真核表达质粒pBK-IL-1ra的构建及表达
杨高云 李芳 蒋明 狄春辉 黄家强
摘 要 目的 构建可在真核细胞内高效表达白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的真核表达质粒pBK-IL-1ra，以便用于IL-1ra基因治疗研究。方法 采用分子生物学技术将人IL-1ra cDNA插入真核表达载体pBK-CMV中，构建成真核表达质粒pBK-IL-1ra。通过竞争性ELISA、原位杂交和免疫组化检测其在体外和体内转染真核细胞后IL-1ra基因和蛋白的表达。 结果 (1)酶切、PCR和DNA测序鉴定均证实插入片段的正确性。(2)经脂质体介导转染COS-7细胞和滑膜细胞后，用竞争性ELISA方法进行检测结果表明，COS-7细胞在转染pBK-IL-1ra后24和48 h，其培养液中IL-1ra水平较对应空载体转染的细胞明显升高(P<0.001,P<0.01)。(3)原位杂交和免疫组化检测结果显示，转染的滑膜细胞IL-1ra mRNA 和 IL-1ra表达都明显高于对照组(P<0.01,P<0.05)。(4)将重组质粒pBK-IL-1ra和空载体pBK-CMV一次性肌肉注射于DBA/1小鼠，第4天局部肌肉组织细胞内pBK-IL-1ra表达明显增高(P<0.01)。结论 通过基因工程方法成功地构建了可在体内外高效表达IL-1ra的真核表达质粒pBK-IL-1ra。
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关键词：白细胞介素-1受体拮抗剂；真核表达载体；DNA重组技术
白细胞介素-1(IL-1)是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，它可由多种组织细胞产生，并参与许多疾病的发病。白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的发现和基因克隆的成功[1]，为进一步研究IL-1在疾病中的作用和相关疾病的治疗开辟了新途径。IL-1ra能特异性地与IL-1受体结合而阻断IL-1的生物活性，从而在许多疾病中发挥治疗作用[2]。本研究通过基因工程方法将IL-1ra cDNA导入到真核表达载体，构建成了可在真核细胞内高效表达IL-1ra mRNA和IL-1ra的质粒pBK-IL-1ra，为采用基因给药方式在体内表达IL-1ra提供条件。
材料和方法
质粒 真核表达载体pBK-CMV (购自Invitrogen公司)可在多数哺乳动物细胞中高效表达外源基因。PGEM-T Easy载体购自Promega公司。
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细胞株及菌株 滑膜细胞(SFC)株[3](北京师范大学生物系王永潮教授惠赠)用含15%胎牛血清的HDMEM培养基传代培养。COS-7细胞(作瞬时表达用)和U937细胞由本室保存。XLI-Blue为大肠杆菌高效转化和克隆化载体，购自美国Stratagene公司。
工具酶 限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)、T4DNA连接酶、Klenow酶和TaqDNA聚合酶等DNA修饰酶及其缓冲液购于Promega、Gibco和BRL公司。ATP购自BRL公司。
hIL-1ra引物 按文献[3]中hIL-1ra cDNA序列设计了含信号肽的hIL-1ra 引物。3′端引物：CTTAAGCTTACTCGTCCTCCTGGAAGTAG，5′端引物：ATGGAAATCTGCAGAGGCCT。
试剂盒 总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Gibco公司，质粒纯化试剂盒购自QIANGENGS，cDNA探针标记检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，免疫组化染色试剂盒为ZYMED公司产品，脂质体购自Gibco公司，用于DNA转染。
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探针和抗体 采用上述引物经PCR扩增并标记IL-1ra cDNA探针。兔抗人IL-1ra多抗(采用重组IL-1ra做为免疫原，由本室制备)效价1∶500。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(军事医学科学院生产)效价1∶1 000。
细胞培养液 RPMI1640和HDMEM均购自Gibco公司。
U937细胞cDNA文库的建立 U937细胞经LPS刺激4 h后，提取RNA，并按试剂盒说明进行逆转录。
IL-1ra的PCR扩增 以U937细胞cDNA文库为模板，加入引物后，95℃变性，5 min后进入以下程序：95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环35次后72℃延伸10 min。用Promega公司PCR clean up试剂盒纯化PCR产物。
