碱性成纤维细胞生长因子对大鼠实验性肾小管损伤和间质病变的作用
杜爱萍 邹万忠
摘 要 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 在大鼠肾小管损伤、再生以及肾间质病变过程中的作用。方法 应用Northern印迹杂交、原位杂交及免疫组织化学SP方法,观察在大鼠的庆大霉素中毒性肾小管损伤和再生过程中,bFGF及其受体(FGFR1)表达的情况，3H-TdR掺入法检测bFGF对培养的肾小管上皮细胞和肾间质成纤维细胞增殖的影响。结果 肾小管上皮细胞损伤和再生过程中，bFGF mRNA有表达，随着修复的增强，表达量逐渐增高；同时bFGF和FGFR1蛋白合成亦增加，主要分布于损伤及再生的肾小管上皮细胞，与mRNA分布一致。bFGF能够促进培养的肾小管上皮细胞和肾间质成纤维细胞的分裂增殖。结论 肾小管损伤和再生过程中，bFGF和FGFR1表达增强，一方面促进肾小管损伤的修复；另一方面还促进肾间质成纤维细胞增殖，提示bFGF在肾小管损伤和间质纤维化过程中起一定的作用。
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关键词：肾小管；肾疾病；成纤维细胞生长因子，碱性；受体，成纤维细胞生长因子
慢性肾功能衰竭往往伴有肾小管损伤和间质纤维化，即肾小管萎缩、间质淋巴细胞和单核细胞浸润以及间质纤维化。研究肾小管损伤和间质纤维化对于揭示慢性肾功能衰竭有着重要的意义。与正常肾脏相比，损伤的肾小管及浸润间质的淋巴细胞和单核细胞能够分泌较多的细胞因子和生长因子。我们采用庆大霉素损伤肾小管的模型，旨在了解肾小管损伤和再生以及间质病变过程中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 及其受体(FGFR1)的产生规律；并观察bFGF对肾小管上皮细胞和肾间质成纤维细胞的增殖的影响。为阐明bFGF在肾小管损伤和间质纤维化过程中的作用提供依据。
材料与方法
1.材料：Wistar大鼠，雌性，体重200～250 g， 北京医科大学动物部提供。庆大霉素(北京制药厂,批号95071914)。动物分组：实验组：21只，腹腔注射庆大霉素400 mg*kg-1*d-1，每天分2次注射，每次0.8 ml，注射4 d后停止。分别于实验第5、7、9、11、13、16、19 d各宰杀3只。对照组：5只，无菌条件下腹腔注射生理盐水0.8 ml ，每天2次，注射4 d。 于第11和19 d宰杀。所有动物宰杀后取肾。
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2.光镜检查：肾组织用Bouin固定，石蜡包埋，3 μm切片，HE染色。
3.Northern印迹杂交：按Sambrook等方法进行。质粒pGEM-3Z vector由美国耶鲁大学医学院T.X.Lin教授赠送，质粒全长2 743 bp，经过提取，Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切，回收纯化，获得含bFGF特异基因序列的模板DNA(1 410 bp),用随机引物标记试剂盒(美国Promega公司产品)，以α-32P -dCTP (北京亚辉生物制品公司)标记作为探针。异硫氰酸胍一步法提取不同实验时间大鼠肾脏的总RNA。硝酸纤维素膜经预杂交，杂交，放射自显影，获得bFGF mRNA特异杂交带。
4.原位杂交：(1)探针制备：以上述含bFGF特异基因序列的质粒作模板，随机引物法制备地高辛标记的cDNA探针。(2)杂交：3 μm切片贴覆于APES胶处理的载玻片上，60℃烤4 h，脱蜡至水，0.2 mol/L HCl处理，蛋白酶K消化(100 μg/ml)，37 ℃，15 min，晾干。取标记的探针5 μl，加入去离子甲酰胺10 μl,鲑精DNA 1 μl,100℃变性5 min，0℃ 骤冷3 min，离心收集，依次加入50×Denhardt液2 μl,50%硫酸葡聚糖2 μl,1 mol/L二硫苏糖醇(DTT)1 μl,20×SSC 4 μl,混匀，42℃孵育16～18 h，杂交后依次用2×SSC、1×SSC洗2次，每次15 min；用抗地高辛抗体(1∶500稀释)，BCIP/NBT显色；树胶封片，光镜观察。并设不加探针的阴性对照。
