聚吡咯与坐骨神经组织相容性联合细胞培养的实验研究
聚吡咯与坐骨神经组织相容性联合细胞培养的实验研究
王晓冬 陈树建 顾晓松 张沛云 张天一 袁春伟
摘 要 目的 了解聚吡咯(Polypyrrole, PP)材料与周围神经组织的生物相容性，为PP作神经桥接物进行缺损神经桥接再生试验提供实验依据。 方法 运用电化学氧化法合成导电玻璃、硅胶管上的PP膜。取新生大鼠的坐骨神经与PP材料联合培养，倒置显微镜与扫描电镜形态观察。结果 电化学氧化法合成的PP导电性能均较好；导电玻璃的PP膜表面光滑，微孔较小；硅胶管内壁膜除同导电玻璃外，还可成絮状表面，微孔交织成网。神经组织的雪旺细胞在平滑的PP表面生长迁移良好，而絮状表面相对差。 结论 体外联合培养结果提示，PP与大鼠周围神经组织有较好的生物相容性，表面光滑的PP更易使神经组织的细胞生长迁移。
, 百拇医药
关键词：坐骨神经；细胞培养；生物相容性；聚吡咯；电化学氧化法
近百年来，人们为寻求一种能跨越缺损空间的神经桥接材料，做出了不懈努力。所研究的材料有神经组织、非神经生物组织和非生物材料三大类，但这些材料的各自缺陷，致使真正进入临床应用受到限制[1，2]。随着材料科学的飞速发展，人们对桥接物材料选择的余地更大。但已试用的一些材料还不尽如人意[3，4]，寻找新的非生物材料作桥接物仍是神经长距离缺损修复研究中的迫切任务。有报道，电刺激的作用可加快神经细胞的生长速度，如体内试验证明，使用电刺激能使夹伤坐骨神经的大鼠神经功能恢复[5，6]。这表明，电刺激有可能作为一种趋化作用或改善微环境作用而应用到神经长距离缺损再生过程中去。为此，笔者拟试用一种高技术材料聚吡咯(Polypyrrole， PP)，利用它作桥接物支架，同时又利用其导电性能进行电刺激，尝试作为神经桥接物的可能性，就PP与神经组织的生物相容性做联合体外细胞培养，为进一步深入研究提供实验依据。
, 百拇医药
材料与方法
1. PP的制备：本工作在东南大学国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室进行。吡咯(德国原装进口，GC级)经131℃ 蒸馏成白色吡咯单体。电化学氧化合成：导电玻璃(南京55所)或硅胶管(济南医用硅橡胶制品厂)经特殊清洁处理后作工作电极，为PP膜聚合的表面；另用铂网作对电极，饱和甘汞电极为参比电极；电解池中装有0.1 mol/L吡咯水溶液和0.1 mol/L KCl电解质。在工作电极相对参比电极电压为1 V的恒压下，电化学氧化聚合开始，于导电玻璃、硅胶管内壁上出现PP膜。
2. 神经组织和PP的生物相容性联合培养：SD新生1～3 d大鼠数只(本院实验动物中心提供)，无菌条件下，切断并取出坐骨神经干，用Hank培养液(pH 7.4)洗涤数次并剪成碎块，然后放在经洗涤、消毒、培养液平衡的导电玻璃的PP膜，或对半切开的硅胶管内壁PP膜上。加入适量L15培养液(Gibco公司，美国)含体积分数为5%的小牛血清，37℃、体积分数为5%的CO2中培养，每隔2 d换液1次，培养3周。同时，分别用导电玻璃涂布或不涂布鼠尾胶以及无PP膜的硅胶管作为对照组。
, 百拇医药
3. 光镜观察与测量：培养开始每隔24 h观察1次，连续3 d，以后1,2,3周时各观察1次。每次观察用测微尺测量雪旺细胞迁移的距离及植块周围细胞生长晕直径大小。
4. 扫描电镜观察：分别取电化学氧化聚合在导电玻璃、硅胶管上的PP，用导电胶黏于标本台上, JFC-1100离子溅射仪(JEOL公司, 日本)中喷金，用JEM-T300扫描电镜(JEOL公司，日本)观察。
取联合培养14 d的标本用Hank培养液洗涤，经质量浓度为40 g/L的戊二醛(4℃)固定，洗液洗涤，再用质量浓度为10 g/L的锇酸(4℃)固定，乙醇逐级脱水，经HCP-2临界点干燥仪(HITCH公司，日本)干燥，离子溅射仪中喷金，扫描电镜观察。
5. 统计学方法：t检验
结 果
, 百拇医药 1. PP的特征：在导电玻璃上通过电化学氧化方法聚合的PP，呈黑色膜状结构，其厚薄可由聚合时间长短来控制。PP膜对导电玻璃的黏附性较好，膜具有较好的韧性和强度，导电测试也较好。硅胶管内壁的膜状PP与导电玻璃上的PP膜相比，前者PP的柔韧性和强度相对较差，对硅胶管的黏附强度也较差，易破裂脱落，但导电性较好。
