硫代修饰型反义寡核苷酸抑制肺癌细胞系端粒酶活性及增殖的研究
梅玫 余虹 张维铭 石建党 杨军谦
摘 要 目的 了解人肺癌细胞系的端粒酶活性情况。探讨硫代修饰型端粒酶RNA反义寡核苷酸封阻端粒酶RNA,对癌细胞代谢、生长的抑制作用。方法 采用端粒酶 PCR ELISA方法检测8种体外培养人肺癌细胞系端粒酶活性。合成端粒酶RNA的反义硫代寡核苷酸(6聚体、9聚体、12聚体)和随机序列寡核苷酸，分别导入LTEP-a-2细胞系，作用72 h。采用端粒酶 PCR ELISA方法检测端粒酶活性、四甲基偶氮唑盐(MTT)光吸收法检测琥珀酸脱氢酶(SDH)活性并做细胞增殖计数。结果 8种人肺癌细胞系端粒酶活性均呈不同程度阳性表达。3种端粒酶RNA反义寡核苷酸对LTEP-a-2细胞端粒酶活性、SDH活性及生长增殖均有抑制作用并随浓度升高而增强。3种反义寡核苷酸5～40 μmol/L对细胞端粒酶活性、SDH活性和增殖的抑制率分别为25.7%～84.0%、19.4%～74.7%和14.8%～72.5%。硫代修饰随机序列寡核苷酸对细胞端粒酶活性、SDH活性及生长增殖无明显抑制作用，与3种反义寡核苷酸抑制作用比较差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论 人肺癌细胞系呈端粒酶阳性表达，反义寡核苷酸可抑制端粒酶活性，并能抑制肺癌细胞的增殖和代谢。
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关键词：肺肿瘤；端粒，末端转移酶；寡核苷酸类，反义；肿瘤细胞，培养的
人端粒酶RNA(human telomerase RNA , hTR)基因是核糖核蛋白复合物，内部的RNA序列约450个碱基，靠近5′端第 46位碱基起到第 56位碱基共11个核苷酸，即5′CUAACCCUAAC3′构成复制端粒重复序列的模板。其3′端的5个碱基可以识别并反向互补结合端粒3′端的 5个碱基,以此为引物，以RNA模板序列近5′端6个碱基为模板，经端粒酶反转录复制、延伸端粒序列[1，2]。此序列构成反义寡核苷酸封闭的靶点。我们采用3种不同长度硫代修饰型hTR反义寡核苷酸作用于人肺癌细胞系，观察反义寡核苷酸阻断端粒复制，对肺癌细胞代谢和增殖的抑制效应。
材料与方法
1.人肺癌细胞系及其培养：人肺腺癌细胞系GLC-82、SPC-A-1(中国医学科学院肿瘤研究所林晨教授提供)，人肺腺癌细胞系PA-a-1、人肺巨细胞癌细胞系PG-49(北京医科大学病理教研室提供)，人肺腺癌细胞系LTEP-a-2(天津肿瘤研究所生化室黄建英教授提供)，人肺鳞癌细胞系LTEP-78、人肺巨细胞癌细胞系801-D(北京胸部肿瘤研究所细胞室赖百塘教授提供),人小细胞肺癌细胞系SCLC (中国协和医科大学北京协和医院病理科提供)。8种细胞系分别用RPMI 1640 或DMEM培养基(GIBCO BRL公司)加10% FBS (中国医学科学院血液病研究所)，在37℃、5% CO2条件下培养，备用。取 7例手术标本中人肺正常组织，离体后立即冻存于液氮中备用。
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2.人肺癌细胞系端粒酶活性检测：无RNA酶条件的制备是采用0.1% DEPC (Sigma公司)处理实验材料。端粒酶活性检测按Boehringer Mannheim公司端粒酶PCR ELISA 使用方法操作。(1)制备细胞提取物：收集培养细胞2×106个加入200 μl裂解液，制备细胞提取物(含有活性端粒酶成分)，每微升提取物相当于10 μg蛋白含量或1×103个细胞。(2)cDNA合成与扩增：取细胞提取物2 μl加入PCR反应混合液(含生物素标记的特异性引物)，cDNA合成后进行扩增。(3)杂交：扩增产物变性后，与地高辛标记的探针杂交，杂交混合液移入预包被的反应板(MTP)中，使杂交产物与MTP板上的链霉菌素蛋白结合。(4)ELISA：将过氧化物酶标记的抗地高辛抗体加入MTP板，反应后，再加入酶反应底物，显色后置∑960酶标仪(Metertech公司)450 nm、690 nm处测吸光度值(A)。端粒酶阳性对照：端粒酶PCR ELISA试剂盒提供人肾293细胞裂解物。端粒酶阴性对照(a)：待测细胞和293细胞提取物，加RNA酶(华美生物公司)灭活hTR后检测；(b)：待测细胞和293细胞提取物加热灭活后检测。扩增反应系统对照：扩增反应体系中加入无细胞提取物的裂解液，用水补足反应量后检测。端粒酶活性计算：标准阴性对照值(为ab 2者的均值)：A450 nm-A690 nm≤0.25；标准阳性对照值：A450 nm-A690 nm>1.5；实验标本ΔA=标本均值(A450 nm-A690 nm)-标本阴性对照均值(A450 nm-A690 nm)>0.2为阳性。
