抗产气荚膜杆菌单克隆抗体的研制与鉴定
甘露 张雅萍 肖光夏
关键词：产气荚膜杆菌(C.P)；单克隆抗体 产气荚膜杆菌(C.P) 是战创伤时导致气性坏疽及厌氧感染最常见的致病菌。本研究的目的是期望制备出高效价的抗C.P的单克隆抗体McAb，以建立快速、简便、敏感性和特异性均很高的检测方法，为临床诊断及治疗提供依据，并为保护性抗体的筛选及有效疫苗的制备打下基础。
材料与方法
1. 免疫原及主要试剂:C.P标准株购自美国ATCC公司，HRP标记的猪抗鼠IgG抗体, 胎牛血清及聚乙二醇(PEG)等为华美生物工程公司产品，BALB/C小鼠由本校动物所提供，其余试剂均为分析纯或化学纯。
2. 单克隆抗体制备:C.P经体积分数为0.5%的甲醛等渗盐水固定后，离心10 min(1 000 r/min)，弃上清，沉淀用等渗盐水混匀，反复离心(1 000 r/min)洗涤3次，以108菌量常规腹腔免疫BALB/C小鼠。融合前3 d加强免疫1次， 并取眼球血检测效价。将免疫小鼠脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞在质量浓度为500 g/L的PEG(MW1 500)作用下融合，HAT培养液选择性培养，采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)法对杂交瘤培养上清进行筛选，将与C.P反应阳性的杂交瘤细胞株经有限稀释法进行克隆化培养至100%孔均为阳性。扩大培养后将杂交瘤细胞接种于已在腹腔内注入降植烷0. 5 ml 1周以上的BALB/C小鼠腹腔制备腹水。
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3. 腹水单克隆抗体效价测定及纯化: (1)采用间接ELISA法测定腹水McAb效价：C.P包被10 mg/L，4℃过夜，然后在 37℃ 条件下 以质量浓度为5 g/L的BSA-PBS封闭2 h，加入待检样品(腹水)静置1.5 h，设正常培养液阴性对照及鼠抗C.P多抗血清的阳性对照。加入HRP-猪抗鼠 IgG 静置1 h，然后用OPD显色系统测定。上述每步骤用含质量浓度为0.5 g/L 的Tween-20 的 PBS(0.01 mmol/L， pH为7.4)洗3次。(2)饱和硫酸胺法对腹水IgG进行粗提:腹水离心15 min (6 000 r/min)，弃沉淀物，上清液加等量PBS，4℃ 搅拌下加入2～3倍腹水量的饱和硫酸胺，继续搅拌1 h，离心15 min (6 000 r/min)，弃上清液； 沉淀以等量PBS重悬，4℃搅拌下加入等量饱和硫酸胺，继续搅拌30～60 min，反复3次，沉淀物以1/2～2/3腹水量的PBS重悬。(3)粗提的McAb装入透析袋，置于PBS液中24 h，其间至少更换3次以上透析液。经过透析后的McAb，过滤除菌后分装，-20℃保存备用。
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4. McAb特性分析:(1)杂交瘤细胞染色体检查: 在已克隆化培养的杂交瘤细胞中加入质量浓度为0.4 mg/L的秋水仙素继续培养4 h，以0.075 mol/L KCl处理15～30 min；再用固定液(3∶1的甲醇与冰醋酸混合液)固定2次，20 min/次，冰水滴片，空气中干燥，Giemsa染色。干燥后封片行染色体鉴定。(2)McAb的亚类鉴定：将羊抗鼠Ig各亚类抗血清与所获腹水行免疫琼脂双向扩散实验。(3)McAb特异性分析：用多种杆菌及梭菌进行ELISA交叉试验， 同时设不包被抗原的阴性对照。(4)McAb敏感性鉴定：将C.P 稀释成不同浓度(103～108 cfu/L)的菌液进行包被，间接ELISA法检测。(5)McAb决定簇分析:采用竞争抑制法。在包被有C.P的两个微孔中加入一种(稀释20倍)单抗；另一孔加入(稀释40倍)两种单抗的混合液，间接ELISA法测定其A492值。抗体之间产生相加效应的程度用相加指数(AI) 表示。AI=[(2A1+2)/(A1+A2)-1]×100%,式中A1和A2表示不同单抗分别单独与抗原作用时的A492值，A1+2表示两种单抗混合后与抗原作用时的A492值。当AI>40%时表示两种McAb识别不同抗原决定族，当AI<25% 时表示两种McAb识别同一抗原决定簇。
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结果
1. 杂交瘤细胞系的建立:经C.P免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP 2/0细胞经常规融合法进行细胞融合，融合率为91.0%，特异性抗体阳性率为11.5%，经有限稀释法克隆3次后，选出效价较高、阳性率为100%的3株分泌抗C.P的杂交瘤细胞系，命名为3E3、3H5和3B1。经冻存3个月后复苏仍能稳定分泌抗体。