pBK-IL-1ra构建 (1) PGEM-T hIL-1ra的构建：PGEM-T Easy载体是一个开环的两端具有突出T的载体，它可有效地将PCR产物连入，其具有的α-肽可有助于重组克隆的直接挑选。将纯化的PCR产物插入PGEM-T Easy载体，挑取阳性克隆后，用EcoRⅠ或PvuⅡ酶切鉴定。(2) pBK-IL-1ra的构建：真核表达载体pBK-CMV和亚克隆质粒PGEM-T hIL-1ra均经HindⅢ和EcoRⅠ酶切、回收并纯化目的片段。酶切后载体pBK-CMV经CIP处理后与含有的IL-1ra小片段连接，构建成质粒pBK-IL-1ra。
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构建质粒的鉴定和纯化 对pBK-IL-1ra进行酶切和PCR鉴定，对插入片段进行DNA序列检测。采用QIAGEN质粒纯化试剂盒纯化质粒。
pBK-IL-1ra表达产物的检测 (1) 体外表达检测：构建的质粒和空载体经脂质体(lipofectin)同时分别转染COS-7细胞和滑膜细胞，24和48 h后采用竞争抑制性ELISA[4]检测COS-7细胞培养上清内IL-1ra水平。待测上清及其稀释液首先与含一定浓度IL-1ra抗体的液体混合，再加于事先用IL-1ra包被过的96孔板中，然后用酶标二抗检测剩余的IL-1ra抗体结合到96孔板上的量。因此，样品中IL-1ra含量越高，与其作用后剩余IL-1ra抗体的量越少，酶标二抗所能结合的量也越少，显色也越浅，光密度(OD)值也越小；反之显色深，OD值大。转染滑膜细胞48 h后，采用原位杂交[5]和免疫组化[5]的SP法分别检测IL-1ra mRNA和IL-1ra的表达，其结果用计算机作图像分析，并对图像灰度测定结果(OD值)进行统计学分析。(2) 体内局部肌肉组织IL-1ra表达的检测：给10周龄DBA/1小鼠后腿肌肉注射0.25%布比卡因80 μl，2 d后于小鼠后腿行多点、沿肌纤维走向注射pBK-IL-1ra和pBK-CMV各200 μg(200 μl)。用药后第4天，取局部肌肉组织作冰冻切片，用免疫组化SP法检测局部肌肉组织中IL-1ra表达情况，对每例小鼠表达结果进行计算机图像分析。原位杂交中，以不加探针、不加抗体和经Rnase消化处理的细胞的3种杂交作为阴性对照，阳性反应者胞浆内可见蓝紫色颗粒。在免疫组化SP法中，以不加初级抗体和不加次级抗体的标本作为阴性对照，阳性反应者胞浆内可见黄色颗粒沉着。
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统计学处理 数据以(±s)表示，组间差异显著性用t检验。
结 果
IL-1ra PCR扩增 经PCR从U937细胞cDNA文库中扩增出hIL-1ra，扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现一500 bp左右的条带。
重组质粒的鉴定 (1) 经HindⅢ、EcoRⅠ+HindⅢ、KpnⅠ、PvyⅡ及StyⅠ酶切的结果见图1。(2) 在载体上靠近插入片段上游含有T7启动子，经采用T7引物/IL-1ra 3′端引物对重组质粒进行PCR扩增，结果表明，目的片段为正向插入(图1)。(3) 经DNA序列分析表明，所获扩增产物与文献报道IL-1ra cDNA序列完全一致。
图 1 pBK-IL-1ra的酶切鉴定
Fig 1 Enzyme digesting analysis of pBK-IL-1ra
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1.DNA Marker(λDNA Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ);2.pBK-CMV vector;3.pBK-IL-1ra plasmid;4.pBK-IL-1ra EcoR Ⅰ cut;5.pBK-IL-1ra Hind Ⅲ
cut; 6.pBK-IL-1ra EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ cut;7.pBK-IL-1ra Kpn Ⅰ cut; 8.pBK-IL-1ra Pvu Ⅱ cut;9.pBK-IL-1ra Sty I cut;10.PCR product (T7 primer and 3′primer)
竞争抑制性ELISA检测结果 pBK-IL-1ra转染COS-7细胞24 h后，细胞培养原液及其1∶10和1∶50稀释液中IL-1ra水平均明显高于pBK-CMV转染对照组(P<0.001)，转染48 h后，细胞培养原液及其1∶10和1∶50稀释液中IL-1ra水平均较24 h 对应的IL-1ra水平有所降低(P<0.01)，但其原液及1∶10稀释液中IL-1ra水平仍明显高于pBK-CMV转染对照组(P<0.001)(表1)。
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IL-1ra mRNA和IL-1ra表达 pBK-IL-1ra转染48 h后，滑膜细胞胞浆内IL-1ra mRNA和IL-1ra表达均明显高于空载体对照，两组差异有显著性(P<0.01，P<0.05)(表2，表2中数据为计算机图象分析所得的OD值)。 原位杂交及免疫组化检测IL-1ra mRNA在滑膜细胞中的表达结果见图2，3。
表1 竞争抑制性ELISA检测细胞培养液中IL-1ra水平
Table 1 The levels of IL-1ra in the supernate detected by competitive inhibition ELISA(±s,n=6)
