碱性成纤维细胞生长因子与纤维蛋白黏合剂对半月板无血运区损伤的修复作用
碱性成纤维细胞生长因子与纤维蛋白黏合剂对半月板无血运区损伤的修复作用
熊建义 陈其勋 云经平 肖建德
摘 要 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与纤维蛋白黏合剂(FTA)对半月板无血运区损伤的修复作用。 方法 选用健康成年青紫兰兔36只，在兔半月板上造成统一的无血运区损伤。随机将兔分成3组，分别为空白对照组、FTA治疗组和FGF/FTA治疗组。术后2，6，12周分批处死动物，进行大体形态观察和组织学检查。 结果 FTA治疗组能形成瘢痕组织愈合；FGF/FTA治疗组为纤维软骨样组织愈合，但其愈合组织与正常半月板组织仍有差异。 结论FTA是一种理想的生物性载体，与FGF有较好的相容性；应用FGF与FTA复合物治疗半月板无血运区损伤是一条有效的治疗途径。
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；创伤和损伤，半月板；纤维蛋白组织黏合剂
, 百拇医药
近年的研究表明，膝半月板具有重要的生理功能，半月板切除后可引起关节的退行性变性[1]。由于半月板游离缘(无血运区)损伤不能自然愈合，因此，研究半月板无血运区损伤愈合的条件就具有重要意义。笔者在动物体内采用纤维蛋白黏合剂(FTA)及成纤维细胞生长因子(FGF)/FTA治疗半月板无血运区的损伤，取得较好效果。
材料与方法
一、FGF来源与FTA复合物的制备
重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF)为珠海东大生物制药有限公司出品，凝血酶为珠海经济特区生物化学制药厂出品。纤维蛋白原按Kjaergard等[2]报告的方法自行制备。FTA的配制：分别用1ml等渗盐水溶解纤维蛋白原及凝血酶，再分别吸入注射器。治疗时，可直视下将2副注射器同时推进，注射于治疗部位即可。bFGF/FTA复合物的配制：分别用2 ml等渗盐水溶解bFGF 20 μg，然后用溶液分别溶解凝血酶及纤维蛋白原，使bFGF浓度为10 μg/ml，再分别吸入2副注射器备用。
, 百拇医药
二、动物实验
健康成年青紫兰兔36只，体重2.0～3.1 kg。随机分为空白对照组、FTA治疗组和FGF/FTA治疗组。以质量浓度为25 g/L的戊巴比妥钠静脉注射麻醉(25 mg/kg)。取双膝髌韧带内侧弧形切口，沿髌骨内上缘至胫骨结节处切开皮肤，用自制半月板拉钩显露内侧半月板前角、体部及股骨髁软骨面；用镰状刀片于内侧半月板前角和体部中央作一长0.7 cm、宽0.3 cm的全层裂伤，然后分别用FTA或FGF/FTA 注入裂口，至填塞物与半月板表面平齐为止；空白对照组不用任何填塞处理。分别于术后2，6，12周处死动物，每组每期为4只共8个半月板，行大体形态观察和组织学检查。将半月板标本进行大体形态观察后，再置入体积分数为4%的甲醛溶液中固定1～3 d，然后进行脱水、浸蜡与包埋，标本采用HE染色，光镜检查。
结 果
一、大体观察
, 百拇医药
观察3组共36只兔手术侧膝关节无切口感染及关节积液，无半月板与关节面软骨粘连；空白对照组半月板裂口均未愈合，未见组织填充；FTA组及FGF/FTA组的全部半月板伤口均已被组织填充。愈合组织的颜色比正常半月板组织深，裂口较术前变窄，表面稍向内陷，愈合组织与邻近半月板组织粘连紧密。
二.组织学检查
1.FTA组：术后2周,镜下见半月板缺损被纤维蛋白填充，这些组织因脱水变得较松散，偶可见少许成纤维细胞样细胞；术后6周，组织学见缺损覆盖处组织与纤维组织相似，偏振光显微镜检查显示细胞邻近有松散的编织状胶原纤维、基质周围可见散在成纤维细胞样细胞；术后12周，所有缺损被胶原纤维样组织填充，有较多的成纤维细胞样细胞，与邻近组织连接较紧密(图1)。
2.FGF/FTA组：术后2周，见缺损被红色纤维蛋白组织填充，充满整个缺损区，亦可见少量成纤维细胞样细胞；术后6周，镜下可见缺损被胶原纤维组织填充，成纤维细胞为主要细胞成分，其中有些区域可见纤维软骨样组织；术后12周，所有缺损均被纤维软骨样组织填充(图2)。细胞呈圆形或椭圆形，可见软骨细胞特有的软骨陷窝及软骨囊，但修复的组织与邻近正常的半月板组织仍有差异，愈合组织中仍可见成纤维细胞样细胞(图3)。