2.McAb的鉴定:(1)单抗的效价测定。3株杂交瘤腹水McAb效价间接ELISA法测定分别为1∶60 000，1∶ 20 000和1∶10 000。纯化后蛋白含量测定，抗体浓度7～11 g/L。(2)杂交瘤细胞染色体检查。3株(3E3、3H5、3B1)克隆细胞株的染色体众数分别为95，93和89，大多为端部着丝点染色体， 并有中部着丝点和亚中部着丝点染色体。(3)小鼠IgG亚类鉴定。用琼脂免疫双扩法测得其3株McAb的IgG亚类，其中3E3和3H5属IgG1；3B1属IgG2a。(4)抗体特异性鉴定。以变形杆菌、大肠杆菌、 枯草杆菌、脆弱类杆菌、厌氧性链球菌、产黑类杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、白色念珠菌等包被，常规间接ELISA法检测，未发现有阳性孔，虽未设产气荚膜杆菌B、C、D各型的对照，但基本上可确定属种特异抗体。(5)McAb敏感性鉴定。C.P经梯度稀释后包被，间接ELISA法测定3E3、3H5和3B1的敏感性分别为8×104，2×105和3×105 cfu/L。将3E3与其余任何一种单抗混合，其效价为5×103～10×103 cfu/L,敏感性提高4～6倍。(6)McAb抗原决定簇分析。竞争抑制试验表明，3株McAb作用于不同的抗原决定簇。
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讨论
产气荚膜杆菌是战创时最常见的厌氧致病菌之一[1，2]。其致病性较强，所引起的气性坏疽目前在诊断和治疗上都存在一定困难。诊断往往滞后于临床需要，且目前诊断主要靠创伤组织的局部体征改变，再加上涂片革兰染色及培养，但此时往往已经发生气性坏疽，治疗十分棘手，后果严重。
产气荚膜杆菌免疫源性强。笔者从近十余株阳性克隆中精选3株具有高度亲合力和中和力的单抗，尤其是3E3株，并且3株单抗作用于细菌表面不同的抗原决定簇。在C.P快速诊断方面，可采用其rRNA特异性寡核苷酸探针及PCR技术[2-4]。虽敏感性、特异性高，但假阳性也较高，且技术操作要求十分严格，不宜推广。而用多抗免疫荧光及酶标染色法检测[3-5]，虽时间短、敏感性较高，但为非特异性染色，有一定缺陷。本研究表明，将作用于不同抗原决定簇的McAb混合一起制成单抗池，不但特异性高，并且McAb池的敏感性也较单一的McAb提高4～6倍，有明显的放大效应。由于产气荚膜杆菌B、C、D各型购买、寻找困难， 故未作其余各型的交叉反应。总之，这种高滴度、高特异性的单克隆抗体的制备为C.P的基础与临床研究提供了一种手段和方法，对于急性坏疽快速诊断、治疗及预防(疫苗的研制)有重要意义。
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甘露(400038 重庆，第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
张雅萍(400038 重庆，第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
肖光夏(400038 重庆，第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
参考文献
1，Gomez J,Banos V,Ruiz J,et al.Clinical significance of anaerobic bacteremia in a general hospital: a prospective study from 1988 to 1992. Clin Investig，1993,71:595-597.
2，张雅萍，肖光夏，秦孝健. 烧伤后厌氧菌感染的探索.， 中华外科杂志,，1991，29:240-241
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3，Wilson KH, Blitchington R, Hindenach B, et al. Species-specific oligonucleotide probes for rRNA of clostridium and related species. J Chin Microb, 1988,12:2484-2488.
4，Yamashita Y, Kohno S, Koga H, et al. Detection of bacteroides fragilis in clinical specimens by PCR. J Clin Microbiol, 1994,32:679-683.
5，Tsarev VN, Iastrebova NE, Vaneeva NP,et al. The use of immunoenzyme analysis for diagnosis of an anaerobic infection of the maxillofacial. Stomatol Mosk, 1995,74:38-40.