Plasmids
Samples
OD values
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Transfection for 24 h
Transfection for 48 h
pBK-IL-1ra
1∶1
0.088±0.020***
0.139±0.024**##
1∶10
0.261±0.032***
0.341±0.037**##
1∶50
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0.410±0.043***
0.518±0.050##
pBK-CMV
1∶1，1∶10，1∶50
0.542±0.048
0.542±0.048
t test,**P<0.01,***P<0.001 compared with pBK-CMV;##P<0.01 compared with transfectim for 24 h;OD:optical density mersured by densitometry表2 滑膜细胞胞浆内IL-1ra mRNA和IL-1ra表达
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Table 2 The gray grade of expression of IL-1ra mRNA and IL-1ra in synoviocytes(±s)
Plasmids
n
OD
IL-1ra mRNA
IL-1ra
pBK-IL-1ra
5
0.69±0.15*
0.32±0.07**
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pBK-CMV
5
0.43±0.08
0.21±0.05
t test,*P<0.05,**P<0.01 compared with pBK-CMV;OD:optical density measured by densitometry
体内局部肌肉组织IL-1ra表达 小鼠肌肉注射两种质粒后第4天后，pBK-IL-1ra注射组小鼠肌肉组织中IL-1ra表达明显高于空载体对照组(图4)。图像分析结果显示pBK-IL-1ra组(n=3)，OD为(0.36±0.03)，空载体对照组(n=3)OD为(0.20±0.02)，两组差异有显著性意义(P<0.01)。
讨 论
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IL-1ra是1985年首次从IgG刺激后的单核细胞培养上清中发现的，又称IL-1受体拮抗蛋白(IRAP)。它可与Ⅰ型和Ⅱ型IL-1受体(IL-1R)结合，从而成为IL-1和IL-1R结合的竞争性抑制物。正常人血清IL-1ra水平在200 pg/ml以下，在感染、炎症及内毒素血症患者血清中IL-1ra水平可高达8 ng/ml。IL-1ra能抑制由IL-1刺激引起的滑膜细胞PGE2的产生和软骨细胞胶原酶的合成，抑制胸腺细胞的增殖以及中性粒细胞、嗜酸性细胞与内皮细胞的粘附[6]。在临床及动物实验中已证明，IL-1ra在某些疾病中可发挥治疗作用，如：败血症性休克、关节炎、移植物抗宿主反应、糖尿病、白血病及急性神经退化等[2，7，8]，并且IL-1ra的副作用非常小，健康志愿者注射大剂量IL-1ra未引起任何不良反应[7]。但当需要较大限度地抑制IL-1的作用时，阻断IL-1半数生物效应时所需的IL-1ra是IL-1用量的10～100倍甚至500倍，从而明显地提高了其临床应用的成本费用。另外，由于IL-1ra在血液中的半衰期短(6 min)，需要反复长期用药才能维持疗效，不便于临床应用。于是有人用腺病毒或逆转录病毒将IL-1ra的cDNA导入动物体内，虽然收到了一定效果[9，10]，但是，鉴于病毒载体的免疫致敏性和细胞毒性等副作用，目前尚难推广应用于临床，而更为安全有效的IL-1ra基因给药方式尚未见报道。因此，本研究从LPS刺激U937细胞后构建的cDNA文库中经PCR扩增获得人IL-1ra cDNA，并将其亚克隆到测序载体PGEM-T Easy Vector中，然后将(IL-1ra)片段插入真核表达载体pBK-CMV中，构建成真核表达质粒pBK-IL-1ra，经酶切、PCR及DNA测序均证实了插入片段的正确性。该质粒上游含有巨细胞病毒(CMV)启动子，具有卡那霉素抗性基因。重组质粒和对应空载体经脂质体介导转染COS-7细胞和滑膜细胞后，经竞争抑制性ELISA检测法显示，转染pBK-IL-1ra 24和48 h后，COS-7细胞培养液中IL-1ra水平较对照组明显升高。以重组质粒转染滑膜细胞48 h后，经原位杂交和免疫组化检测表明，转染的滑膜细胞IL-1ra mRNA和IL-1ra表达明显高于空载体。一次性肌肉注射pBK-IL-1ra及pBK-CMV 3 d后，小鼠局部肌肉组织中IL-1ra表达也明显高于空载体对照组。以上结果表明，质粒pBK-IL-1ra在体外和体内转染后，真核细胞可明显表达IL-1ra。真核表达质粒pBK-IL-1ra的构建成功，为进一步研究IL-1ra在体内和体外的作用提供了必要的条件。