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3.四甲基偶氮唑盐(MTT)光吸收法检测细胞琥珀酸氧化脱氢酶(SDH)活性：各肺癌细胞系在96孔培养板按5×103/孔接种，长成单层后弃上清，换RPMI 1640维持液(1% FBS)及MTT(Sigma公司) ，MTT终浓度为0.5 mg/ml，37℃、5% CO2条件下培养4 h，弃上清，加正丙醇(天津化学工业公司)100 μl/孔，吹打反应4～5 min，置∑960酶标仪550 nm处测A值[3，4]。
4.细胞增殖计数：取培养细胞制成悬液，经台盼蓝染色后，用血细胞计数板计数，每毫升原液中细胞数=(4大格总数/4)×104×稀释倍数。
5.硫代修饰型反义寡核苷酸的来源：按照 hTR模板5′UGUCUAACCCUAACUGA 3′合成硫代修饰型hTR反义寡核苷酸[5]。硫代修饰型反义寡核苷酸6聚体(PS-ODN6，5′AGGGTT3′),9聚体 (PS-ODN9，5′TAGGGTTAG 3′)，12聚体 (PS-ODN12，5′TCAGTTAGGGTT 3′) (上海生物工程公司合成)。硫代修饰型随机序列寡核苷酸9聚体(PS-ODN9R，5′ATATGCGTA 3′)(北京CyberSyn生物工程公司合成)。
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6.Clonfectin-反义寡核苷酸包裹体制备及转染细胞：依据ClonfectinTM使用手册制备Clonfectin (Clontech公司)包裹体。各反义寡核苷酸浓度分别为5、10、20、40 μmol/L，Clonfectin终浓度<4 μg/ml。LTEP-a-2细胞系接种24孔板，(1～5)×104细胞/孔 37℃、5% CO2条件下培养16～18 h换维持液，加入Clonfectin包裹体，每浓度包裹体各加入4孔。另设Clonfectin对照、细胞对照和随机序列对照。置37℃、5% CO2条件下培养72 h，分别收集实验组、对照组细胞进行端粒酶活性检测、细胞计数，另取96孔板细胞做 SDH的 MTT光吸收值检测。
7.选择端粒酶活性最强的人肺癌细胞系，分别用不同浓度的3种hTR反义寡核苷酸作用72 h，然后检测细胞端粒酶活性、SDH活性，作细胞计数，并计算抑制率。
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抑制率=(1-实验组值/对照组值)×100%。
8.统计处理方法：方差分析及q检验。
结果
一、不同人肺癌细胞系端粒酶活性检测
8种不同肺癌细胞系均表现出不同程度的端粒酶活性，SCLC、SPC-A-1、LTEP-a-2、GLC-82端粒酶活性最强, ΔA>3.00，LTEP-78为1.33，PA-a-1为0.65，801-D为0.60， PG-49为0.49。阳性对照组ΔA为2.69。人正常肺组织细胞及阴性对照组未检测到端粒酶活性。
二、反义硫代修饰型寡核苷酸抑制细胞增殖、代谢检测
1.3种hTR反义寡核苷酸对端粒酶活性最强的人肺腺癌细胞系之一LTEP-a-2端粒酶活性及细胞增殖、代谢均有抑制作用，其作用随浓度的升高而增强。见表1～3。其中PS-ODN6对细胞端粒酶活性50%抑制效应(即IC50)出现最早，其IC50值为10 μmol/L。
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表1 不同序列端粒酶RNA反义寡核苷酸对
LTEP-α-2端粒酶活性的抑制作用
反义寡核苷酸浓度
(μmol/L)
PS-ODN6
PS-ODN9
PS-ODN12
ΔA
抑制率
(%)
ΔA
