丝裂原活化蛋白激酶信号途径在热休克蛋白90基因表达中的作用
丝裂原活化蛋白激酶信号途径在热休克蛋白90基因表达中的作用
李江伟 吴宁华 沈珝琲
摘 要 目的 研究丝裂原活化蛋白激酶-(MAPK)信号传导途径对Jurkat细胞中热休克蛋白90基因(hsp90)表达的影响。方法 用Western免疫印迹-增强型化学发光系统(ECL)检测热休克前后Jurkat细胞胞外信号调节激酶(ERK)、p38激酶及c-Jun N-末端蛋白激酶(JNK)的底物c-Jun的磷酸化程度；分别用JNK1的显性负突变质粒DN-JNK1、p38 cDNA反义表达质粒anti-p38及ERK激酶的特异性抑制剂PD98059瞬时转染或处理Jurkat细胞，再行RT-PCR检测hsp90α和hsp90β基因的表达水平。分别以转染空载体(pCDNA3)及未经任何处理的Jurkat细胞作为相应对照组。 结果 45℃热休克15 min后，Jurkat细胞中JNK1和p38激酶的磷酸化程度与热休克前相比明显增强，ERK的磷酸化较热休克前有所增强。转染DN-JNK1的细胞中hsp90α和hsp90β基因的组成性和热诱导表达均较转染空载体的对照组降低，尤其对hsp90α基因的热诱导表达的影响更为明显(仅为对照组的68%)；转染anti-p38后，hsp90α基因的组成性表达和hsp90β基因热诱导表达分别比转染空载体的对照组增加26%和22%；经PD98059处理的Jurkat细胞中，hsp90α基因的组成性表达比未处理的细胞增加46%，但PD98059处理对hsp90α和hsp90β基因的热诱导表达均无显著影响。结论 证实了ERK途径在hsp90α基因的组成性表达中起抑制作用，JNK途径参与hsp90α和hsp90β基因的组成性和热诱导表达，而p38途径可能对hsp90基因的表达不起重要作用。
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关键词：丝裂原活化蛋白激酶；胞外信号调节激酶；p38激酶；c-Jun N-末端蛋白激酶；热休克蛋白90；基因表达；热休克
热休克蛋白90(Hsp90)是真核细胞胞质中最丰富的蛋白质之一。Hsp90能使在各种应激反应中积累的误折叠蛋白再折叠，并可促进已产生突变的蛋白质降解。Hsp90还参与激素受体、其它转录因子、信号途径和翻译起始阶段的激酶及一氧化氮合酶的成熟、胞内转运和活性调节[1]。此外，Rutherford等[2]的研究表明Hsp90还具有使突变蛋白质具备类似野生型构象活性的作用。因此，研究这类进化上非常保守的蛋白的基因表达调控机制和相关的信号转导是非常重要的。
研究表明hsp90基因的两种拷贝hsp90α和hsp90β基因具有不同的组成性和热诱导表达调控机制，热休克因子1(HSF1)在hsp90α和hsp90β基因的表达调控中起关键作用[3，4]。HSF1的磷酸化是调节HSF1功能的重要方式[5]。细胞中转录因子的磷酸化可通过多种途径完成，其中3种是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径：胞外信号调节激酶(ERK)途径、c-Jun N-末端蛋白激酶(JNK)途径和p38激酶途径[6]。MAPK的苏氨酸残基和酪氨酸残基双重磷酸化后被活化，这种双重磷酸化是由MAPK激酶(MAPKK或MEK)所催化的。MAPK活化后可进一步磷酸化磷脂酶A2、其它的蛋白激酶、转录因子等多种蛋白[7]。尽管已有文献报道热休克中MAPK被激活，但是尚鲜见关于MAPK与hsp90基因表达关系的报道。本研究观察在Jurkat细胞中ERK、JNK和p38途径是否参与hsp90α和hsp90β基因的组成性和热诱导表达。
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材料和方法
材料 JNK1的显性负突变质粒DN-JNK1和ERK激酶特异性抑制剂PD98059为Cal.Biochem公司产品；载体pCDNA3为Invitrogen公司产品；p38 cDNA的反义表达质粒anti-p38由中国科学院上海细胞生物学研究所裴纲教授惠赠。第一抗体：兔抗人非磷酸化JNK抗体、小鼠抗人磷酸化c-Jun抗体及兔抗人磷酸化ERK1抗体和非磷酸化ERK1/2抗体购自Santa Cruz公司；兔抗人磷酸化p38抗体和兔抗人非磷酸化p38抗体购自New England Biolabs公司。第二抗体：辣根过氧化物酶标记的抗山羊IgG抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体和抗兔IgG抗体购自中山生物技术公司。培养基RPMI1640、BCA蛋白分析试剂盒、硝酸纤维素膜和检测免疫复合物的增强型化学发光系统(ECL)分别为Gibco-BRL、Pierce、BioRad和Amersham公司产品。
细胞培养和热休克处理 Jurkat细胞培养在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃、5%二氧化碳、饱和湿度。热休克处理时，将细胞置于42℃或45℃水浴中，温浴时间按实验要求而定。