, 百拇医药
图1 FTA组术后12周，其愈合表现为纤维组织样愈合 HE×100
图2 FGF/FTA组术后12周，裂口处表现为纤维
软骨组织愈合 HE×100
图3 FGF/FTA组术后12周，愈合组织中可见纤维软骨
样细胞(C)及成纤维细胞样细胞(f) HE×100
, 百拇医药
3.对照组：术后2～12周共观察空白对照组半月板24个，其裂口均未愈合，边缘无软骨细胞增殖。
讨 论
一、 半月板无血运区损伤的自然转归
本实验的主要目的是探索半月板无血运区损伤愈合的条件。在实验设计时，有一组为空白对照组，至术后12周检查损伤的半月板，其裂口均未见愈合。此结果与国内外许多学者的研究结果一致，即半月板无血运区损伤后，不能自然愈合[3]。但近年的研究表明，半月板并非完全惰性的组织，在一定的条件下(如电刺激)，半月板无血运区的损伤可产生纤维组织愈合[4]。因此，笔者认为，半月板无血运区损伤不能自然愈合，要促使其愈合，必须借助于一定的外部条件。
二、FTA在半月板损伤愈合中的作用
FTA为一种低抗原性的生物大分子材料。80年前，就发现它有伤口止血的作用，此后，FTA的应用逐渐广泛。现在已知道，纤维蛋白在伤口愈合过程中起着重要作用。它在伤口内形成的网状物既可作为成纤维细胞移行生长的支架，又可作为一种止血物质。近年来，FTA作为一种生物性载体的应用逐渐增多。有人研究了FTA作为某些骨生长因子如骨形态发生蛋白(BMP)的生理释放系统，证明FTA可逐渐释放骨生长因子，BMP/FTA可增强BMP的诱导成骨活性[5]。本实验组中，单用FTA治疗组结果证实，FTA具有刺激伤口处成纤维细胞生长，诱导胶原纤维形成的作用，可形成瘢痕组织愈合。根据本实验结果分析，笔者赞同Arnoczky等[6]的观点，即半月板无血运区损伤不愈合的主要原因是半月板创口内无纤维蛋白凝块，后者可作为细胞基质的支架，并对创口愈合的细胞成分起刺激作用。笔者认为，FTA不仅可作为一种创口愈合的支架，而且也是一种较好的生物性载体。但单用FTA治疗半月板损伤只能形成瘢痕组织愈合，其治疗效果有待进一步提高。
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三、FGF/FTA在半月板损伤愈合中的作用
近十几年的研究表明，FGF的作用范围十分广泛，它有较强的诱导中胚层细胞转化为成纤维细胞的作用。通过体外细胞培养及动物体内实验证明，FGF在创伤愈合过程中起重要作用。它能刺激创口内各类细胞的增殖，这些细胞包括毛细血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和软骨细胞等[7]。Debber等[1]通过半月板软骨细胞培养证明，FGF能有效刺激半月板软骨细胞内DNA的合成，促进纤维软骨细胞进行有丝分裂及增殖。
笔者曾单独应用FGF治疗半月板损伤，发现对无血运区半月板的损伤愈合无明显影响，考虑主要与半月板创口内无桥架材料以及FGF无保护剂型及载体，在体内易被吸收和降解等有关。本实验结果表明，FGF/FTA可增强FGF的生物学活性，比单用FGF或单用FTA效果好，可形成纤维软骨样愈合。但其愈合组织与正常半月板纤维软骨组织仍有差异，主要原因为：(1)半月板损伤愈合的观察时间不够长，细胞尚未全部分化为成熟的纤维软骨细胞；(2)所给予的半月板损伤愈合的条件尚不完善，如还需要其他生长因子的相互作用等。
, http://www.100md.com
熊建义(518029 深圳市红十字会医院骨科)
肖建德(518029 深圳市红十字会医院骨科)
陈其勋(中山医科大学附属第三医院骨科)
云经平(中山医科大学附属肿瘤医院病理科)
参考文献
1，Debber RJ， Harris MG， Hough AJ. Serum-free culture of rabbit meniscal fibrochondrocytes: proliferative response. J Orthop Res， 1988， 6: 13-19.