, 百拇医药
抑制率
(%)
ΔA
抑制率
(%)
0
2.82
0
2.82
0
2.82
0
5
1.84
, 百拇医药
34.9
2.08
26.2
2.10
25.7
10
1.43
49.4
2.02
28.4
1.96
30.6
20
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0.78
72.2
1.63
42.3
0.92
67.3
40
0.54
80.0
0.91
67.9
0.45
84.0
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表2 不同序列端粒酶RNA反义寡核苷酸对LTEP-α-2
琥珀酸氧化脱氢酶活性的抑制作用
反义寡核苷酸
浓度(μmol/L)
PS-ODN6
PS-ODN9
PS-ODN12
A
抑制率
(%)
A
, 百拇医药
抑制率
(%)
A
抑制率
(%)
0
0.77
0
0.55
0
0.77
0
5
0.60
, 百拇医药
22.5
0.40
28.0
0.62
19.4
10
0.57
25.7
0.38
31.8
0.54
29.6
20
, 百拇医药
0.50
35.3
0.33
40.0
0.48
38.2
40
0.23
70.6
0.14
74.0
0.20
74.7
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表3 不同序列端粒酶RNA反义寡核苷酸对
LTEP-α-2细胞生长的抑制作用
反义寡核苷酸
浓度(μmol/L)
PS-ODN6
PS-ODN9
PS-ODN12
细胞计数
(×105)
抑制率
(%)
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细胞计数
(×104)
抑制率
(%)
细胞计数
(×105)
抑制率
(%)
0
2.40
0
6.60
0
, 百拇医药
2.40
0
5
1.69
29.8
5.62
14.8
1.72
28.1
10
1.53
38.2
4.35
, 百拇医药
34.1
1.58
34.4
20
1.12
53.3
3.90
40.9
1.32
44.8
40
0.68
71.9
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2.40
63.6
0.66
72.5
2.PS-ODN9R作用LTEP-a-2细胞后，检测结果未表现出对端粒酶活性及对细胞增殖、代谢的明显抑制作用，见表4。
3.统计分析：3种特异性反义寡核苷酸与随机序列寡核苷酸对LTEP-α-2细胞端粒酶、SDH活性和细胞增殖抑制作用统计学结果为F=17.51、P<0.01，F=21.97、P<0.01，F=18.97、P<0.01，差异有非常显著性意义。各特异性反义寡核苷酸之间，其抑制作用差异无显著性意义(P>0.05)。
表4 PS-ODN9R对LTEP-α-2端粒酶、琥珀酸
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氧化脱氢酶活性及细胞生长的抑制作用
PS-ODN9R浓度
(μmol/L)
端粒酶活性
氧化脱氢酶活性
细胞数
ΔA
抑制率
(%)
A
抑制率
(%)
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细胞计数
(×104)
抑制率
(%)
0
2.82
0
0.413
0
6.60
0
5
2.90
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0
0.406
1.6
6.46
2.1
10
2.76
2.4
0.400
3.1
6.45
2.3
20
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2.76
2.4
0.395
4.2
6.30
4.5
40
2.65
6.2
0.388
6.0
6.00
9.1
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讨论