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全细胞抽提物(WCE)制备 基本按文献[8]方法进行，将Jurkart细胞用冷的磷酸钠缓冲液(PBS)洗涤2次后，以300 μl修饰的放射免疫沉淀分析溶液[8]裂解。将裂解液离心15 min(12 000 r/min)后收集上清，以BCA蛋白分析试剂盒测定上清中的总蛋白浓度。
Western免疫印迹-ECL分析 50 μg WCE经10%SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜上，然后用含有5%脱脂奶粉的TBST(0.02 mol/L Tris-HCl pH7.5、0.5 mol/L NaCl、0.05%Tween 20)在室温下将硝酸纤维素膜封闭60 min后，以TBST 洗涤1次；继之与1∶1 000稀释的第一抗体室温孵育60 min，再以TBST洗涤3次，每次10 min；然后再与1∶2 000稀释的相应的第二抗体室温孵育60 min，经TBST洗涤3次，每次5 min，最后用ECL检测MAPK或其底物的磷酸化状态。进行Western免疫印迹分析的分组为：(1)对照组，37℃培养；(2)42℃热休克60 min；(3)45℃热休克15 min；(4)42℃热休克60 min后，37℃恢复3 h；(5)45℃热休克15 min后，37℃恢复3 h。
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瞬时转染和竞争性RT-PCR 分别将pCDNA3、DN-JNK1和anti-p38各2 μg以DEAE-dextran方法[9]转染3组Jurkat细胞。转染后48 h收集细胞。在收集细胞前，将拟进行热休克的细胞在45℃保温15 min后，再于37℃恢复30 min。PD98059处理组：在热休克前60 min向未经转染的细胞培养基中加入PD98059，终浓度为10 μmol/L。细胞裂解和竞争性RT-PCR基本按照本组建立方法[10]进行。选用适当稀释的cRNA进行逆转录反应，反应产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶图像扫描仪(UVI公司的GAS7001B型)进行分析。转染DN-JNK1和anti-p38的细胞以转染空载体pCDNA3的细胞为对照，PD98059处理的细胞以未处理的细胞为对照。将各组hsp90α和hsp90β基因的组成性表达分别与相应对照组相比，得出各组组成性相对表达值；将各组hsp90α和hsp90β基因的热诱导表达后的表达值与其热休克前的组成性表达值相比得到诱导倍数，再与相应的对照组的诱导倍数相比得出各组热诱导的相对表达值。
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结 果
热休克后Jurkat细胞中MAPK的磷酸化状态 Western免疫印迹-ECL检测显示，42℃热休克不影响ERK1和p38激酶的磷酸化，45℃热休克时ERK、c-Jun和p38激酶均处于不同程度的磷酸化状态，尤其c-Jun明显地被磷酸化，但在37℃恢复3 h后，上述信号分子的磷酸化均消失(图1)。
抑制MAPK对hsp90基因表达的影响 经PD98059处理、转染anti-p38质粒，可分别使hsp90α基因的组成性表达水平增加46%和26%；而转染DN-JNK1后，hsp90α的组成性表达水平降低30%。对于hsp90α基因的热诱导表达， 抑制JNK途径时， hsp90α基因的mRNA水平降到对照组的68%， 而抑制ERK和p38激酶途径则无明显改变(图2和附表)。用PD98059抑制ERK途径后，hsp90β基因的组成性表达水平增加16%，低于PD98059对hsp90α基因的组成性表达的影响；转染DN-JNK1后，hsp90β基因的组成性表达降低了30%；转染anti-p38对hsp90β基因组成性表达无明显影响。用PD98059抑制ERK途径后，hsp90β基因的热诱导表达水平未见明显改变，抑制JNK途径，hsp90β基因的热诱导表达降低了12%，低于DN-JNK1对hsp90α基因的热诱导表达的影响。抑制p38激酶途径后，hsp90β基因的mRNA水平增加了22%(图3和附表)。
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图 1 热休克后Jurkat细胞中ERK、p38激酶和c-Jun的
磷酸化
Fig 1 Phosphorylation of ERK,p38 kinase,and c-Jun in
Jurkat cells after heat shock
1.37℃; 2.42℃ 1 h;3.45℃ 15 min;4.42℃ 1 h and then
recovery at 37℃ for 3 h;5.45℃ 15 min and then recovery at 37℃ for 3 h
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图 2 hsp90α mRNA的RT-PCR产物电泳图谱
Fig 2 The electrophoretic profile of hsp90α mRNA after RT-PCR
1.control (non-transfection);2.transfected with pCDNA3;3.treated with PD98059;4.transfected with DN-JNK1;5.transfected with anti-p38
