉淀，-20℃保存备用；同时进行紫外定量，用甲醛变性电泳鉴定RNA的质量。
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1.6 逆转录反应[11，12]
在0.5 ml Eppendorf管中加入rRNasin (4×107 U/L) 0.5 ml，Oligo(dt)15引物 (0.5 g/L) 1 μl，总RNA 2 μg，MgCl2 (25 mmol/L) 4 μl，10×逆转录缓冲液2 μl，AMV逆转录酶(2.5×107 U/L) 0.6 μl，补加无RNA酶的水至总反应容积为20 μl，混匀，42℃反应1 h，95℃ 5 min终止反应，冰浴冷却5 min，-70℃保存。
1.7 PCR反应[11，12]
在0.5 ml Eppendorf管中依次加入灭菌水32.5 μl，10×缓冲液5 μl，MgCl2 (25 mmol/L) 4 μl，dNTP (10 mmol/L) 1 μl，3′和5′端引物(2.5 μmol/L) 各2 μl，逆转录产物2 μl，Taq DNA聚合酶(5 000 U/L) 0.25 μl，混匀。覆盖石蜡油50 μl，稍加离心，95℃变性2 min。设置反应程序：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 15 s，共34个循环(其中PS-2为38个循环)，最后72℃延伸10 min。
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1.8 PCR产物定量
PCR反应产物12 μl加3 μl载样缓冲液，以1×TBE为电泳缓冲液，在1.5% 琼脂糖凝胶上电泳约1 h(电压50 V)。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶用图像分析仪进行图像分析。然后计算待测基因与β-肌动蛋白(β-actin)光密度的比值，比较各组间基因/β-肌动蛋白比值的大小。
1.9 统计学处理
数据以
±s表示，两组间均数比较用t检验，P<0.05时差异有统计学意义。2 结果
2.1 总RNA的鉴定
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获得相当纯度和完整的RNA是核酸杂交成功的前提,本实验提取的RNA经紫外测得D260/D280及D260/D230比值分别为1.75～1.85及2.20～2.30,表明所提RNA纯度高、污染低。从甲醛变性凝胶电泳上可清晰看到28S和18S两条带(图1),其亮度之比约为2∶1,并隐约可见5S条带。表明RNA带完整,没有降解,可作为逆转录反应的模板。
图1 总RNA甲醛变性凝胶电泳图谱
1.SAMR1海马；2.SAMP8海马；
3.SAMR1皮层；4.SAMP8皮层
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2.2 样品的检测结果
利用RT-PCR技术和设定的两对引物,在上述选定的实验条件下,分别得到APP(331 bp)、PS-1(403 bp)、PS-2(469 bp)、apoE(401 bp)、tau(489 bp)和β-肌动蛋白(742 bp)的扩增产物(图 2)。然后对琼脂糖凝胶电泳图谱上基因条带进行图像分析,计算基因与β-肌动蛋白吸收峰面积之比值。每组4只小鼠，实验重复3次。与SAMR1对照组相比,SAMP8海马内apoE的表达水平明显降低，PS-2和tau的表达水平明显升高，统计学处理有显著性差异(图 3)。
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图2 早老性痴呆有关基因RT-PCR产物的电泳图谱
A：1.PCR标志物；2，4，6，8，10.分别代表SAMR1海马内PS-1，PS-2，apoE,tau和APP；3，5，7，9，11.分别代表SAMP8
海马内PS-1，PS-2，apoE,tau和APP；B：1，2.分别代表SAMR1，SAMP8海马β-肌动蛋白
图3 11月龄快速老化模型小鼠(SAM)海马和皮层中早老性痴呆有关基因的表达水平
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A.海马；B.皮层.
±s，n=3；与SAMP1相比：*P<0.05，**P<0.013 讨论
与常规的免疫组化方法和核酸杂交方法相比，用RT-PCR定量检测脑内AD有关基因的表达灵敏度高、特异性好、简便快速,尤其适合于检测微量样品和表达水平很低的基因[13]。我们选择了在大多数细胞内均为高表达的β-肌动蛋白作为对照,避免了诸多因素的干扰,保证了测定结果的准确和可靠。
SAMP8是SAM的亚系之一，具有类似于AD的某些特征，随增龄发生进行性快速老化。出生后4月龄即出现中枢学习记忆功能衰退，10～11月龄时已发生明显老化，海马功能受到明显损伤，中枢学习记忆功能明显低下[14～17]。RT-PCR检测结果表明,与同龄SAMR1对照组相比，11月龄SAMP8海马PS-2和tau的表达水平明显升高、apoE的表达水平明显降低，反映了脑老化和中枢学习记忆功能衰退的趋势。近年来大量研究表明，AD患者的脑内存在APP、PS、apoE、tau等基因的突变或表达异常，提示AD的发生与脑内多种调控基因的失调有关[18]。在本实验中，SAMP8海马和皮层APP和PS-1的表达水平没有明显的变化。实验结果表明SAMP8具有部分AD的某些特征，是一个AD较好的替代模型，亦说明RT-PCR是一种较好的定量检测脑内AD有关基因表达水平的方法。此外,该实验也为建立定量检测脑内微量样品中其他基因的表达奠定了基础。
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本研究得到本所魏婉丽博士，徐海同志及放射医学研究所郭树华博士在实验技术方面的帮助，特此致谢。
[基金项目]国家重点基础研究发展规划项目(G1999054401)；国家自然科学基金重点资助项目(39830450)；“九五”国家攀登计划预选项目
[作者简介]魏小龙(1964-)，男，江苏常州人，助理研究员，博士。
魏小龙(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
张永祥(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
周金黄(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
参考文献
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[1]Kennedy AM,Newman S,McCaddon A，et al.Familial Alzheimer′s disease.A pedigree with a mis-sense mutation in the amyloid precursor protein gene (amyloid precursor protein 717 valine?glycine)[J].Brain,1993,116(2):309.
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[3]Rogaev EI,Sherrington R,Rogaeva EA，et al.Familial Alzheimer′s disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer′s disease type 3 gene[J].Nature,1995,376(6543):775.
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[9]Gotz J,Probst A,Spillantini MG，et al.Somatodendritic localization and hyperphosphorylation of tau protein in transgenic mice expressing the longest human brain tau isoform[J].EMBO J,1995,14(7):1304.
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[11]魏小龙，茹祥斌.低分子量地黄多糖对p53基因表达的影响[J].中国药理学报，1997,18(5):71.
[12]Dukas K,Sarfati P,Vaysse N，et al.Quantitation of changes in the expression of multiple genes by simultaneous polymerase chain reaction[J].Anal Biochem,1993,215(1):66.
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[16]宋 涛，张永祥，周金黄.六味地黄汤口服4个月对早衰小鼠(SAM)学习记忆的影响[J].中国药理学通讯，1996,13(3):21.
[17]Jucker M,Walker LC,Kuo H，et al.Age-related fibrillard deposits in brains of C57BL/6 mice.A review of localization,staining characteristics,and strain specificity[J].Mol Neurobiol,1994,9(1-3):125.
[18]魏小龙，张永祥.老年性痴呆相关的脑内调控基因[J].中国药理学通报,1999,15(2):119., http://www.100md.com