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5.免疫组织化学染色：肾组织用4%多聚甲醛固定，常规切片，一抗为兔抗人bFGF多克隆抗体(1∶100稀释，Santa Cruz公司产品)，兔抗人FGFR1单克隆抗体(1∶50稀释,Santa Cruz公司产品)，用SP法进行，均设不加一抗的阴性对照。以细胞质或细胞膜呈深棕色为阳性。
6.3H-TdR掺入法观察bFGF对肾小管上皮细胞增殖的影响：无菌条件迅速取大鼠肾皮质，分别于80、140钼网筛上研磨，收集140钼网筛上的肾小管，胶原酶(0.5 mg/ml)消化20 min，含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养，传代，通过透射电镜观察、免疫组织化学染色角蛋白(AE1/AE3)阳性、波形蛋白阴性，证实为肾小管上皮细胞(图1)，将第2代细胞用胰酶消化，以104个/孔种入96孔板，8 h后换成含1%小牛血清RPMI 1640的培养液继续培养20 h，加入bFGF(北京白鹭园生物制品公司)，使终浓度分别为0.5 ng/ml、5 ng/ml，每个浓度设3个平行孔，并设3个对照孔，分别于8、24、32、48 h收集细胞，收集细胞前7 h加入18.5 kBq/孔3H-TdR。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烘干，浸入闪烁液(PPO：0.1%，POPOP：0.05%)，Beckman液闪仪检测。
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7.3H-TdR掺入法观察bFGF对肾间质成纤维细胞的促增殖作用：无菌条件下取大鼠肾，在Hanks液里剪碎，种入培养瓶，20%小牛血清DMEM培养，1周后传代。经电镜形态观察、免疫组织化学染色波形蛋白阳性、角蛋白阴性，及应用含右旋缬氨酸的MEM培养基替代培养，鉴定为成纤维细胞(图2，3)。
图1 培养的大鼠肾小管上皮细胞
图2 培养的大鼠肾间质成纤维细胞
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图3 在含有右旋缬氨酸的培养基内，大鼠肾间质成纤维细胞收缩及死亡
将第二代细胞用胰酶消化，以104个/孔种入96孔板，8 h后换成含1%小牛血清的DMEM培养液继续培养20 h，加入bFGF，使终浓度分别为5、10、50 ng/ml，每个浓度设3个平行孔，并设3个对照孔，分别于8、24、32、48 h收集细胞，收集细胞前7 h加入18.5 kBq/孔3H-TdR。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烘干，浸入闪烁液(PPO：0.1%，POPOP：0.05%)，Beckman液闪仪检测。
8.统计学处理：实验结果以X±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。
结果
1.光镜检查：肾小球无明显病变。实验第5 d，肾脏近端肾小管上皮细胞灶状坏死，肾间质弥漫性水肿，第7 d，肾小管上皮细胞多灶状至弥漫坏死，并有再生现象，肾间质水肿并有灶状单个核细胞浸润，第9和11 d，肾小管上皮细胞以再生为主，细胞核大，染色质增多而浓染，细胞质少，排列紊乱，肾间质单个核细胞浸润增多，伴有梭形成纤维细胞增生(图4)，第13 d以后，肾小管逐渐修复。
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2.Northern 印迹杂交：肾小管损伤和再生过程中,不同时间点均有bFGF的表达，表达量在实验第5 d较低，第7、9和11 d(再生高峰)逐渐增高(图5)。
图4 实验第9 d，肾小管上皮细胞再生，肾间质水肿及单个核细胞浸润 HE×100
图6 实验第9d，免疫组织化学染色显示bFGF阳性分布于近曲小管胞质内和肾间质细胞内 SP法×200
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图7 实验第9 d，免疫组织化学染色显示FGFR1阳性分布于近曲小管胞质内和肾间质细胞膜 SP法×200
1：对照，2：实验第5 d，3：实验第7 d，4：实验第9 d，5：实验第11 d
图5 Northern印迹杂交显示不同时间
bFGF mRNA表达情况
3.原位杂交：实验组在实验第5、7 d，损伤和再生的肾小管bFGF弱阳性，紫褐色颗粒分布于胞质内，第9和11 d，着色细胞增多而深染。持续到第13 d以后，肾小管阳性细胞逐渐减少。肾间质浸润的单个核细胞、成纤维细胞亦呈阳性。第15 d仅有肾小管的个别细胞阳性。正常肾组织肾小管和肾间质，bFGF的原位杂交显示阴性。