6，Alvarez M, Rojo P, Latorre M, et al. Diagosis of anaerobic infection of the plural fluid using gas-liquid chromatography. Enferm Infect Microbiol Clin, 1993,11:84-89., http://www.100md.com
关键词：产气荚膜杆菌(C.P)；单克隆抗体 产气荚膜杆菌(C.P) 是战创伤时导致气性坏疽及厌氧感染最常见的致病菌。本研究的目的是期望制备出高效价的抗C.P的单克隆抗体McAb，以建立快速、简便、敏感性和特异性均很高的检测方法，为临床诊断及治疗提供依据，并为保护性抗体的筛选及有效疫苗的制备打下基础。
材料与方法
1. 免疫原及主要试剂:C.P标准株购自美国ATCC公司，HRP标记的猪抗鼠IgG抗体, 胎牛血清及聚乙二醇(PEG)等为华美生物工程公司产品，BALB/C小鼠由本校动物所提供，其余试剂均为分析纯或化学纯。
2. 单克隆抗体制备:C.P经体积分数为0.5%的甲醛等渗盐水固定后，离心10 min(1 000 r/min)，弃上清，沉淀用等渗盐水混匀，反复离心(1 000 r/min)洗涤3次，以108菌量常规腹腔免疫BALB/C小鼠。融合前3 d加强免疫1次， 并取眼球血检测效价。将免疫小鼠脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞在质量浓度为500 g/L的PEG(MW1 500)作用下融合，HAT培养液选择性培养，采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)法对杂交瘤培养上清进行筛选，将与C.P反应阳性的杂交瘤细胞株经有限稀释法进行克隆化培养至100%孔均为阳性。扩大培养后将杂交瘤细胞接种于已在腹腔内注入降植烷0. 5 ml 1周以上的BALB/C小鼠腹腔制备腹水。
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3. 腹水单克隆抗体效价测定及纯化: (1)采用间接ELISA法测定腹水McAb效价：C.P包被10 mg/L，4℃过夜，然后在 37℃ 条件下 以质量浓度为5 g/L的BSA-PBS封闭2 h，加入待检样品(腹水)静置1.5 h，设正常培养液阴性对照及鼠抗C.P多抗血清的阳性对照。加入HRP-猪抗鼠 IgG 静置1 h，然后用OPD显色系统测定。上述每步骤用含质量浓度为0.5 g/L 的Tween-20 的 PBS(0.01 mmol/L， pH为7.4)洗3次。(2)饱和硫酸胺法对腹水IgG进行粗提:腹水离心15 min (6 000 r/min)，弃沉淀物，上清液加等量PBS，4℃ 搅拌下加入2～3倍腹水量的饱和硫酸胺，继续搅拌1 h，离心15 min (6 000 r/min)，弃上清液； 沉淀以等量PBS重悬，4℃搅拌下加入等量饱和硫酸胺，继续搅拌30～60 min，反复3次，沉淀物以1/2～2/3腹水量的PBS重悬。(3)粗提的McAb装入透析袋，置于PBS液中24 h，其间至少更换3次以上透析液。经过透析后的McAb，过滤除菌后分装，-20℃保存备用。
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4. McAb特性分析:(1)杂交瘤细胞染色体检查: 在已克隆化培养的杂交瘤细胞中加入质量浓度为0.4 mg/L的秋水仙素继续培养4 h，以0.075 mol/L KCl处理15～30 min；再用固定液(3∶1的甲醇与冰醋酸混合液)固定2次，20 min/次，冰水滴片，空气中干燥，Giemsa染色。干燥后封片行染色体鉴定。(2)McAb的亚类鉴定：将羊抗鼠Ig各亚类抗血清与所获腹水行免疫琼脂双向扩散实验。(3)McAb特异性分析：用多种杆菌及梭菌进行ELISA交叉试验， 同时设不包被抗原的阴性对照。(4)McAb敏感性鉴定：将C.P 稀释成不同浓度(103～108 cfu/L)的菌液进行包被，间接ELISA法检测。(5)McAb决定簇分析:采用竞争抑制法。在包被有C.P的两个微孔中加入一种(稀释20倍)单抗；另一孔加入(稀释40倍)两种单抗的混合液，间接ELISA法测定其A492值。抗体之间产生相加效应的程度用相加指数(AI) 表示。AI=[(2A1+2)/(A1+A2)-1]×100%,式中A1和A2表示不同单抗分别单独与抗原作用时的A492值，A1+2表示两种单抗混合后与抗原作用时的A492值。当AI>40%时表示两种McAb识别不同抗原决定族，当AI<25% 时表示两种McAb识别同一抗原决定簇。
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结果
1. 杂交瘤细胞系的建立:经C.P免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP 2/0细胞经常规融合法进行细胞融合，融合率为91.0%，特异性抗体阳性率为11.5%，经有限稀释法克隆3次后，选出效价较高、阳性率为100%的3株分泌抗C.P的杂交瘤细胞系，命名为3E3、3H5和3B1。经冻存3个月后复苏仍能稳定分泌抗体。