附表 抑制MAPK信号途径后hsp90α和hsp90β mRNA相对组成性表达水平和相对热诱导表达效率
Table The relative level of constitutive expression and relative efficiency of heat shocked induction of hsp90α and hsp90β mRNA in Jurkat cells after blocking MAPK pathway
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Groups
hsp90α
hsp90β
Relative level of
Relative efficiency
Relative level of
Relative efficiency
< constitutive
of heat shocked
constitutive
of heat shocked
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< expression
induction
expression
induction
Control
1
1
1
1
PD98059
1.46
0.97
1.16
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1.05
DN-JNK1
0.69
0.72
0.68
0.88
Anti-p38
1.26
1.07
1.05
1.22
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图 3 hsp90β mRNA的RT-PCR产物电泳图谱
Fig 3 The electrophoretic profile of hsp90β mRNA after RT-PCR
1.control (non-transfection);
2.transfected with pCDNA3;
3.treated with PD98059;
4.transfected with DN-JNK1;
5.transfected with anti-p38
讨 论
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研究表明，ERK1能与糖元合成酶激酶3(GSK3)共同作用，抑制生理温度和热休克时HSF1的转录激活活性[11]，据报道ERK1/2参与HSF1的活化，介导铬离子对Hsp70的诱导表达[12]。以PD98059抑制ERK途径后，hsp90α基因和hsp90β基因的组成性表达增加，说明ERK途径具有抑制hsp90基因的组成性表达的作用，推测ERK1可通过磷酸化HSF1抑制其转录激活活性，从而抑制hsp90基因的组成性表达。但阻断ERK信号途径后并不影响hsp90基因的热诱导表达，可能由于热休克时HSF1所处于的特殊的磷酸化状态屏蔽了组成性表达时ERK1对HSF1的磷酸化作用。
45℃热休克时c-Jun明显地被磷酸化。而c-Jun是JNK的天然底物，它的磷酸化代表着JNK处于活化状态[13]，表明45℃热休克时JNK处于活化状态。以显性负突变质粒DN-JNK1阻断JNK途径后hsp90基因的组成性和热诱导表达均被显著抑制，说明JNK1参与hsp90基因的表达调控。JNK1不能使HSF1[11]磷酸化，所以，它可能是通过其它机制起作用的。hsp90α基因上游调控序列和hsp90β基因的第一内含子中均存在AP-1结合位点，因此，JNK1可能是通过磷酸化c-Jun而起作用。Hsp70可以抑制JNK的进一步活化[13]，而Hsp70行使功能时需要Hsp90的协助[14]，热诱导产生的Hsp90对JNK的活化是否有“反馈抑制”作用有待于进一步研究。
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以反义表达质粒anti-p38阻断p38激酶途径时，对hsp90α基因的热诱导表达和hsp90β基因组成性表达并无显著影响，而对hsp90β基因的热诱导表达和hsp90α基因的组成性表达虽然有一定的促进作用，但与ERK和JNK途径相比，p38激酶信号途径可能在hsp90基因的表达中不起重要作用。
本研究结果显示阻断JNK1途径并不能完全抑制hsp90基因的热诱导表达，所以除JNK1外，其它激酶，如PKC也可能参与hsp90基因的热诱导表达[15]。尤其值得重视的是Hsp90自身能够对HSF1的转录激活活性起抑制作用[16]，Hsp90能否作为热信号的感应者，进而对自身的表达起到调控作用，还有待于进一步的研究。
李江伟(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
吴宁华(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
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沈珝琲(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
参考文献