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4.免疫组织化学：实验组在实验第5、7 d，损伤和再生的肾小管bFGF呈弱阳性表达，第9 d(再生高峰)以后，阳性细胞逐渐增多，棕黄色阳性标记分布于胞质内(图6)。持续到第13 d，阳性细胞减少。间质单个核细胞和成纤维细胞阳性。FGFR1棕黄色的阳性标记分布于损伤和再生的肾小管上皮细胞及间质成纤维细胞、单个核细胞膜上(图7)。损伤期表达较弱，再生期表达增强。正常肾组织肾小管和肾间质bFGF和FGFR1阴性。
5.bFGF对培养的肾小管上皮细胞增殖的影响：加入浓度为0.5、5 ng/ml bFGF后，各时间点3H-TdR掺入率显示，实验组高于对照组，以8 h至32 h最显著，48 h作用基本消失(表1)。
表1 不同时间和浓度的bFGF刺激肾小管上皮细胞3H-TdR
掺入率(Bq/104细胞，X±s，n=6)
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bFGF浓度
(ng/ml)
时间
8 h
24 h
32 h
48 h
0
36.14±
1.52
23.58±
1.58
11.28±
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1.05
5.66±
1.44
0.5
44.57±
1.50*
43.32±
1.84*
23.90±
1.74*
7.23±
1.47
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5.0
44.64±
1.59*
42.47±
2.49*
23.30±
1.89*
8.84±
1.50*
F值
60.656
185.536
, 百拇医药
118.446
7.018
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：*与未加bFGF组(即0)相比P<0.05
6.bFGF对培养的肾间质成纤维细胞促增殖实验：加入浓度为5、10、50 ng/ml bFGF后，各时间点3H-TdR掺入率显示，实验组高于对照组，作用持续时间较长，直到48 h仍有较强的促增殖作用(表2)。
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讨论
近年来，大量临床病理资料的系统的研究发现，慢性进行性肾小球疾病、肾小管疾病和肾间质疾病引起的肾功能损伤必然伴有肾小管和肾间质的病变，其中以肾小球疾病最多见，但肾小球病变只是一个启动因素，而肾小管和肾间质的病变与肾功能的关系更为密切。所以深入研究肾小管和肾间质病变是肾病学界近年来关注的热点问题之一。与肾小管损伤、再生和间质病变有关的细胞因子和生长因子有多种, 其中对转化生长因子和血小板源性生长因子的研究较多[1，2]，而对FGF的研究较少。
表2 不同时间和浓度的bFGF刺激肾间质成纤维
细胞3H-TdR掺入率(Bq/104细胞，X±s，n=6)
bFGF浓度
(ng/ml)
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时间
8 h
24 h
32 h
48 h
0
22.7±1.4
22.1±1.3
20.2±1.2
13.0±1.2
5
40.3±1.9*
, 百拇医药 33.0±1.5*
27.5±1.7*
18.5±2.0*
10
34.7±1.5*
31.3±1.0*
27.1±1.8*
18.7±1.7*
50
30.5±2.0*
, 百拇医药
30.5±1.1*
21.6±1.3
13.7±1.5
F值
41.355
15.572
13.190
20.430
P值
<0.01
<0.01
<0.01
, 百拇医药
<0.01
注：*与未加bFGF组(即0)相比P<0.05 FGF最早是由Gospodarowicz[3]从脑和垂体中纯化出的一种多肽因子，对培养的成纤维细胞具有很强的促增殖作用，故命名为成纤维细胞生长因子。对肾小管上皮细胞增生与FGF的关系研究较少。