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杨高云(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
李芳(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
蒋明(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
狄春辉(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
黄家强(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
参考文献
1，Stephen PE,Ron JE,William PA,et al.Primary structure and functional expression from complementary DNA of a human interleukin-1 receptor antagonist.Nature,1990,343(6256):341-346
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2，Charles AD.Biologic basis for Interleukin-1 disease.Blood,1996,87(6): 2096-2147
3，王永潮,蒋知新,陈志强,等. 建立类风湿关节炎滑膜细胞株. 解剖学报,1997,28(2):126
4，Charles AJ,Paul T,Mark W,et al.Immunological Biology.New York:Current Biology Publications,1999.40-42
5，Yang Gaoyun,Liu Hongtao,Jiang Ming,et al.Experimental study on intramuscular injection of eukaryotic expression vector pcDNA3-IL-6 on BXSB mice.Chin Med J, 1998,111:38-42
, 百拇医药
6，Dinarello CA,Thompson RC.Blocking IL-1:interleukin-1 receptor antagonist in vivo and in vitro.Immunol Today,1991,12(11):404-410
7，Arend WP,Malyak M,Guthridge CJ,et al.Interleukin-1 receptor antagonist:role in biology.Annu Rev Immunol,1998,16:27-55
8，Bendele A,Sennello G,McAbee T,et al.Effects of interleukin-1 receptor antagonist alone and in combination with methotrexate in adjuvant arthritic rats. J Rheumatol,1999，26(6):1225-1229
, 百拇医药
9，Pelletier JP,Caron JP,Evans C,et al.In vivo suppression of early experimental osteoarthritis by interleukin-1 receptor antagonist using gene therapy.Arthritis Rheum,1997, 40(6):1012-1019
10，Ma Y,Thornton S,Boivin GP,et al.Altered susceptibility to collagen-induced arthritis in transgenic mice with aberrant expression of interleukin-1 receptor antagonist.Arthritis Rheum, 1998, 41(10):1798-1805, http://www.100md.com
摘 要 目的 构建可在真核细胞内高效表达白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的真核表达质粒pBK-IL-1ra，以便用于IL-1ra基因治疗研究。方法 采用分子生物学技术将人IL-1ra cDNA插入真核表达载体pBK-CMV中，构建成真核表达质粒pBK-IL-1ra。通过竞争性ELISA、原位杂交和免疫组化检测其在体外和体内转染真核细胞后IL-1ra基因和蛋白的表达。 结果 (1)酶切、PCR和DNA测序鉴定均证实插入片段的正确性。(2)经脂质体介导转染COS-7细胞和滑膜细胞后，用竞争性ELISA方法进行检测结果表明，COS-7细胞在转染pBK-IL-1ra后24和48 h，其培养液中IL-1ra水平较对应空载体转染的细胞明显升高(P<0.001,P<0.01)。(3)原位杂交和免疫组化检测结果显示，转染的滑膜细胞IL-1ra mRNA 和 IL-1ra表达都明显高于对照组(P<0.01,P<0.05)。(4)将重组质粒pBK-IL-1ra和空载体pBK-CMV一次性肌肉注射于DBA/1小鼠，第4天局部肌肉组织细胞内pBK-IL-1ra表达明显增高(P<0.01)。结论 通过基因工程方法成功地构建了可在体内外高效表达IL-1ra的真核表达质粒pBK-IL-1ra。