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李江伟 吴宁华 沈珝琲
摘 要 目的 研究丝裂原活化蛋白激酶-(MAPK)信号传导途径对Jurkat细胞中热休克蛋白90基因(hsp90)表达的影响。方法 用Western免疫印迹-增强型化学发光系统(ECL)检测热休克前后Jurkat细胞胞外信号调节激酶(ERK)、p38激酶及c-Jun N-末端蛋白激酶(JNK)的底物c-Jun的磷酸化程度；分别用JNK1的显性负突变质粒DN-JNK1、p38 cDNA反义表达质粒anti-p38及ERK激酶的特异性抑制剂PD98059瞬时转染或处理Jurkat细胞，再行RT-PCR检测hsp90α和hsp90β基因的表达水平。分别以转染空载体(pCDNA3)及未经任何处理的Jurkat细胞作为相应对照组。 结果 45℃热休克15 min后，Jurkat细胞中JNK1和p38激酶的磷酸化程度与热休克前相比明显增强，ERK的磷酸化较热休克前有所增强。转染DN-JNK1的细胞中hsp90α和hsp90β基因的组成性和热诱导表达均较转染空载体的对照组降低，尤其对hsp90α基因的热诱导表达的影响更为明显(仅为对照组的68%)；转染anti-p38后，hsp90α基因的组成性表达和hsp90β基因热诱导表达分别比转染空载体的对照组增加26%和22%；经PD98059处理的Jurkat细胞中，hsp90α基因的组成性表达比未处理的细胞增加46%，但PD98059处理对hsp90α和hsp90β基因的热诱导表达均无显著影响。结论 证实了ERK途径在hsp90α基因的组成性表达中起抑制作用，JNK途径参与hsp90α和hsp90β基因的组成性和热诱导表达，而p38途径可能对hsp90基因的表达不起重要作用。
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关键词：丝裂原活化蛋白激酶；胞外信号调节激酶；p38激酶；c-Jun N-末端蛋白激酶；热休克蛋白90；基因表达；热休克
热休克蛋白90(Hsp90)是真核细胞胞质中最丰富的蛋白质之一。Hsp90能使在各种应激反应中积累的误折叠蛋白再折叠，并可促进已产生突变的蛋白质降解。Hsp90还参与激素受体、其它转录因子、信号途径和翻译起始阶段的激酶及一氧化氮合酶的成熟、胞内转运和活性调节[1]。此外，Rutherford等[2]的研究表明Hsp90还具有使突变蛋白质具备类似野生型构象活性的作用。因此，研究这类进化上非常保守的蛋白的基因表达调控机制和相关的信号转导是非常重要的。
研究表明hsp90基因的两种拷贝hsp90α和hsp90β基因具有不同的组成性和热诱导表达调控机制，热休克因子1(HSF1)在hsp90α和hsp90β基因的表达调控中起关键作用[3，4]。HSF1的磷酸化是调节HSF1功能的重要方式[5]。细胞中转录因子的磷酸化可通过多种途径完成，其中3种是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径：胞外信号调节激酶(ERK)途径、c-Jun N-末端蛋白激酶(JNK)途径和p38激酶途径[6]。MAPK的苏氨酸残基和酪氨酸残基双重磷酸化后被活化，这种双重磷酸化是由MAPK激酶(MAPKK或MEK)所催化的。MAPK活化后可进一步磷酸化磷脂酶A2、其它的蛋白激酶、转录因子等多种蛋白[7]。尽管已有文献报道热休克中MAPK被激活，但是尚鲜见关于MAPK与hsp90基因表达关系的报道。本研究观察在Jurkat细胞中ERK、JNK和p38途径是否参与hsp90α和hsp90β基因的组成性和热诱导表达。
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材料和方法
材料 JNK1的显性负突变质粒DN-JNK1和ERK激酶特异性抑制剂PD98059为Cal.Biochem公司产品；载体pCDNA3为Invitrogen公司产品；p38 cDNA的反义表达质粒anti-p38由中国科学院上海细胞生物学研究所裴纲教授惠赠。第一抗体：兔抗人非磷酸化JNK抗体、小鼠抗人磷酸化c-Jun抗体及兔抗人磷酸化ERK1抗体和非磷酸化ERK1/2抗体购自Santa Cruz公司；兔抗人磷酸化p38抗体和兔抗人非磷酸化p38抗体购自New England Biolabs公司。第二抗体：辣根过氧化物酶标记的抗山羊IgG抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体和抗兔IgG抗体购自中山生物技术公司。培养基RPMI1640、BCA蛋白分析试剂盒、硝酸纤维素膜和检测免疫复合物的增强型化学发光系统(ECL)分别为Gibco-BRL、Pierce、BioRad和Amersham公司产品。
细胞培养和热休克处理 Jurkat细胞培养在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃、5%二氧化碳、饱和湿度。热休克处理时，将细胞置于42℃或45℃水浴中，温浴时间按实验要求而定。
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全细胞抽提物(WCE)制备 基本按文献[8]方法进行，将Jurkart细胞用冷的磷酸钠缓冲液(PBS)洗涤2次后，以300 μl修饰的放射免疫沉淀分析溶液[8]裂解。将裂解液离心15 min(12 000 r/min)后收集上清，以BCA蛋白分析试剂盒测定上清中的总蛋白浓度。