我们发现在肾小管损伤和再生过程中，实验组在实验第5 d bFGF mRNA表达量较低，而第7、9和11 d表达增高，这时正是损伤的肾小管修复再生的高峰,免疫组织化学显示bFGF阳性表达主要分布于损伤和再生的肾小管上皮细胞胞质，以后的表达又逐渐降低，仅个别细胞阳性。第19 d肾小管完全修复，这时的bFGF阳性染色仅见于肾间质的单个核细胞和成纤维细胞。免疫组织化学染色结果显示bFGF分布和强度与原位杂交结果大致吻合，表明bFGF蛋白主要由再生的肾小管上皮细胞合成，而非重吸收的蛋白。肾小管再生时，bFGF高表达，bFGF蛋白合成功能增强，而正常情况下，肾脏bFGF表达量很低，仅见于肾间质成纤维细胞，表明肾小管上皮细胞受损伤并进而再生时，合成和分泌bFGF的功能增强。有研究表明，肾脏发育过程中，肾实质细胞一过性高表达aFGF和bFGF，诱导肾小管分化，从而可以设想,肾小管的损伤修复过程中，恰恰模仿了肾脏的发育过程[4]。
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bFGF对成纤维细胞的促增殖作用是公认的事实，我们的实验中bFGF对肾间质成纤维细胞的促增殖实验也证实了这一点。bFGF的高表达一方面促进肾小管上皮细胞增生，另一方面促进其分化。正如人类慢性进行性肾脏疾病那样，肾小管上皮细胞长期处于反复损伤和再生的过程中，势必导致肾间质长期处于高bFGF的环境中，促进肾间质单个核细胞浸润和成纤维细胞增生，便可能导致肾间质纤维化。
各种细胞因子和生长因子作用于细胞和组织，靶细胞和靶器官必须有相应的受体。FGF有两类受体，一类是高亲和力受体(如FGFR1)，属酪氨酸蛋白激酶类受体，另一类为低亲合力受体，即肝素样受体。高亲和力受体由胞内区、跨膜区、胞外区3部分组成[5]。本研究用免疫组织化学证实，肾小管损伤和再生过程中，FGFR1蛋白合成增加，分布于损伤和再生的肾小管、肾间质单个核细胞和成纤维细胞，这为bFGF的促增殖作用奠定了基础。进一步的体外实验表明，bFGF具有促进肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞增殖的作用，显示bFGF与细胞表面的受体结合，使处在静止期的细胞进入S期。
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综上所述，肾小管上皮细胞的损伤和再生过程中，bFGF及FGFR1合成和分泌增强，通过自分泌和旁分泌机制促进肾小管上皮细胞增殖与分化，使受损的肾小管完全再生。另外一方面还可能促进间质成纤维细胞增殖，并使细胞外基质合成。由此表明，bFGF在肾小管损伤和间质病变乃至纤维化的发展过程中起着很重要的作用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770293)
作者单位：杜爱萍(100083 北京医科大学病理学系)
邹万忠(100083 北京医科大学病理学系)
参考文献
1 Kovacs EJ. Fibrogenic cytokines: the role of immune mediators in the development of scar tissue. Immunol Today, 1991,12:17-23.
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2 Knecht A, Fine LG, Kleinman KS, et al. Fibroblasts of rabbit kidney in culture. II.Paracrine stimulation of papillary fibroblasts by PDGF. Am J Physiol,1991,261(2 Pt 2):F292-F299.
3 Gospodarowicz D.Fibroblast growth factor.In:Aggarwal BB, Gutterman JU,eds.Human cytokines:handbook for basic and clinical research.Boston:Blackwell Scientific Publication,1992.329-348.
4 Kerby JD, Luo KL, Ding Q, et al. Immunolocalization of acidic fibroblast growth factor and receptors in the tubulointerstitial compartment of chronically rejected human renal allografts. Transplantation, 1997,63:988-995.