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关键词：白细胞介素-1受体拮抗剂；真核表达载体；DNA重组技术
白细胞介素-1(IL-1)是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，它可由多种组织细胞产生，并参与许多疾病的发病。白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的发现和基因克隆的成功[1]，为进一步研究IL-1在疾病中的作用和相关疾病的治疗开辟了新途径。IL-1ra能特异性地与IL-1受体结合而阻断IL-1的生物活性，从而在许多疾病中发挥治疗作用[2]。本研究通过基因工程方法将IL-1ra cDNA导入到真核表达载体，构建成了可在真核细胞内高效表达IL-1ra mRNA和IL-1ra的质粒pBK-IL-1ra，为采用基因给药方式在体内表达IL-1ra提供条件。
材料和方法
质粒 真核表达载体pBK-CMV (购自Invitrogen公司)可在多数哺乳动物细胞中高效表达外源基因。PGEM-T Easy载体购自Promega公司。
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细胞株及菌株 滑膜细胞(SFC)株[3](北京师范大学生物系王永潮教授惠赠)用含15%胎牛血清的HDMEM培养基传代培养。COS-7细胞(作瞬时表达用)和U937细胞由本室保存。XLI-Blue为大肠杆菌高效转化和克隆化载体，购自美国Stratagene公司。
工具酶 限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)、T4DNA连接酶、Klenow酶和TaqDNA聚合酶等DNA修饰酶及其缓冲液购于Promega、Gibco和BRL公司。ATP购自BRL公司。
hIL-1ra引物 按文献[3]中hIL-1ra cDNA序列设计了含信号肽的hIL-1ra 引物。3′端引物：CTTAAGCTTACTCGTCCTCCTGGAAGTAG，5′端引物：ATGGAAATCTGCAGAGGCCT。
试剂盒 总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Gibco公司，质粒纯化试剂盒购自QIANGENGS，cDNA探针标记检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，免疫组化染色试剂盒为ZYMED公司产品，脂质体购自Gibco公司，用于DNA转染。
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探针和抗体 采用上述引物经PCR扩增并标记IL-1ra cDNA探针。兔抗人IL-1ra多抗(采用重组IL-1ra做为免疫原，由本室制备)效价1∶500。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(军事医学科学院生产)效价1∶1 000。
细胞培养液 RPMI1640和HDMEM均购自Gibco公司。
U937细胞cDNA文库的建立 U937细胞经LPS刺激4 h后，提取RNA，并按试剂盒说明进行逆转录。
IL-1ra的PCR扩增 以U937细胞cDNA文库为模板，加入引物后，95℃变性，5 min后进入以下程序：95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环35次后72℃延伸10 min。用Promega公司PCR clean up试剂盒纯化PCR产物。
pBK-IL-1ra构建 (1) PGEM-T hIL-1ra的构建：PGEM-T Easy载体是一个开环的两端具有突出T的载体，它可有效地将PCR产物连入，其具有的α-肽可有助于重组克隆的直接挑选。将纯化的PCR产物插入PGEM-T Easy载体，挑取阳性克隆后，用EcoRⅠ或PvuⅡ酶切鉴定。(2) pBK-IL-1ra的构建：真核表达载体pBK-CMV和亚克隆质粒PGEM-T hIL-1ra均经HindⅢ和EcoRⅠ酶切、回收并纯化目的片段。酶切后载体pBK-CMV经CIP处理后与含有的IL-1ra小片段连接，构建成质粒pBK-IL-1ra。
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构建质粒的鉴定和纯化 对pBK-IL-1ra进行酶切和PCR鉴定，对插入片段进行DNA序列检测。采用QIAGEN质粒纯化试剂盒纯化质粒。