Western免疫印迹-ECL分析 50 μg WCE经10%SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜上，然后用含有5%脱脂奶粉的TBST(0.02 mol/L Tris-HCl pH7.5、0.5 mol/L NaCl、0.05%Tween 20)在室温下将硝酸纤维素膜封闭60 min后，以TBST 洗涤1次；继之与1∶1 000稀释的第一抗体室温孵育60 min，再以TBST洗涤3次，每次10 min；然后再与1∶2 000稀释的相应的第二抗体室温孵育60 min，经TBST洗涤3次，每次5 min，最后用ECL检测MAPK或其底物的磷酸化状态。进行Western免疫印迹分析的分组为：(1)对照组，37℃培养；(2)42℃热休克60 min；(3)45℃热休克15 min；(4)42℃热休克60 min后，37℃恢复3 h；(5)45℃热休克15 min后，37℃恢复3 h。
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瞬时转染和竞争性RT-PCR 分别将pCDNA3、DN-JNK1和anti-p38各2 μg以DEAE-dextran方法[9]转染3组Jurkat细胞。转染后48 h收集细胞。在收集细胞前，将拟进行热休克的细胞在45℃保温15 min后，再于37℃恢复30 min。PD98059处理组：在热休克前60 min向未经转染的细胞培养基中加入PD98059，终浓度为10 μmol/L。细胞裂解和竞争性RT-PCR基本按照本组建立方法[10]进行。选用适当稀释的cRNA进行逆转录反应，反应产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶图像扫描仪(UVI公司的GAS7001B型)进行分析。转染DN-JNK1和anti-p38的细胞以转染空载体pCDNA3的细胞为对照，PD98059处理的细胞以未处理的细胞为对照。将各组hsp90α和hsp90β基因的组成性表达分别与相应对照组相比，得出各组组成性相对表达值；将各组hsp90α和hsp90β基因的热诱导表达后的表达值与其热休克前的组成性表达值相比得到诱导倍数，再与相应的对照组的诱导倍数相比得出各组热诱导的相对表达值。
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结 果
热休克后Jurkat细胞中MAPK的磷酸化状态 Western免疫印迹-ECL检测显示，42℃热休克不影响ERK1和p38激酶的磷酸化，45℃热休克时ERK、c-Jun和p38激酶均处于不同程度的磷酸化状态，尤其c-Jun明显地被磷酸化，但在37℃恢复3 h后，上述信号分子的磷酸化均消失(图1)。
抑制MAPK对hsp90基因表达的影响 经PD98059处理、转染anti-p38质粒，可分别使hsp90α基因的组成性表达水平增加46%和26%；而转染DN-JNK1后，hsp90α的组成性表达水平降低30%。对于hsp90α基因的热诱导表达， 抑制JNK途径时， hsp90α基因的mRNA水平降到对照组的68%， 而抑制ERK和p38激酶途径则无明显改变(图2和附表)。用PD98059抑制ERK途径后，hsp90β基因的组成性表达水平增加16%，低于PD98059对hsp90α基因的组成性表达的影响；转染DN-JNK1后，hsp90β基因的组成性表达降低了30%；转染anti-p38对hsp90β基因组成性表达无明显影响。用PD98059抑制ERK途径后，hsp90β基因的热诱导表达水平未见明显改变，抑制JNK途径，hsp90β基因的热诱导表达降低了12%，低于DN-JNK1对hsp90α基因的热诱导表达的影响。抑制p38激酶途径后，hsp90β基因的mRNA水平增加了22%(图3和附表)。
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图 1 热休克后Jurkat细胞中ERK、p38激酶和c-Jun的
磷酸化
Fig 1 Phosphorylation of ERK,p38 kinase,and c-Jun in
Jurkat cells after heat shock
1.37℃; 2.42℃ 1 h;3.45℃ 15 min;4.42℃ 1 h and then
recovery at 37℃ for 3 h;5.45℃ 15 min and then recovery at 37℃ for 3 h
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图 2 hsp90α mRNA的RT-PCR产物电泳图谱
Fig 2 The electrophoretic profile of hsp90α mRNA after RT-PCR
1.control (non-transfection);2.transfected with pCDNA3;3.treated with PD98059;4.transfected with DN-JNK1;5.transfected with anti-p38