5 Jaye M, Schlessinger J, Dionne CA. Fibroblast growth factor receptor tyrosine kinases molecular analysis and signal transduction. Biochem Biophy Acta, 1992，1135:185-199., 百拇医药
摘 要 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 在大鼠肾小管损伤、再生以及肾间质病变过程中的作用。方法 应用Northern印迹杂交、原位杂交及免疫组织化学SP方法,观察在大鼠的庆大霉素中毒性肾小管损伤和再生过程中,bFGF及其受体(FGFR1)表达的情况，3H-TdR掺入法检测bFGF对培养的肾小管上皮细胞和肾间质成纤维细胞增殖的影响。结果 肾小管上皮细胞损伤和再生过程中，bFGF mRNA有表达，随着修复的增强，表达量逐渐增高；同时bFGF和FGFR1蛋白合成亦增加，主要分布于损伤及再生的肾小管上皮细胞，与mRNA分布一致。bFGF能够促进培养的肾小管上皮细胞和肾间质成纤维细胞的分裂增殖。结论 肾小管损伤和再生过程中，bFGF和FGFR1表达增强，一方面促进肾小管损伤的修复；另一方面还促进肾间质成纤维细胞增殖，提示bFGF在肾小管损伤和间质纤维化过程中起一定的作用。
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关键词：肾小管；肾疾病；成纤维细胞生长因子，碱性；受体，成纤维细胞生长因子
慢性肾功能衰竭往往伴有肾小管损伤和间质纤维化，即肾小管萎缩、间质淋巴细胞和单核细胞浸润以及间质纤维化。研究肾小管损伤和间质纤维化对于揭示慢性肾功能衰竭有着重要的意义。与正常肾脏相比，损伤的肾小管及浸润间质的淋巴细胞和单核细胞能够分泌较多的细胞因子和生长因子。我们采用庆大霉素损伤肾小管的模型，旨在了解肾小管损伤和再生以及间质病变过程中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 及其受体(FGFR1)的产生规律；并观察bFGF对肾小管上皮细胞和肾间质成纤维细胞的增殖的影响。为阐明bFGF在肾小管损伤和间质纤维化过程中的作用提供依据。
材料与方法
1.材料：Wistar大鼠，雌性，体重200～250 g， 北京医科大学动物部提供。庆大霉素(北京制药厂,批号95071914)。动物分组：实验组：21只，腹腔注射庆大霉素400 mg*kg-1*d-1，每天分2次注射，每次0.8 ml，注射4 d后停止。分别于实验第5、7、9、11、13、16、19 d各宰杀3只。对照组：5只，无菌条件下腹腔注射生理盐水0.8 ml ，每天2次，注射4 d。 于第11和19 d宰杀。所有动物宰杀后取肾。
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2.光镜检查：肾组织用Bouin固定，石蜡包埋，3 μm切片，HE染色。
3.Northern印迹杂交：按Sambrook等方法进行。质粒pGEM-3Z vector由美国耶鲁大学医学院T.X.Lin教授赠送，质粒全长2 743 bp，经过提取，Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切，回收纯化，获得含bFGF特异基因序列的模板DNA(1 410 bp),用随机引物标记试剂盒(美国Promega公司产品)，以α-32P -dCTP (北京亚辉生物制品公司)标记作为探针。异硫氰酸胍一步法提取不同实验时间大鼠肾脏的总RNA。硝酸纤维素膜经预杂交，杂交，放射自显影，获得bFGF mRNA特异杂交带。
4.原位杂交：(1)探针制备：以上述含bFGF特异基因序列的质粒作模板，随机引物法制备地高辛标记的cDNA探针。(2)杂交：3 μm切片贴覆于APES胶处理的载玻片上，60℃烤4 h，脱蜡至水，0.2 mol/L HCl处理，蛋白酶K消化(100 μg/ml)，37 ℃，15 min，晾干。取标记的探针5 μl，加入去离子甲酰胺10 μl,鲑精DNA 1 μl,100℃变性5 min，0℃ 骤冷3 min，离心收集，依次加入50×Denhardt液2 μl,50%硫酸葡聚糖2 μl,1 mol/L二硫苏糖醇(DTT)1 μl,20×SSC 4 μl,混匀，42℃孵育16～18 h，杂交后依次用2×SSC、1×SSC洗2次，每次15 min；用抗地高辛抗体(1∶500稀释)，BCIP/NBT显色；树胶封片，光镜观察。并设不加探针的阴性对照。