pBK-IL-1ra表达产物的检测 (1) 体外表达检测：构建的质粒和空载体经脂质体(lipofectin)同时分别转染COS-7细胞和滑膜细胞，24和48 h后采用竞争抑制性ELISA[4]检测COS-7细胞培养上清内IL-1ra水平。待测上清及其稀释液首先与含一定浓度IL-1ra抗体的液体混合，再加于事先用IL-1ra包被过的96孔板中，然后用酶标二抗检测剩余的IL-1ra抗体结合到96孔板上的量。因此，样品中IL-1ra含量越高，与其作用后剩余IL-1ra抗体的量越少，酶标二抗所能结合的量也越少，显色也越浅，光密度(OD)值也越小；反之显色深，OD值大。转染滑膜细胞48 h后，采用原位杂交[5]和免疫组化[5]的SP法分别检测IL-1ra mRNA和IL-1ra的表达，其结果用计算机作图像分析，并对图像灰度测定结果(OD值)进行统计学分析。(2) 体内局部肌肉组织IL-1ra表达的检测：给10周龄DBA/1小鼠后腿肌肉注射0.25%布比卡因80 μl，2 d后于小鼠后腿行多点、沿肌纤维走向注射pBK-IL-1ra和pBK-CMV各200 μg(200 μl)。用药后第4天，取局部肌肉组织作冰冻切片，用免疫组化SP法检测局部肌肉组织中IL-1ra表达情况，对每例小鼠表达结果进行计算机图像分析。原位杂交中，以不加探针、不加抗体和经Rnase消化处理的细胞的3种杂交作为阴性对照，阳性反应者胞浆内可见蓝紫色颗粒。在免疫组化SP法中，以不加初级抗体和不加次级抗体的标本作为阴性对照，阳性反应者胞浆内可见黄色颗粒沉着。
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统计学处理 数据以(±s)表示，组间差异显著性用t检验。
结 果
IL-1ra PCR扩增 经PCR从U937细胞cDNA文库中扩增出hIL-1ra，扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现一500 bp左右的条带。
重组质粒的鉴定 (1) 经HindⅢ、EcoRⅠ+HindⅢ、KpnⅠ、PvyⅡ及StyⅠ酶切的结果见图1。(2) 在载体上靠近插入片段上游含有T7启动子，经采用T7引物/IL-1ra 3′端引物对重组质粒进行PCR扩增，结果表明，目的片段为正向插入(图1)。(3) 经DNA序列分析表明，所获扩增产物与文献报道IL-1ra cDNA序列完全一致。
图 1 pBK-IL-1ra的酶切鉴定
Fig 1 Enzyme digesting analysis of pBK-IL-1ra
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1.DNA Marker(λDNA Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ);2.pBK-CMV vector;3.pBK-IL-1ra plasmid;4.pBK-IL-1ra EcoR Ⅰ cut;5.pBK-IL-1ra Hind Ⅲ
cut; 6.pBK-IL-1ra EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ cut;7.pBK-IL-1ra Kpn Ⅰ cut; 8.pBK-IL-1ra Pvu Ⅱ cut;9.pBK-IL-1ra Sty I cut;10.PCR product (T7 primer and 3′primer)
竞争抑制性ELISA检测结果 pBK-IL-1ra转染COS-7细胞24 h后，细胞培养原液及其1∶10和1∶50稀释液中IL-1ra水平均明显高于pBK-CMV转染对照组(P<0.001)，转染48 h后，细胞培养原液及其1∶10和1∶50稀释液中IL-1ra水平均较24 h 对应的IL-1ra水平有所降低(P<0.01)，但其原液及1∶10稀释液中IL-1ra水平仍明显高于pBK-CMV转染对照组(P<0.001)(表1)。
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IL-1ra mRNA和IL-1ra表达 pBK-IL-1ra转染48 h后，滑膜细胞胞浆内IL-1ra mRNA和IL-1ra表达均明显高于空载体对照，两组差异有显著性(P<0.01，P<0.05)(表2，表2中数据为计算机图象分析所得的OD值)。 原位杂交及免疫组化检测IL-1ra mRNA在滑膜细胞中的表达结果见图2，3。
表1 竞争抑制性ELISA检测细胞培养液中IL-1ra水平
Table 1 The levels of IL-1ra in the supernate detected by competitive inhibition ELISA(±s,n=6)
Plasmids
Samples
OD values
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Transfection for 24 h
Transfection for 48 h
pBK-IL-1ra
1∶1
0.088±0.020***
0.139±0.024**##
1∶10
0.261±0.032***
0.341±0.037**##
1∶50
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0.410±0.043***
0.518±0.050##
pBK-CMV
1∶1，1∶10，1∶50
0.542±0.048
0.542±0.048
t test,**P<0.01,***P<0.001 compared with pBK-CMV;##P<0.01 compared with transfectim for 24 h;OD:optical density mersured by densitometry表2 滑膜细胞胞浆内IL-1ra mRNA和IL-1ra表达