本项研究中8种人肺癌细胞系均表现出不同程度端粒酶阳性，而人正常肺组织细胞均缺乏端粒酶活性，表明端粒酶的激活是肿瘤细胞系的重要生物学性状之一。用反义寡核苷酸封闭hTR模板，抑制端粒重复序列合成，使端粒酶不能发挥作用，端粒不再延长，细胞的生长代谢受到抑制。近年来已合成多种修饰型反义核酸，硫代修饰型反义寡核苷酸在抗病毒和抗肿瘤方面有较好效果[6-8]，故研究中采用了硫代修饰型反义物。选取端粒酶活性呈稳定高表达的LTEP-a-2作为靶细胞，导入PS-ODN6、PS-ODN9和PS-ODN12，它们不同程度地抑制细胞端粒酶活性。其中PS-ODN6的IC50值最小。IC50可能受如下因素影响：1.封闭的基因位点应包括几个关键的碱基。2.反义寡核苷酸的有效长度使其结合靶基因力度大。PS-ODN6分子小易于导入细胞，主要封闭hTR模板结合位点的两个重要碱基UC和复制序列上4个碱基CCAA，在短时间内观察到抑制效应。此外，反义寡核苷酸的作用呈浓度依赖性。hTR基因有意义序列为3′CAAUCCCAAUC5′，封闭近3′端5个结合位点碱基或封闭近5′端复制序列的6个碱基，都具有阻断端粒序列复制的意义，有人认为封闭近3′端序列效果优于封闭近5′端序列[9]。反义PS-ODN12虽然设计封闭hTR模板3′端，但因序列长于PS-ODN6的2倍，导入细胞量不如PS-ODN6高，故抑制作用低于PS-ODN6，但优于PS-ODN9。
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为分析反义寡核苷酸封阻靶基因的特异性和有无毒性作用，我们观察了经硫代修饰的随机序列寡核苷酸对LTEP-a-2细胞端粒酶活性、SDH活性和细胞生长增殖的影响。结果表明其对细胞代谢、增殖无明显作用。
端粒酶在生物代谢、衰老、应激和肿瘤发生中起重要作用，利用反义技术封闭hTR基因很可能成为治疗肿瘤的重要手段之一[6-11]。针对多个反义技术靶点，设计相应的不同修饰型及不同长度的特异性反义寡核苷酸对靶基因进行封阻，提高对肿瘤细胞的抑制效果，是基因治疗的一个重要途径。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770304)
作者单位：梅玫(300070 天津医科大学实验中心分子生物学室)
余虹(300070 天津医科大学实验中心分子生物学室)
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参考文献
1 Greider CW. Telomerase activity, cell proliferation, and cancer. Proc Natl Acad Sci U S A ,1998, 95:90-92.
2 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR ,et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science ,1994, 266:2011-2015.
3 梅玫. 改良MTT光吸收技术和[3H]-TdR掺入法在检测体外培养细胞活性的比较.天津医科大学学报，1995，增刊：45-46.
4 Lamber E,Ress JKH,Twentyman PR.Resistance circumvention strategies tested in clinical leukemia specimens using the MTT colorimetric assay .Leukemia,1992,6:1063-1071.
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5 Feng JL, Funk WD, Wang SS,et al. The RNA component of human telomerase. Science, 1995,269:1236-1241.
6 Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S ,et al. Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst, 1995, 87:895-902.