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5.免疫组织化学染色：肾组织用4%多聚甲醛固定，常规切片，一抗为兔抗人bFGF多克隆抗体(1∶100稀释，Santa Cruz公司产品)，兔抗人FGFR1单克隆抗体(1∶50稀释,Santa Cruz公司产品)，用SP法进行，均设不加一抗的阴性对照。以细胞质或细胞膜呈深棕色为阳性。
6.3H-TdR掺入法观察bFGF对肾小管上皮细胞增殖的影响：无菌条件迅速取大鼠肾皮质，分别于80、140钼网筛上研磨，收集140钼网筛上的肾小管，胶原酶(0.5 mg/ml)消化20 min，含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养，传代，通过透射电镜观察、免疫组织化学染色角蛋白(AE1/AE3)阳性、波形蛋白阴性，证实为肾小管上皮细胞(图1)，将第2代细胞用胰酶消化，以104个/孔种入96孔板，8 h后换成含1%小牛血清RPMI 1640的培养液继续培养20 h，加入bFGF(北京白鹭园生物制品公司)，使终浓度分别为0.5 ng/ml、5 ng/ml，每个浓度设3个平行孔，并设3个对照孔，分别于8、24、32、48 h收集细胞，收集细胞前7 h加入18.5 kBq/孔3H-TdR。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烘干，浸入闪烁液(PPO：0.1%，POPOP：0.05%)，Beckman液闪仪检测。
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7.3H-TdR掺入法观察bFGF对肾间质成纤维细胞的促增殖作用：无菌条件下取大鼠肾，在Hanks液里剪碎，种入培养瓶，20%小牛血清DMEM培养，1周后传代。经电镜形态观察、免疫组织化学染色波形蛋白阳性、角蛋白阴性，及应用含右旋缬氨酸的MEM培养基替代培养，鉴定为成纤维细胞(图2，3)。
图1 培养的大鼠肾小管上皮细胞
图2 培养的大鼠肾间质成纤维细胞
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图3 在含有右旋缬氨酸的培养基内，大鼠肾间质成纤维细胞收缩及死亡
将第二代细胞用胰酶消化，以104个/孔种入96孔板，8 h后换成含1%小牛血清的DMEM培养液继续培养20 h，加入bFGF，使终浓度分别为5、10、50 ng/ml，每个浓度设3个平行孔，并设3个对照孔，分别于8、24、32、48 h收集细胞，收集细胞前7 h加入18.5 kBq/孔3H-TdR。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烘干，浸入闪烁液(PPO：0.1%，POPOP：0.05%)，Beckman液闪仪检测。
8.统计学处理：实验结果以X±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。
结果
1.光镜检查：肾小球无明显病变。实验第5 d，肾脏近端肾小管上皮细胞灶状坏死，肾间质弥漫性水肿，第7 d，肾小管上皮细胞多灶状至弥漫坏死，并有再生现象，肾间质水肿并有灶状单个核细胞浸润，第9和11 d，肾小管上皮细胞以再生为主，细胞核大，染色质增多而浓染，细胞质少，排列紊乱，肾间质单个核细胞浸润增多，伴有梭形成纤维细胞增生(图4)，第13 d以后，肾小管逐渐修复。
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2.Northern 印迹杂交：肾小管损伤和再生过程中,不同时间点均有bFGF的表达，表达量在实验第5 d较低，第7、9和11 d(再生高峰)逐渐增高(图5)。
图4 实验第9 d，肾小管上皮细胞再生，肾间质水肿及单个核细胞浸润 HE×100
图6 实验第9d，免疫组织化学染色显示bFGF阳性分布于近曲小管胞质内和肾间质细胞内 SP法×200
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图7 实验第9 d，免疫组织化学染色显示FGFR1阳性分布于近曲小管胞质内和肾间质细胞膜 SP法×200
1：对照，2：实验第5 d，3：实验第7 d，4：实验第9 d，5：实验第11 d
图5 Northern印迹杂交显示不同时间
bFGF mRNA表达情况