2. 倒置显微镜观察：培养1 d时，35%坐骨神经植块局部有细胞向外迁出，在导电玻璃、硅胶管膜状PP上，细胞迁移最远距离约60 μm。2 d时，70%植块有细胞移出，细胞数较多，分为雪旺细胞和成纤维细胞两类，迁移最远达135 μm。3 d时，90%以上的植块细胞向外生长，最远距离为205 μm；雪旺细胞有端对端、肩并肩的排列成细胞束现象，以植块为中心向外放射状迁移。1周时植块上迁移出的细胞数更多，最远距离达972 μm以上；细胞除成束排列外，还有成堆聚积，形成具有特征性的“细胞岛”现象。培养至2周时，植块迁出的细胞数量继续增多，最远距离约2 560 μm；导电玻璃的PP膜上细胞密度较硅胶管的PP膜上大，生长更旺盛。3周时，细胞迁移与2周比距离更远，约 3 270 μm，细胞数相对增加。对照组中，裸露导电玻璃表面，植块中的细胞虽能迁移生长，但3周时仅2 510 μm，而且密度明显低于实验组(图1)；涂布鼠尾胶的导电玻璃上细胞迁移生长基本同实验组，3周时为3 220 μm；裸露的硅胶管组中，细胞迁移和生长略差于实验组。
, 百拇医药
图1 导电玻璃的PP膜雪旺细胞生长迁移活跃(A)；裸露导电玻璃表面雪旺细胞生长较差(B) ×100
各时间段导电玻璃PP、裸露导电玻璃上神经植块周围生长晕直径情况，经拟合并过(0，0)点的Logistic曲线见图2。模型参数的t检验表明，两曲线间差异有非常显著性意义(P<0.01)。同时还表明，拟合的过(0，0)点的Logistic曲线为严格单调上升趋势；PP上细胞生长晕的最大可能直径可比对照组大2 214 μm；实验组曲线增长速度比对照组快，并且其曲线的拐点晚于对照组0.88 d。
图2 不同时间神经植块周围生长晕直径大小曲线
3. 扫描电镜观察：导电玻璃的PP膜表面较平整光滑，微孔较少。硅胶管内壁上的膜状PP表现两种形态特征：一种是表面较光滑,但呈丘陵状，起伏不平；另一种表面不光滑。经2周的培养，PP膜上的雪旺细胞排列或呈束状排列，或是“细胞岛”聚集，细胞间有细长的突起相连。导电玻璃的PP膜上细胞密度大，突起细长(图3)。而硅胶管内壁的PP膜较光滑处细胞生长也较好；但在絮状表面的部位，细胞数则相对稀疏，突起相对粗短。
, 百拇医药
图3 导电玻璃的PP膜表面，雪旺细胞迁移生长好 ×800
讨 论
PP材料为吡咯单体通过电化学氧化法合成的高分子聚合物，是一种具有多种用途的高新技术材料。PP具有导电性，并可作为一种介质吸收和释放某些生物大分子物质。这些特性在生物医学领域中有潜在的研究应用价值，如PP作为检测葡萄糖或蛋白质的生物传感器研究[7]，作为吸收连接蛋白质或DNA的介质研究[8，9]，或作为培养的介质，通过改变PP特性引起细胞形状和功能变化等研究[10]。最近，人们又开始就它在神经的再生中应用可能性进行了探索。Williams等[11]用neur 2a神经母细胞瘤细胞在PP膜上进行体外培养以及混合制成小室埋入鼠体内，结果表明PP能作为细胞生长环境中的有效介质。Schmidt等[12]报告雏鸡坐骨神经或PC-12细胞培养于PP膜上，加电刺激后能显著地增加轴突长度。笔者直接用大鼠的坐骨神经培养于导电玻璃、硅胶管内壁膜状PP上，了解它的生物相容性。结果表明周围神经组织中，雪旺细胞能在导电玻璃PP膜、硅胶管PP膜的光滑部分活跃地生长迁移，并且其生长迁移的方式和鼠尾胶膜一样，经3周的培养，各种细胞的生长状态一直保持良好；拟合的过(0，0)点的Logistic曲线为严格单调上升趋势，实验组曲线增长速度比对照组快。这表明，PP与大鼠周围神经组织确实有较好的生物相容性，而硅胶管的絮状PP上细胞生长相对差些。当然，硅胶管内壁的PP出现的两种表面特征，可能和工作电极的制备有关，因为硅胶管本身是不导电的绝缘体，所以表面处理的影响很大。下一步工作是选择一种更好的硅胶管表面处理方式和最佳的电化学氧化聚合条件，使合成的PP膜既具备较光滑的表面又有很细的微孔，这样的材料更能符合桥接物的要求。同时，要增加硅胶管内壁上PP膜柔韧和黏附强度。