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Table 2 The gray grade of expression of IL-1ra mRNA and IL-1ra in synoviocytes(±s)
Plasmids
n
OD
IL-1ra mRNA
IL-1ra
pBK-IL-1ra
5
0.69±0.15*
0.32±0.07**
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pBK-CMV
5
0.43±0.08
0.21±0.05
t test,*P<0.05,**P<0.01 compared with pBK-CMV;OD:optical density measured by densitometry
体内局部肌肉组织IL-1ra表达 小鼠肌肉注射两种质粒后第4天后，pBK-IL-1ra注射组小鼠肌肉组织中IL-1ra表达明显高于空载体对照组(图4)。图像分析结果显示pBK-IL-1ra组(n=3)，OD为(0.36±0.03)，空载体对照组(n=3)OD为(0.20±0.02)，两组差异有显著性意义(P<0.01)。
讨 论
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IL-1ra是1985年首次从IgG刺激后的单核细胞培养上清中发现的，又称IL-1受体拮抗蛋白(IRAP)。它可与Ⅰ型和Ⅱ型IL-1受体(IL-1R)结合，从而成为IL-1和IL-1R结合的竞争性抑制物。正常人血清IL-1ra水平在200 pg/ml以下，在感染、炎症及内毒素血症患者血清中IL-1ra水平可高达8 ng/ml。IL-1ra能抑制由IL-1刺激引起的滑膜细胞PGE2的产生和软骨细胞胶原酶的合成，抑制胸腺细胞的增殖以及中性粒细胞、嗜酸性细胞与内皮细胞的粘附[6]。在临床及动物实验中已证明，IL-1ra在某些疾病中可发挥治疗作用，如：败血症性休克、关节炎、移植物抗宿主反应、糖尿病、白血病及急性神经退化等[2，7，8]，并且IL-1ra的副作用非常小，健康志愿者注射大剂量IL-1ra未引起任何不良反应[7]。但当需要较大限度地抑制IL-1的作用时，阻断IL-1半数生物效应时所需的IL-1ra是IL-1用量的10～100倍甚至500倍，从而明显地提高了其临床应用的成本费用。另外，由于IL-1ra在血液中的半衰期短(6 min)，需要反复长期用药才能维持疗效，不便于临床应用。于是有人用腺病毒或逆转录病毒将IL-1ra的cDNA导入动物体内，虽然收到了一定效果[9，10]，但是，鉴于病毒载体的免疫致敏性和细胞毒性等副作用，目前尚难推广应用于临床，而更为安全有效的IL-1ra基因给药方式尚未见报道。因此，本研究从LPS刺激U937细胞后构建的cDNA文库中经PCR扩增获得人IL-1ra cDNA，并将其亚克隆到测序载体PGEM-T Easy Vector中，然后将(IL-1ra)片段插入真核表达载体pBK-CMV中，构建成真核表达质粒pBK-IL-1ra，经酶切、PCR及DNA测序均证实了插入片段的正确性。该质粒上游含有巨细胞病毒(CMV)启动子，具有卡那霉素抗性基因。重组质粒和对应空载体经脂质体介导转染COS-7细胞和滑膜细胞后，经竞争抑制性ELISA检测法显示，转染pBK-IL-1ra 24和48 h后，COS-7细胞培养液中IL-1ra水平较对照组明显升高。以重组质粒转染滑膜细胞48 h后，经原位杂交和免疫组化检测表明，转染的滑膜细胞IL-1ra mRNA和IL-1ra表达明显高于空载体。一次性肌肉注射pBK-IL-1ra及pBK-CMV 3 d后，小鼠局部肌肉组织中IL-1ra表达也明显高于空载体对照组。以上结果表明，质粒pBK-IL-1ra在体外和体内转染后，真核细胞可明显表达IL-1ra。真核表达质粒pBK-IL-1ra的构建成功，为进一步研究IL-1ra在体内和体外的作用提供了必要的条件。
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杨高云(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
李芳(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
蒋明(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
狄春辉(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
黄家强(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院免疫内科，北京100730)
参考文献
1，Stephen PE,Ron JE,William PA,et al.Primary structure and functional expression from complementary DNA of a human interleukin-1 receptor antagonist.Nature,1990,343(6256):341-346
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