2.McAb的鉴定:(1)单抗的效价测定。3株杂交瘤腹水McAb效价间接ELISA法测定分别为1∶60 000，1∶ 20 000和1∶10 000。纯化后蛋白含量测定，抗体浓度7～11 g/L。(2)杂交瘤细胞染色体检查。3株(3E3、3H5、3B1)克隆细胞株的染色体众数分别为95，93和89，大多为端部着丝点染色体， 并有中部着丝点和亚中部着丝点染色体。(3)小鼠IgG亚类鉴定。用琼脂免疫双扩法测得其3株McAb的IgG亚类，其中3E3和3H5属IgG1；3B1属IgG2a。(4)抗体特异性鉴定。以变形杆菌、大肠杆菌、 枯草杆菌、脆弱类杆菌、厌氧性链球菌、产黑类杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、白色念珠菌等包被，常规间接ELISA法检测，未发现有阳性孔，虽未设产气荚膜杆菌B、C、D各型的对照，但基本上可确定属种特异抗体。(5)McAb敏感性鉴定。C.P经梯度稀释后包被，间接ELISA法测定3E3、3H5和3B1的敏感性分别为8×104，2×105和3×105 cfu/L。将3E3与其余任何一种单抗混合，其效价为5×103～10×103 cfu/L,敏感性提高4～6倍。(6)McAb抗原决定簇分析。竞争抑制试验表明，3株McAb作用于不同的抗原决定簇。
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讨论
产气荚膜杆菌是战创时最常见的厌氧致病菌之一[1，2]。其致病性较强，所引起的气性坏疽目前在诊断和治疗上都存在一定困难。诊断往往滞后于临床需要，且目前诊断主要靠创伤组织的局部体征改变，再加上涂片革兰染色及培养，但此时往往已经发生气性坏疽，治疗十分棘手，后果严重。
产气荚膜杆菌免疫源性强。笔者从近十余株阳性克隆中精选3株具有高度亲合力和中和力的单抗，尤其是3E3株，并且3株单抗作用于细菌表面不同的抗原决定簇。在C.P快速诊断方面，可采用其rRNA特异性寡核苷酸探针及PCR技术[2-4]。虽敏感性、特异性高，但假阳性也较高，且技术操作要求十分严格，不宜推广。而用多抗免疫荧光及酶标染色法检测[3-5]，虽时间短、敏感性较高，但为非特异性染色，有一定缺陷。本研究表明，将作用于不同抗原决定簇的McAb混合一起制成单抗池，不但特异性高，并且McAb池的敏感性也较单一的McAb提高4～6倍，有明显的放大效应。由于产气荚膜杆菌B、C、D各型购买、寻找困难， 故未作其余各型的交叉反应。总之，这种高滴度、高特异性的单克隆抗体的制备为C.P的基础与临床研究提供了一种手段和方法，对于急性坏疽快速诊断、治疗及预防(疫苗的研制)有重要意义。
, 百拇医药
甘露(400038 重庆，第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
张雅萍(400038 重庆，第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
肖光夏(400038 重庆，第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
参考文献
1，Gomez J,Banos V,Ruiz J,et al.Clinical significance of anaerobic bacteremia in a general hospital: a prospective study from 1988 to 1992. Clin Investig，1993,71:595-597.
2，张雅萍，肖光夏，秦孝健. 烧伤后厌氧菌感染的探索.， 中华外科杂志,，1991，29:240-241
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3，Wilson KH, Blitchington R, Hindenach B, et al. Species-specific oligonucleotide probes for rRNA of clostridium and related species. J Chin Microb, 1988,12:2484-2488.
4，Yamashita Y, Kohno S, Koga H, et al. Detection of bacteroides fragilis in clinical specimens by PCR. J Clin Microbiol, 1994,32:679-683.
5，Tsarev VN, Iastrebova NE, Vaneeva NP,et al. The use of immunoenzyme analysis for diagnosis of an anaerobic infection of the maxillofacial. Stomatol Mosk, 1995,74:38-40.
6，Alvarez M, Rojo P, Latorre M, et al. Diagosis of anaerobic infection of the plural fluid using gas-liquid chromatography. Enferm Infect Microbiol Clin, 1993,11:84-89., http://www.100md.com