7 Pitts AE, Corey DR. Inhibition of human telomerase by 2'-O-methyl-RNA. Proc Natl Acad Sci U S A , 1998, 95:11549-11554.
8 Stein CA, Cheng YC. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents - is the bullet really magical? Scince ,1993, 261:1004-1012.
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9 Hamilton SE, Pitts AE, Katipally RR ,et al. Identification of determinants for inhibitor binding within the RNA active site of human telomerase using DNA scanning. Boichemistry ,1997, 36:11873-11880.
10 Kondo S, Tanaka Y, Kondo Y ,et al. Antisense telomerase treatment: induction of two distinct pathways, apoptosis and differentiation. FASEB J , 1998, 12:801-811.
11 Rudolph KL,Chang SD,Lee HW, et al. Longevity,stress.response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell, 1999, 96:701-712., 百拇医药
摘 要 目的 了解人肺癌细胞系的端粒酶活性情况。探讨硫代修饰型端粒酶RNA反义寡核苷酸封阻端粒酶RNA,对癌细胞代谢、生长的抑制作用。方法 采用端粒酶 PCR ELISA方法检测8种体外培养人肺癌细胞系端粒酶活性。合成端粒酶RNA的反义硫代寡核苷酸(6聚体、9聚体、12聚体)和随机序列寡核苷酸，分别导入LTEP-a-2细胞系，作用72 h。采用端粒酶 PCR ELISA方法检测端粒酶活性、四甲基偶氮唑盐(MTT)光吸收法检测琥珀酸脱氢酶(SDH)活性并做细胞增殖计数。结果 8种人肺癌细胞系端粒酶活性均呈不同程度阳性表达。3种端粒酶RNA反义寡核苷酸对LTEP-a-2细胞端粒酶活性、SDH活性及生长增殖均有抑制作用并随浓度升高而增强。3种反义寡核苷酸5～40 μmol/L对细胞端粒酶活性、SDH活性和增殖的抑制率分别为25.7%～84.0%、19.4%～74.7%和14.8%～72.5%。硫代修饰随机序列寡核苷酸对细胞端粒酶活性、SDH活性及生长增殖无明显抑制作用，与3种反义寡核苷酸抑制作用比较差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论 人肺癌细胞系呈端粒酶阳性表达，反义寡核苷酸可抑制端粒酶活性，并能抑制肺癌细胞的增殖和代谢。
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关键词：肺肿瘤；端粒，末端转移酶；寡核苷酸类，反义；肿瘤细胞，培养的
人端粒酶RNA(human telomerase RNA , hTR)基因是核糖核蛋白复合物，内部的RNA序列约450个碱基，靠近5′端第 46位碱基起到第 56位碱基共11个核苷酸，即5′CUAACCCUAAC3′构成复制端粒重复序列的模板。其3′端的5个碱基可以识别并反向互补结合端粒3′端的 5个碱基,以此为引物，以RNA模板序列近5′端6个碱基为模板，经端粒酶反转录复制、延伸端粒序列[1，2]。此序列构成反义寡核苷酸封闭的靶点。我们采用3种不同长度硫代修饰型hTR反义寡核苷酸作用于人肺癌细胞系，观察反义寡核苷酸阻断端粒复制，对肺癌细胞代谢和增殖的抑制效应。
材料与方法