3.原位杂交：实验组在实验第5、7 d，损伤和再生的肾小管bFGF弱阳性，紫褐色颗粒分布于胞质内，第9和11 d，着色细胞增多而深染。持续到第13 d以后，肾小管阳性细胞逐渐减少。肾间质浸润的单个核细胞、成纤维细胞亦呈阳性。第15 d仅有肾小管的个别细胞阳性。正常肾组织肾小管和肾间质，bFGF的原位杂交显示阴性。
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4.免疫组织化学：实验组在实验第5、7 d，损伤和再生的肾小管bFGF呈弱阳性表达，第9 d(再生高峰)以后，阳性细胞逐渐增多，棕黄色阳性标记分布于胞质内(图6)。持续到第13 d，阳性细胞减少。间质单个核细胞和成纤维细胞阳性。FGFR1棕黄色的阳性标记分布于损伤和再生的肾小管上皮细胞及间质成纤维细胞、单个核细胞膜上(图7)。损伤期表达较弱，再生期表达增强。正常肾组织肾小管和肾间质bFGF和FGFR1阴性。
5.bFGF对培养的肾小管上皮细胞增殖的影响：加入浓度为0.5、5 ng/ml bFGF后，各时间点3H-TdR掺入率显示，实验组高于对照组，以8 h至32 h最显著，48 h作用基本消失(表1)。
表1 不同时间和浓度的bFGF刺激肾小管上皮细胞3H-TdR
掺入率(Bq/104细胞，X±s，n=6)
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bFGF浓度
(ng/ml)
时间
8 h
24 h
32 h
48 h
0
36.14±
1.52
23.58±
1.58
11.28±
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1.05
5.66±
1.44
0.5
44.57±
1.50*
43.32±
1.84*
23.90±
1.74*
7.23±
1.47
, 百拇医药
5.0
44.64±
1.59*
42.47±
2.49*
23.30±
1.89*
8.84±
1.50*
F值
60.656
185.536
, 百拇医药
118.446
7.018
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：*与未加bFGF组(即0)相比P<0.05
6.bFGF对培养的肾间质成纤维细胞促增殖实验：加入浓度为5、10、50 ng/ml bFGF后，各时间点3H-TdR掺入率显示，实验组高于对照组，作用持续时间较长，直到48 h仍有较强的促增殖作用(表2)。
, 百拇医药
讨论
近年来，大量临床病理资料的系统的研究发现，慢性进行性肾小球疾病、肾小管疾病和肾间质疾病引起的肾功能损伤必然伴有肾小管和肾间质的病变，其中以肾小球疾病最多见，但肾小球病变只是一个启动因素，而肾小管和肾间质的病变与肾功能的关系更为密切。所以深入研究肾小管和肾间质病变是肾病学界近年来关注的热点问题之一。与肾小管损伤、再生和间质病变有关的细胞因子和生长因子有多种, 其中对转化生长因子和血小板源性生长因子的研究较多[1，2]，而对FGF的研究较少。
表2 不同时间和浓度的bFGF刺激肾间质成纤维
细胞3H-TdR掺入率(Bq/104细胞，X±s，n=6)
bFGF浓度
(ng/ml)
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时间
8 h
24 h
32 h
48 h
0
22.7±1.4
22.1±1.3
20.2±1.2
13.0±1.2
5
40.3±1.9*
, 百拇医药 33.0±1.5*
27.5±1.7*
18.5±2.0*
10
34.7±1.5*
31.3±1.0*
27.1±1.8*
18.7±1.7*
50
30.5±2.0*
, 百拇医药
30.5±1.1*
21.6±1.3
13.7±1.5
F值
41.355
15.572
13.190
20.430
P值
<0.01
<0.01
<0.01
, 百拇医药
<0.01
注：*与未加bFGF组(即0)相比P<0.05 FGF最早是由Gospodarowicz[3]从脑和垂体中纯化出的一种多肽因子，对培养的成纤维细胞具有很强的促增殖作用，故命名为成纤维细胞生长因子。对肾小管上皮细胞增生与FGF的关系研究较少。
我们发现在肾小管损伤和再生过程中，实验组在实验第5 d bFGF mRNA表达量较低，而第7、9和11 d表达增高，这时正是损伤的肾小管修复再生的高峰,免疫组织化学显示bFGF阳性表达主要分布于损伤和再生的肾小管上皮细胞胞质，以后的表达又逐渐降低，仅个别细胞阳性。第19 d肾小管完全修复，这时的bFGF阳性染色仅见于肾间质的单个核细胞和成纤维细胞。免疫组织化学染色结果显示bFGF分布和强度与原位杂交结果大致吻合，表明bFGF蛋白主要由再生的肾小管上皮细胞合成，而非重吸收的蛋白。肾小管再生时，bFGF高表达，bFGF蛋白合成功能增强，而正常情况下，肾脏bFGF表达量很低，仅见于肾间质成纤维细胞，表明肾小管上皮细胞受损伤并进而再生时，合成和分泌bFGF的功能增强。有研究表明，肾脏发育过程中，肾实质细胞一过性高表达aFGF和bFGF，诱导肾小管分化，从而可以设想,肾小管的损伤修复过程中，恰恰模仿了肾脏的发育过程[4]。