, 百拇医药
目前仅就PP和大鼠周围神经组织进行了联合细胞培养，表明其具有较好的生物相容性。进一步的研究是体内外实验，了解电刺激条件下PP对神经组织生长的影响及桥接再生的情况。
志谢 感谢本院卫生系统计学教研室陈峰副教授在统计学方面提供的帮助
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39425006)、 江苏省教委青蓝工程资助项目
作者单位：王晓冬(226001 南通医学院组织学与胚胎学教研室、神经科学研究所)
顾晓松(226001 南通医学院组织学与胚胎学教研室、神经科学研究所)
张沛云(226001 南通医学院组织学与胚胎学教研室、神经科学研究所)
张天一(226001 南通医学院组织学与胚胎学教研室、神经科学研究所)
, 百拇医药
陈树建(东南大学国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室)
袁春伟(东南大学国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室)
参考文献
1，钟世镇.周围神经基础研究的进展.中华手外科杂志, 1997,13:1-2.
2，陈中伟.显微外科的现状与进展.中华显微外科杂志, 1998, 21:1-2.
3，Fields RD, Beau JML, Lango FM, et al. Nerve regeneration through artificial tubular implants. Prog Neurobiol, 1989,33:87-134.
, 百拇医药 4，朱家恺. 周围神经缺损的显微外科治疗. 中华显微外科杂志， 1999，22：5-7.
5，Kerns JM, Fakhouri AJ, Weinrib HP, et al. Electrical Stimulation of nerve regeneration in the rat: the early effects evaluated by a vibrating probe and electron microscopy. Neurosci, 1991,40:93-107.
6，陈晓东,邓玉东,徐建光,等. 电针对大鼠坐骨神经再生影响的功能评价.中华手外科杂志, 1998,14:121-123.
7，Couves LD, Porter SJ. Polypyrrole as a potentiometric glucose sensor. Synth Met ,1989,28:C761-C768.
, http://www.100md.com
8，Smith AB, Knowles CJ. Investigation of the relationship between conductivity and protein-blinding properties of polypyrrole. J Appl Polym Sci, 1991,42:399-403.
9，Minehan DS, Marx KA, Tripathy SK. Kinetics of DNA binding to polypyrrole. Polym Mater Sci Eng, 1991, 64:341-342.
10，Wong JY, Langer R, Ingber DE. Electrical conducting polymers can notinvasively control the shape and growth of mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:3201-3204.
11，Williams RL, Doherty PJ. A preliminary assessment of polypyrrole in nerve guide studies. J Mat Sci Mat Med,1994,5:429-433.