附表 抑制MAPK信号途径后hsp90α和hsp90β mRNA相对组成性表达水平和相对热诱导表达效率
Table The relative level of constitutive expression and relative efficiency of heat shocked induction of hsp90α and hsp90β mRNA in Jurkat cells after blocking MAPK pathway
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Groups
hsp90α
hsp90β
Relative level of
Relative efficiency
Relative level of
Relative efficiency
< constitutive
of heat shocked
constitutive
of heat shocked
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< expression
induction
expression
induction
Control
1
1
1
1
PD98059
1.46
0.97
1.16
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1.05
DN-JNK1
0.69
0.72
0.68
0.88
Anti-p38
1.26
1.07
1.05
1.22
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图 3 hsp90β mRNA的RT-PCR产物电泳图谱
Fig 3 The electrophoretic profile of hsp90β mRNA after RT-PCR
1.control (non-transfection);
2.transfected with pCDNA3;
3.treated with PD98059;
4.transfected with DN-JNK1;
5.transfected with anti-p38
讨 论
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研究表明，ERK1能与糖元合成酶激酶3(GSK3)共同作用，抑制生理温度和热休克时HSF1的转录激活活性[11]，据报道ERK1/2参与HSF1的活化，介导铬离子对Hsp70的诱导表达[12]。以PD98059抑制ERK途径后，hsp90α基因和hsp90β基因的组成性表达增加，说明ERK途径具有抑制hsp90基因的组成性表达的作用，推测ERK1可通过磷酸化HSF1抑制其转录激活活性，从而抑制hsp90基因的组成性表达。但阻断ERK信号途径后并不影响hsp90基因的热诱导表达，可能由于热休克时HSF1所处于的特殊的磷酸化状态屏蔽了组成性表达时ERK1对HSF1的磷酸化作用。
45℃热休克时c-Jun明显地被磷酸化。而c-Jun是JNK的天然底物，它的磷酸化代表着JNK处于活化状态[13]，表明45℃热休克时JNK处于活化状态。以显性负突变质粒DN-JNK1阻断JNK途径后hsp90基因的组成性和热诱导表达均被显著抑制，说明JNK1参与hsp90基因的表达调控。JNK1不能使HSF1[11]磷酸化，所以，它可能是通过其它机制起作用的。hsp90α基因上游调控序列和hsp90β基因的第一内含子中均存在AP-1结合位点，因此，JNK1可能是通过磷酸化c-Jun而起作用。Hsp70可以抑制JNK的进一步活化[13]，而Hsp70行使功能时需要Hsp90的协助[14]，热诱导产生的Hsp90对JNK的活化是否有“反馈抑制”作用有待于进一步研究。
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以反义表达质粒anti-p38阻断p38激酶途径时，对hsp90α基因的热诱导表达和hsp90β基因组成性表达并无显著影响，而对hsp90β基因的热诱导表达和hsp90α基因的组成性表达虽然有一定的促进作用，但与ERK和JNK途径相比，p38激酶信号途径可能在hsp90基因的表达中不起重要作用。
本研究结果显示阻断JNK1途径并不能完全抑制hsp90基因的热诱导表达，所以除JNK1外，其它激酶，如PKC也可能参与hsp90基因的热诱导表达[15]。尤其值得重视的是Hsp90自身能够对HSF1的转录激活活性起抑制作用[16]，Hsp90能否作为热信号的感应者，进而对自身的表达起到调控作用，还有待于进一步的研究。
李江伟(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
吴宁华(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
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沈珝琲(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
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