, 百拇医药
bFGF对成纤维细胞的促增殖作用是公认的事实，我们的实验中bFGF对肾间质成纤维细胞的促增殖实验也证实了这一点。bFGF的高表达一方面促进肾小管上皮细胞增生，另一方面促进其分化。正如人类慢性进行性肾脏疾病那样，肾小管上皮细胞长期处于反复损伤和再生的过程中，势必导致肾间质长期处于高bFGF的环境中，促进肾间质单个核细胞浸润和成纤维细胞增生，便可能导致肾间质纤维化。
各种细胞因子和生长因子作用于细胞和组织，靶细胞和靶器官必须有相应的受体。FGF有两类受体，一类是高亲和力受体(如FGFR1)，属酪氨酸蛋白激酶类受体，另一类为低亲合力受体，即肝素样受体。高亲和力受体由胞内区、跨膜区、胞外区3部分组成[5]。本研究用免疫组织化学证实，肾小管损伤和再生过程中，FGFR1蛋白合成增加，分布于损伤和再生的肾小管、肾间质单个核细胞和成纤维细胞，这为bFGF的促增殖作用奠定了基础。进一步的体外实验表明，bFGF具有促进肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞增殖的作用，显示bFGF与细胞表面的受体结合，使处在静止期的细胞进入S期。
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综上所述，肾小管上皮细胞的损伤和再生过程中，bFGF及FGFR1合成和分泌增强，通过自分泌和旁分泌机制促进肾小管上皮细胞增殖与分化，使受损的肾小管完全再生。另外一方面还可能促进间质成纤维细胞增殖，并使细胞外基质合成。由此表明，bFGF在肾小管损伤和间质病变乃至纤维化的发展过程中起着很重要的作用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770293)
作者单位：杜爱萍(100083 北京医科大学病理学系)
邹万忠(100083 北京医科大学病理学系)
参考文献
1 Kovacs EJ. Fibrogenic cytokines: the role of immune mediators in the development of scar tissue. Immunol Today, 1991,12:17-23.
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2 Knecht A, Fine LG, Kleinman KS, et al. Fibroblasts of rabbit kidney in culture. II.Paracrine stimulation of papillary fibroblasts by PDGF. Am J Physiol,1991,261(2 Pt 2):F292-F299.
3 Gospodarowicz D.Fibroblast growth factor.In:Aggarwal BB, Gutterman JU,eds.Human cytokines:handbook for basic and clinical research.Boston:Blackwell Scientific Publication,1992.329-348.
4 Kerby JD, Luo KL, Ding Q, et al. Immunolocalization of acidic fibroblast growth factor and receptors in the tubulointerstitial compartment of chronically rejected human renal allografts. Transplantation, 1997,63:988-995.
5 Jaye M, Schlessinger J, Dionne CA. Fibroblast growth factor receptor tyrosine kinases molecular analysis and signal transduction. Biochem Biophy Acta, 1992，1135:185-199., 百拇医药