2，Kjaergard HK， Weis Fough US， Sorensen H， et al. A simple method of preparation of autologous fibrin by means of ethanol. Surg Gymecol Obstet， 1992， 175: 72-78.
, 百拇医药
3，Alpar EK. Meniscus repair. Arch Orthop Surg， 1991， 110: 112-116.
4，刘晋才，黄海洋. 电刺激半月板无血运区愈合的组织学特征. 中华骨科杂志，1996， 16：47-49.
5，Kawamura M， Urist MR. Human fibrin is a physiologic delivery system for bone morphogenetic protein. Clin Orthop， 1988， (235): 302-311.
6，Arnoczky SP， Warren RF， Spivak JM. Meniscal repair using an exogenous fibrin clot. J Bone Joint Surg (Am)， 1988， 70：1209-1215.
7，Gospodarowice D. Fibroblast growth factor. Clin Orthop， 1990， (257): 231-242., http://www.100md.com
熊建义 陈其勋 云经平 肖建德
摘 要 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与纤维蛋白黏合剂(FTA)对半月板无血运区损伤的修复作用。 方法 选用健康成年青紫兰兔36只，在兔半月板上造成统一的无血运区损伤。随机将兔分成3组，分别为空白对照组、FTA治疗组和FGF/FTA治疗组。术后2，6，12周分批处死动物，进行大体形态观察和组织学检查。 结果 FTA治疗组能形成瘢痕组织愈合；FGF/FTA治疗组为纤维软骨样组织愈合，但其愈合组织与正常半月板组织仍有差异。 结论FTA是一种理想的生物性载体，与FGF有较好的相容性；应用FGF与FTA复合物治疗半月板无血运区损伤是一条有效的治疗途径。
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；创伤和损伤，半月板；纤维蛋白组织黏合剂
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近年的研究表明，膝半月板具有重要的生理功能，半月板切除后可引起关节的退行性变性[1]。由于半月板游离缘(无血运区)损伤不能自然愈合，因此，研究半月板无血运区损伤愈合的条件就具有重要意义。笔者在动物体内采用纤维蛋白黏合剂(FTA)及成纤维细胞生长因子(FGF)/FTA治疗半月板无血运区的损伤，取得较好效果。
材料与方法
一、FGF来源与FTA复合物的制备
重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF)为珠海东大生物制药有限公司出品，凝血酶为珠海经济特区生物化学制药厂出品。纤维蛋白原按Kjaergard等[2]报告的方法自行制备。FTA的配制：分别用1ml等渗盐水溶解纤维蛋白原及凝血酶，再分别吸入注射器。治疗时，可直视下将2副注射器同时推进，注射于治疗部位即可。bFGF/FTA复合物的配制：分别用2 ml等渗盐水溶解bFGF 20 μg，然后用溶液分别溶解凝血酶及纤维蛋白原，使bFGF浓度为10 μg/ml，再分别吸入2副注射器备用。
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二、动物实验