12，Schmidt CE, Shastri VR, Vacmh JP, et al. Stimulation of neurite outgrowth using an electrically conducting polymer. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:8948-8953., 百拇医药
王晓冬 陈树建 顾晓松 张沛云 张天一 袁春伟
摘 要 目的 了解聚吡咯(Polypyrrole, PP)材料与周围神经组织的生物相容性，为PP作神经桥接物进行缺损神经桥接再生试验提供实验依据。 方法 运用电化学氧化法合成导电玻璃、硅胶管上的PP膜。取新生大鼠的坐骨神经与PP材料联合培养，倒置显微镜与扫描电镜形态观察。结果 电化学氧化法合成的PP导电性能均较好；导电玻璃的PP膜表面光滑，微孔较小；硅胶管内壁膜除同导电玻璃外，还可成絮状表面，微孔交织成网。神经组织的雪旺细胞在平滑的PP表面生长迁移良好，而絮状表面相对差。 结论 体外联合培养结果提示，PP与大鼠周围神经组织有较好的生物相容性，表面光滑的PP更易使神经组织的细胞生长迁移。
, 百拇医药
关键词：坐骨神经；细胞培养；生物相容性；聚吡咯；电化学氧化法
近百年来，人们为寻求一种能跨越缺损空间的神经桥接材料，做出了不懈努力。所研究的材料有神经组织、非神经生物组织和非生物材料三大类，但这些材料的各自缺陷，致使真正进入临床应用受到限制[1，2]。随着材料科学的飞速发展，人们对桥接物材料选择的余地更大。但已试用的一些材料还不尽如人意[3，4]，寻找新的非生物材料作桥接物仍是神经长距离缺损修复研究中的迫切任务。有报道，电刺激的作用可加快神经细胞的生长速度，如体内试验证明，使用电刺激能使夹伤坐骨神经的大鼠神经功能恢复[5，6]。这表明，电刺激有可能作为一种趋化作用或改善微环境作用而应用到神经长距离缺损再生过程中去。为此，笔者拟试用一种高技术材料聚吡咯(Polypyrrole， PP)，利用它作桥接物支架，同时又利用其导电性能进行电刺激，尝试作为神经桥接物的可能性，就PP与神经组织的生物相容性做联合体外细胞培养，为进一步深入研究提供实验依据。
, 百拇医药
材料与方法
1. PP的制备：本工作在东南大学国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室进行。吡咯(德国原装进口，GC级)经131℃ 蒸馏成白色吡咯单体。电化学氧化合成：导电玻璃(南京55所)或硅胶管(济南医用硅橡胶制品厂)经特殊清洁处理后作工作电极，为PP膜聚合的表面；另用铂网作对电极，饱和甘汞电极为参比电极；电解池中装有0.1 mol/L吡咯水溶液和0.1 mol/L KCl电解质。在工作电极相对参比电极电压为1 V的恒压下，电化学氧化聚合开始，于导电玻璃、硅胶管内壁上出现PP膜。
2. 神经组织和PP的生物相容性联合培养：SD新生1～3 d大鼠数只(本院实验动物中心提供)，无菌条件下，切断并取出坐骨神经干，用Hank培养液(pH 7.4)洗涤数次并剪成碎块，然后放在经洗涤、消毒、培养液平衡的导电玻璃的PP膜，或对半切开的硅胶管内壁PP膜上。加入适量L15培养液(Gibco公司，美国)含体积分数为5%的小牛血清，37℃、体积分数为5%的CO2中培养，每隔2 d换液1次，培养3周。同时，分别用导电玻璃涂布或不涂布鼠尾胶以及无PP膜的硅胶管作为对照组。
, 百拇医药
3. 光镜观察与测量：培养开始每隔24 h观察1次，连续3 d，以后1,2,3周时各观察1次。每次观察用测微尺测量雪旺细胞迁移的距离及植块周围细胞生长晕直径大小。
4. 扫描电镜观察：分别取电化学氧化聚合在导电玻璃、硅胶管上的PP，用导电胶黏于标本台上, JFC-1100离子溅射仪(JEOL公司, 日本)中喷金，用JEM-T300扫描电镜(JEOL公司，日本)观察。
取联合培养14 d的标本用Hank培养液洗涤，经质量浓度为40 g/L的戊二醛(4℃)固定，洗液洗涤，再用质量浓度为10 g/L的锇酸(4℃)固定，乙醇逐级脱水，经HCP-2临界点干燥仪(HITCH公司，日本)干燥，离子溅射仪中喷金，扫描电镜观察。
5. 统计学方法：t检验
结 果