1.人肺癌细胞系及其培养：人肺腺癌细胞系GLC-82、SPC-A-1(中国医学科学院肿瘤研究所林晨教授提供)，人肺腺癌细胞系PA-a-1、人肺巨细胞癌细胞系PG-49(北京医科大学病理教研室提供)，人肺腺癌细胞系LTEP-a-2(天津肿瘤研究所生化室黄建英教授提供)，人肺鳞癌细胞系LTEP-78、人肺巨细胞癌细胞系801-D(北京胸部肿瘤研究所细胞室赖百塘教授提供),人小细胞肺癌细胞系SCLC (中国协和医科大学北京协和医院病理科提供)。8种细胞系分别用RPMI 1640 或DMEM培养基(GIBCO BRL公司)加10% FBS (中国医学科学院血液病研究所)，在37℃、5% CO2条件下培养，备用。取 7例手术标本中人肺正常组织，离体后立即冻存于液氮中备用。
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2.人肺癌细胞系端粒酶活性检测：无RNA酶条件的制备是采用0.1% DEPC (Sigma公司)处理实验材料。端粒酶活性检测按Boehringer Mannheim公司端粒酶PCR ELISA 使用方法操作。(1)制备细胞提取物：收集培养细胞2×106个加入200 μl裂解液，制备细胞提取物(含有活性端粒酶成分)，每微升提取物相当于10 μg蛋白含量或1×103个细胞。(2)cDNA合成与扩增：取细胞提取物2 μl加入PCR反应混合液(含生物素标记的特异性引物)，cDNA合成后进行扩增。(3)杂交：扩增产物变性后，与地高辛标记的探针杂交，杂交混合液移入预包被的反应板(MTP)中，使杂交产物与MTP板上的链霉菌素蛋白结合。(4)ELISA：将过氧化物酶标记的抗地高辛抗体加入MTP板，反应后，再加入酶反应底物，显色后置∑960酶标仪(Metertech公司)450 nm、690 nm处测吸光度值(A)。端粒酶阳性对照：端粒酶PCR ELISA试剂盒提供人肾293细胞裂解物。端粒酶阴性对照(a)：待测细胞和293细胞提取物，加RNA酶(华美生物公司)灭活hTR后检测；(b)：待测细胞和293细胞提取物加热灭活后检测。扩增反应系统对照：扩增反应体系中加入无细胞提取物的裂解液，用水补足反应量后检测。端粒酶活性计算：标准阴性对照值(为ab 2者的均值)：A450 nm-A690 nm≤0.25；标准阳性对照值：A450 nm-A690 nm>1.5；实验标本ΔA=标本均值(A450 nm-A690 nm)-标本阴性对照均值(A450 nm-A690 nm)>0.2为阳性。
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3.四甲基偶氮唑盐(MTT)光吸收法检测细胞琥珀酸氧化脱氢酶(SDH)活性：各肺癌细胞系在96孔培养板按5×103/孔接种，长成单层后弃上清，换RPMI 1640维持液(1% FBS)及MTT(Sigma公司) ，MTT终浓度为0.5 mg/ml，37℃、5% CO2条件下培养4 h，弃上清，加正丙醇(天津化学工业公司)100 μl/孔，吹打反应4～5 min，置∑960酶标仪550 nm处测A值[3，4]。
4.细胞增殖计数：取培养细胞制成悬液，经台盼蓝染色后，用血细胞计数板计数，每毫升原液中细胞数=(4大格总数/4)×104×稀释倍数。
5.硫代修饰型反义寡核苷酸的来源：按照 hTR模板5′UGUCUAACCCUAACUGA 3′合成硫代修饰型hTR反义寡核苷酸[5]。硫代修饰型反义寡核苷酸6聚体(PS-ODN6，5′AGGGTT3′),9聚体 (PS-ODN9，5′TAGGGTTAG 3′)，12聚体 (PS-ODN12，5′TCAGTTAGGGTT 3′) (上海生物工程公司合成)。硫代修饰型随机序列寡核苷酸9聚体(PS-ODN9R，5′ATATGCGTA 3′)(北京CyberSyn生物工程公司合成)。