健康成年青紫兰兔36只，体重2.0～3.1 kg。随机分为空白对照组、FTA治疗组和FGF/FTA治疗组。以质量浓度为25 g/L的戊巴比妥钠静脉注射麻醉(25 mg/kg)。取双膝髌韧带内侧弧形切口，沿髌骨内上缘至胫骨结节处切开皮肤，用自制半月板拉钩显露内侧半月板前角、体部及股骨髁软骨面；用镰状刀片于内侧半月板前角和体部中央作一长0.7 cm、宽0.3 cm的全层裂伤，然后分别用FTA或FGF/FTA 注入裂口，至填塞物与半月板表面平齐为止；空白对照组不用任何填塞处理。分别于术后2，6，12周处死动物，每组每期为4只共8个半月板，行大体形态观察和组织学检查。将半月板标本进行大体形态观察后，再置入体积分数为4%的甲醛溶液中固定1～3 d，然后进行脱水、浸蜡与包埋，标本采用HE染色，光镜检查。
结 果
一、大体观察
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观察3组共36只兔手术侧膝关节无切口感染及关节积液，无半月板与关节面软骨粘连；空白对照组半月板裂口均未愈合，未见组织填充；FTA组及FGF/FTA组的全部半月板伤口均已被组织填充。愈合组织的颜色比正常半月板组织深，裂口较术前变窄，表面稍向内陷，愈合组织与邻近半月板组织粘连紧密。
二.组织学检查
1.FTA组：术后2周,镜下见半月板缺损被纤维蛋白填充，这些组织因脱水变得较松散，偶可见少许成纤维细胞样细胞；术后6周，组织学见缺损覆盖处组织与纤维组织相似，偏振光显微镜检查显示细胞邻近有松散的编织状胶原纤维、基质周围可见散在成纤维细胞样细胞；术后12周，所有缺损被胶原纤维样组织填充，有较多的成纤维细胞样细胞，与邻近组织连接较紧密(图1)。
2.FGF/FTA组：术后2周，见缺损被红色纤维蛋白组织填充，充满整个缺损区，亦可见少量成纤维细胞样细胞；术后6周，镜下可见缺损被胶原纤维组织填充，成纤维细胞为主要细胞成分，其中有些区域可见纤维软骨样组织；术后12周，所有缺损均被纤维软骨样组织填充(图2)。细胞呈圆形或椭圆形，可见软骨细胞特有的软骨陷窝及软骨囊，但修复的组织与邻近正常的半月板组织仍有差异，愈合组织中仍可见成纤维细胞样细胞(图3)。
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图1 FTA组术后12周，其愈合表现为纤维组织样愈合 HE×100
图2 FGF/FTA组术后12周，裂口处表现为纤维
软骨组织愈合 HE×100
图3 FGF/FTA组术后12周，愈合组织中可见纤维软骨
样细胞(C)及成纤维细胞样细胞(f) HE×100
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3.对照组：术后2～12周共观察空白对照组半月板24个，其裂口均未愈合，边缘无软骨细胞增殖。
讨 论
一、 半月板无血运区损伤的自然转归
本实验的主要目的是探索半月板无血运区损伤愈合的条件。在实验设计时，有一组为空白对照组，至术后12周检查损伤的半月板，其裂口均未见愈合。此结果与国内外许多学者的研究结果一致，即半月板无血运区损伤后，不能自然愈合[3]。但近年的研究表明，半月板并非完全惰性的组织，在一定的条件下(如电刺激)，半月板无血运区的损伤可产生纤维组织愈合[4]。因此，笔者认为，半月板无血运区损伤不能自然愈合，要促使其愈合，必须借助于一定的外部条件。
二、FTA在半月板损伤愈合中的作用