, 百拇医药 1. PP的特征：在导电玻璃上通过电化学氧化方法聚合的PP，呈黑色膜状结构，其厚薄可由聚合时间长短来控制。PP膜对导电玻璃的黏附性较好，膜具有较好的韧性和强度，导电测试也较好。硅胶管内壁的膜状PP与导电玻璃上的PP膜相比，前者PP的柔韧性和强度相对较差，对硅胶管的黏附强度也较差，易破裂脱落，但导电性较好。
2. 倒置显微镜观察：培养1 d时，35%坐骨神经植块局部有细胞向外迁出，在导电玻璃、硅胶管膜状PP上，细胞迁移最远距离约60 μm。2 d时，70%植块有细胞移出，细胞数较多，分为雪旺细胞和成纤维细胞两类，迁移最远达135 μm。3 d时，90%以上的植块细胞向外生长，最远距离为205 μm；雪旺细胞有端对端、肩并肩的排列成细胞束现象，以植块为中心向外放射状迁移。1周时植块上迁移出的细胞数更多，最远距离达972 μm以上；细胞除成束排列外，还有成堆聚积，形成具有特征性的“细胞岛”现象。培养至2周时，植块迁出的细胞数量继续增多，最远距离约2 560 μm；导电玻璃的PP膜上细胞密度较硅胶管的PP膜上大，生长更旺盛。3周时，细胞迁移与2周比距离更远，约 3 270 μm，细胞数相对增加。对照组中，裸露导电玻璃表面，植块中的细胞虽能迁移生长，但3周时仅2 510 μm，而且密度明显低于实验组(图1)；涂布鼠尾胶的导电玻璃上细胞迁移生长基本同实验组，3周时为3 220 μm；裸露的硅胶管组中，细胞迁移和生长略差于实验组。
, 百拇医药
图1 导电玻璃的PP膜雪旺细胞生长迁移活跃(A)；裸露导电玻璃表面雪旺细胞生长较差(B) ×100
各时间段导电玻璃PP、裸露导电玻璃上神经植块周围生长晕直径情况，经拟合并过(0，0)点的Logistic曲线见图2。模型参数的t检验表明，两曲线间差异有非常显著性意义(P<0.01)。同时还表明，拟合的过(0，0)点的Logistic曲线为严格单调上升趋势；PP上细胞生长晕的最大可能直径可比对照组大2 214 μm；实验组曲线增长速度比对照组快，并且其曲线的拐点晚于对照组0.88 d。
图2 不同时间神经植块周围生长晕直径大小曲线
3. 扫描电镜观察：导电玻璃的PP膜表面较平整光滑，微孔较少。硅胶管内壁上的膜状PP表现两种形态特征：一种是表面较光滑,但呈丘陵状，起伏不平；另一种表面不光滑。经2周的培养，PP膜上的雪旺细胞排列或呈束状排列，或是“细胞岛”聚集，细胞间有细长的突起相连。导电玻璃的PP膜上细胞密度大，突起细长(图3)。而硅胶管内壁的PP膜较光滑处细胞生长也较好；但在絮状表面的部位，细胞数则相对稀疏，突起相对粗短。
, 百拇医药
图3 导电玻璃的PP膜表面，雪旺细胞迁移生长好 ×800
讨 论
PP材料为吡咯单体通过电化学氧化法合成的高分子聚合物，是一种具有多种用途的高新技术材料。PP具有导电性，并可作为一种介质吸收和释放某些生物大分子物质。这些特性在生物医学领域中有潜在的研究应用价值，如PP作为检测葡萄糖或蛋白质的生物传感器研究[7]，作为吸收连接蛋白质或DNA的介质研究[8，9]，或作为培养的介质，通过改变PP特性引起细胞形状和功能变化等研究[10]。最近，人们又开始就它在神经的再生中应用可能性进行了探索。Williams等[11]用neur 2a神经母细胞瘤细胞在PP膜上进行体外培养以及混合制成小室埋入鼠体内，结果表明PP能作为细胞生长环境中的有效介质。Schmidt等[12]报告雏鸡坐骨神经或PC-12细胞培养于PP膜上，加电刺激后能显著地增加轴突长度。笔者直接用大鼠的坐骨神经培养于导电玻璃、硅胶管内壁膜状PP上，了解它的生物相容性。结果表明周围神经组织中，雪旺细胞能在导电玻璃PP膜、硅胶管PP膜的光滑部分活跃地生长迁移，并且其生长迁移的方式和鼠尾胶膜一样，经3周的培养，各种细胞的生长状态一直保持良好；拟合的过(0，0)点的Logistic曲线为严格单调上升趋势，实验组曲线增长速度比对照组快。这表明，PP与大鼠周围神经组织确实有较好的生物相容性，而硅胶管的絮状PP上细胞生长相对差些。当然，硅胶管内壁的PP出现的两种表面特征，可能和工作电极的制备有关，因为硅胶管本身是不导电的绝缘体，所以表面处理的影响很大。下一步工作是选择一种更好的硅胶管表面处理方式和最佳的电化学氧化聚合条件，使合成的PP膜既具备较光滑的表面又有很细的微孔，这样的材料更能符合桥接物的要求。同时，要增加硅胶管内壁上PP膜柔韧和黏附强度。
, 百拇医药
目前仅就PP和大鼠周围神经组织进行了联合细胞培养，表明其具有较好的生物相容性。进一步的研究是体内外实验，了解电刺激条件下PP对神经组织生长的影响及桥接再生的情况。