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6.Clonfectin-反义寡核苷酸包裹体制备及转染细胞：依据ClonfectinTM使用手册制备Clonfectin (Clontech公司)包裹体。各反义寡核苷酸浓度分别为5、10、20、40 μmol/L，Clonfectin终浓度<4 μg/ml。LTEP-a-2细胞系接种24孔板，(1～5)×104细胞/孔 37℃、5% CO2条件下培养16～18 h换维持液，加入Clonfectin包裹体，每浓度包裹体各加入4孔。另设Clonfectin对照、细胞对照和随机序列对照。置37℃、5% CO2条件下培养72 h，分别收集实验组、对照组细胞进行端粒酶活性检测、细胞计数，另取96孔板细胞做 SDH的 MTT光吸收值检测。
7.选择端粒酶活性最强的人肺癌细胞系，分别用不同浓度的3种hTR反义寡核苷酸作用72 h，然后检测细胞端粒酶活性、SDH活性，作细胞计数，并计算抑制率。
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抑制率=(1-实验组值/对照组值)×100%。
8.统计处理方法：方差分析及q检验。
结果
一、不同人肺癌细胞系端粒酶活性检测
8种不同肺癌细胞系均表现出不同程度的端粒酶活性，SCLC、SPC-A-1、LTEP-a-2、GLC-82端粒酶活性最强, ΔA>3.00，LTEP-78为1.33，PA-a-1为0.65，801-D为0.60， PG-49为0.49。阳性对照组ΔA为2.69。人正常肺组织细胞及阴性对照组未检测到端粒酶活性。
二、反义硫代修饰型寡核苷酸抑制细胞增殖、代谢检测
1.3种hTR反义寡核苷酸对端粒酶活性最强的人肺腺癌细胞系之一LTEP-a-2端粒酶活性及细胞增殖、代谢均有抑制作用，其作用随浓度的升高而增强。见表1～3。其中PS-ODN6对细胞端粒酶活性50%抑制效应(即IC50)出现最早，其IC50值为10 μmol/L。
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表1 不同序列端粒酶RNA反义寡核苷酸对
LTEP-α-2端粒酶活性的抑制作用
反义寡核苷酸浓度
(μmol/L)
PS-ODN6
PS-ODN9
PS-ODN12
ΔA
抑制率
(%)
ΔA
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抑制率
(%)
ΔA
抑制率
(%)
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0
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1.43
49.4
2.02
28.4
1.96
30.6
20
, 百拇医药
0.78
72.2
1.63
42.3
0.92
67.3
40
0.54
80.0
0.91
67.9
0.45
84.0
, http://www.100md.com
表2 不同序列端粒酶RNA反义寡核苷酸对LTEP-α-2
琥珀酸氧化脱氢酶活性的抑制作用
反义寡核苷酸
浓度(μmol/L)
PS-ODN6
PS-ODN9
PS-ODN12
A
抑制率
(%)
A
, 百拇医药
抑制率
(%)
A
抑制率
(%)
0
0.77
0
0.55
0
0.77
0
5
0.60
, 百拇医药
22.5
0.40
28.0
0.62
19.4
10
0.57
25.7
0.38
31.8
0.54
29.6
20
, 百拇医药
0.50
35.3
0.33
40.0
0.48
38.2
40
0.23
70.6
0.14
74.0
0.20
74.7
, 百拇医药
表3 不同序列端粒酶RNA反义寡核苷酸对
LTEP-α-2细胞生长的抑制作用
反义寡核苷酸
浓度(μmol/L)
PS-ODN6
PS-ODN9
PS-ODN12
细胞计数
(×105)
抑制率
(%)
, http://www.100md.com
细胞计数
(×104)
抑制率
(%)
细胞计数
(×105)
抑制率
(%)
0
2.40
0
6.60
0
, 百拇医药
2.40
0
5
1.69
29.8
5.62
14.8
1.72
28.1
10
1.53
38.2
4.35
, 百拇医药
34.1
1.58
34.4
20
1.12
53.3
3.90
40.9