FTA为一种低抗原性的生物大分子材料。80年前，就发现它有伤口止血的作用，此后，FTA的应用逐渐广泛。现在已知道，纤维蛋白在伤口愈合过程中起着重要作用。它在伤口内形成的网状物既可作为成纤维细胞移行生长的支架，又可作为一种止血物质。近年来，FTA作为一种生物性载体的应用逐渐增多。有人研究了FTA作为某些骨生长因子如骨形态发生蛋白(BMP)的生理释放系统，证明FTA可逐渐释放骨生长因子，BMP/FTA可增强BMP的诱导成骨活性[5]。本实验组中，单用FTA治疗组结果证实，FTA具有刺激伤口处成纤维细胞生长，诱导胶原纤维形成的作用，可形成瘢痕组织愈合。根据本实验结果分析，笔者赞同Arnoczky等[6]的观点，即半月板无血运区损伤不愈合的主要原因是半月板创口内无纤维蛋白凝块，后者可作为细胞基质的支架，并对创口愈合的细胞成分起刺激作用。笔者认为，FTA不仅可作为一种创口愈合的支架，而且也是一种较好的生物性载体。但单用FTA治疗半月板损伤只能形成瘢痕组织愈合，其治疗效果有待进一步提高。
, 百拇医药
三、FGF/FTA在半月板损伤愈合中的作用
近十几年的研究表明，FGF的作用范围十分广泛，它有较强的诱导中胚层细胞转化为成纤维细胞的作用。通过体外细胞培养及动物体内实验证明，FGF在创伤愈合过程中起重要作用。它能刺激创口内各类细胞的增殖，这些细胞包括毛细血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和软骨细胞等[7]。Debber等[1]通过半月板软骨细胞培养证明，FGF能有效刺激半月板软骨细胞内DNA的合成，促进纤维软骨细胞进行有丝分裂及增殖。
笔者曾单独应用FGF治疗半月板损伤，发现对无血运区半月板的损伤愈合无明显影响，考虑主要与半月板创口内无桥架材料以及FGF无保护剂型及载体，在体内易被吸收和降解等有关。本实验结果表明，FGF/FTA可增强FGF的生物学活性，比单用FGF或单用FTA效果好，可形成纤维软骨样愈合。但其愈合组织与正常半月板纤维软骨组织仍有差异，主要原因为：(1)半月板损伤愈合的观察时间不够长，细胞尚未全部分化为成熟的纤维软骨细胞；(2)所给予的半月板损伤愈合的条件尚不完善，如还需要其他生长因子的相互作用等。
, http://www.100md.com
熊建义(518029 深圳市红十字会医院骨科)
肖建德(518029 深圳市红十字会医院骨科)
陈其勋(中山医科大学附属第三医院骨科)
云经平(中山医科大学附属肿瘤医院病理科)
参考文献
1，Debber RJ， Harris MG， Hough AJ. Serum-free culture of rabbit meniscal fibrochondrocytes: proliferative response. J Orthop Res， 1988， 6: 13-19.
2，Kjaergard HK， Weis Fough US， Sorensen H， et al. A simple method of preparation of autologous fibrin by means of ethanol. Surg Gymecol Obstet， 1992， 175: 72-78.
, 百拇医药
3，Alpar EK. Meniscus repair. Arch Orthop Surg， 1991， 110: 112-116.
4，刘晋才，黄海洋. 电刺激半月板无血运区愈合的组织学特征. 中华骨科杂志，1996， 16：47-49.
5，Kawamura M， Urist MR. Human fibrin is a physiologic delivery system for bone morphogenetic protein. Clin Orthop， 1988， (235): 302-311.
6，Arnoczky SP， Warren RF， Spivak JM. Meniscal repair using an exogenous fibrin clot. J Bone Joint Surg (Am)， 1988， 70：1209-1215.
7，Gospodarowice D. Fibroblast growth factor. Clin Orthop， 1990， (257): 231-242., http://www.100md.com