志谢 感谢本院卫生系统计学教研室陈峰副教授在统计学方面提供的帮助
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39425006)、 江苏省教委青蓝工程资助项目
作者单位：王晓冬(226001 南通医学院组织学与胚胎学教研室、神经科学研究所)
顾晓松(226001 南通医学院组织学与胚胎学教研室、神经科学研究所)
张沛云(226001 南通医学院组织学与胚胎学教研室、神经科学研究所)
张天一(226001 南通医学院组织学与胚胎学教研室、神经科学研究所)
, 百拇医药
陈树建(东南大学国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室)
袁春伟(东南大学国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室)
参考文献
1，钟世镇.周围神经基础研究的进展.中华手外科杂志, 1997,13:1-2.
2，陈中伟.显微外科的现状与进展.中华显微外科杂志, 1998, 21:1-2.
3，Fields RD, Beau JML, Lango FM, et al. Nerve regeneration through artificial tubular implants. Prog Neurobiol, 1989,33:87-134.
, 百拇医药 4，朱家恺. 周围神经缺损的显微外科治疗. 中华显微外科杂志， 1999，22：5-7.
5，Kerns JM, Fakhouri AJ, Weinrib HP, et al. Electrical Stimulation of nerve regeneration in the rat: the early effects evaluated by a vibrating probe and electron microscopy. Neurosci, 1991,40:93-107.
6，陈晓东,邓玉东,徐建光,等. 电针对大鼠坐骨神经再生影响的功能评价.中华手外科杂志, 1998,14:121-123.
7，Couves LD, Porter SJ. Polypyrrole as a potentiometric glucose sensor. Synth Met ,1989,28:C761-C768.
, http://www.100md.com
8，Smith AB, Knowles CJ. Investigation of the relationship between conductivity and protein-blinding properties of polypyrrole. J Appl Polym Sci, 1991,42:399-403.
9，Minehan DS, Marx KA, Tripathy SK. Kinetics of DNA binding to polypyrrole. Polym Mater Sci Eng, 1991, 64:341-342.
10，Wong JY, Langer R, Ingber DE. Electrical conducting polymers can notinvasively control the shape and growth of mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:3201-3204.
11，Williams RL, Doherty PJ. A preliminary assessment of polypyrrole in nerve guide studies. J Mat Sci Mat Med,1994,5:429-433.
12，Schmidt CE, Shastri VR, Vacmh JP, et al. Stimulation of neurite outgrowth using an electrically conducting polymer. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:8948-8953., 百拇医药