1.32
44.8
40
0.68
71.9
, http://www.100md.com
2.40
63.6
0.66
72.5
2.PS-ODN9R作用LTEP-a-2细胞后，检测结果未表现出对端粒酶活性及对细胞增殖、代谢的明显抑制作用，见表4。
3.统计分析：3种特异性反义寡核苷酸与随机序列寡核苷酸对LTEP-α-2细胞端粒酶、SDH活性和细胞增殖抑制作用统计学结果为F=17.51、P<0.01，F=21.97、P<0.01，F=18.97、P<0.01，差异有非常显著性意义。各特异性反义寡核苷酸之间，其抑制作用差异无显著性意义(P>0.05)。
表4 PS-ODN9R对LTEP-α-2端粒酶、琥珀酸
, 百拇医药
氧化脱氢酶活性及细胞生长的抑制作用
PS-ODN9R浓度
(μmol/L)
端粒酶活性
氧化脱氢酶活性
细胞数
ΔA
抑制率
(%)
A
抑制率
(%)
, 百拇医药
细胞计数
(×104)
抑制率
(%)
0
2.82
0
0.413
0
6.60
0
5
2.90
, 百拇医药
0
0.406
1.6
6.46
2.1
10
2.76
2.4
0.400
3.1
6.45
2.3
20
, http://www.100md.com
2.76
2.4
0.395
4.2
6.30
4.5
40
2.65
6.2
0.388
6.0
6.00
9.1
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讨论
本项研究中8种人肺癌细胞系均表现出不同程度端粒酶阳性，而人正常肺组织细胞均缺乏端粒酶活性，表明端粒酶的激活是肿瘤细胞系的重要生物学性状之一。用反义寡核苷酸封闭hTR模板，抑制端粒重复序列合成，使端粒酶不能发挥作用，端粒不再延长，细胞的生长代谢受到抑制。近年来已合成多种修饰型反义核酸，硫代修饰型反义寡核苷酸在抗病毒和抗肿瘤方面有较好效果[6-8]，故研究中采用了硫代修饰型反义物。选取端粒酶活性呈稳定高表达的LTEP-a-2作为靶细胞，导入PS-ODN6、PS-ODN9和PS-ODN12，它们不同程度地抑制细胞端粒酶活性。其中PS-ODN6的IC50值最小。IC50可能受如下因素影响：1.封闭的基因位点应包括几个关键的碱基。2.反义寡核苷酸的有效长度使其结合靶基因力度大。PS-ODN6分子小易于导入细胞，主要封闭hTR模板结合位点的两个重要碱基UC和复制序列上4个碱基CCAA，在短时间内观察到抑制效应。此外，反义寡核苷酸的作用呈浓度依赖性。hTR基因有意义序列为3′CAAUCCCAAUC5′，封闭近3′端5个结合位点碱基或封闭近5′端复制序列的6个碱基，都具有阻断端粒序列复制的意义，有人认为封闭近3′端序列效果优于封闭近5′端序列[9]。反义PS-ODN12虽然设计封闭hTR模板3′端，但因序列长于PS-ODN6的2倍，导入细胞量不如PS-ODN6高，故抑制作用低于PS-ODN6，但优于PS-ODN9。
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为分析反义寡核苷酸封阻靶基因的特异性和有无毒性作用，我们观察了经硫代修饰的随机序列寡核苷酸对LTEP-a-2细胞端粒酶活性、SDH活性和细胞生长增殖的影响。结果表明其对细胞代谢、增殖无明显作用。
端粒酶在生物代谢、衰老、应激和肿瘤发生中起重要作用，利用反义技术封闭hTR基因很可能成为治疗肿瘤的重要手段之一[6-11]。针对多个反义技术靶点，设计相应的不同修饰型及不同长度的特异性反义寡核苷酸对靶基因进行封阻，提高对肿瘤细胞的抑制效果，是基因治疗的一个重要途径。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770304)
作者单位：梅玫(300070 天津医科大学实验中心分子生物学室)
余虹(300070 天津医科大学实验中心分子生物学室)
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参考文献
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