细胞周期蛋白E对乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响
黄玫 杨邵敏 廖松林 张波 由江峰
摘 要 目的 观察细胞周期蛋白(cyclin)E的表达对乳腺癌细胞MCF-7生长及其他周期相关基因的影响。方法 构建正义和反义cyclin E cDNA真核表达载体，并采用lipofect AMINE转染，将其导入MCF-7细胞，获得稳定表达正义及反义cyclin E的细胞系，经Southern和Western blot检测有外源性片段的插入及表达；并作细胞生长曲线、四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞计数分析；用Western blot检测其他周期相关基因的表达。结果 cyclin E的高表达可以使细胞的生长速度加快(1.52倍)，DNA合成增加(4.2倍)，G1-S期的移行加速，pRB的磷酸化形式增多(约为对照组的3倍)，但同时也上调p27的表达；而反义cyclin E则有相反的结果，降低cyclin E表达，并使细胞的生长减缓(抑制率为17.5%)，DNA合成下降(48.6%), G1-S期移行减缓；同时pRB的低磷酸化形式增多，并下调p27。结论 cyclin E的表达可以影响乳腺癌MCF-7细胞的生长及增殖，并可能通过pRB的磷酸化而影响细胞周期G1-S期移行，而实现其调节功能。
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关键词：乳腺肿瘤；细胞周期蛋白质类；基因，CDC；转染；肿瘤细胞，培养的
细胞周期蛋白E( cyclin E )是G1期重要的周期蛋白，与细胞周期蛋白质依赖激酶(cyclin dependent kinase 2，CDK2)结合促进pRB的磷酸化，并与增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期蛋白质依赖激酶抑制因子(CKI)家族基因结合，促进细胞周期G1-S移行的进程，加速细胞的生长、增殖[1]。近年来发现，多种人类肿瘤有cyclin E基因的扩增和过度表达；cyclin E与乳腺癌的预后密切相关[2]，可协同某些癌基因转化细胞和增强细胞的癌变倾向[3]。为了直接探讨cyclin E的表达对人乳腺癌细胞的生长调控及对周期其他相关基因的影响，我们将正、反义cyclin E导入乳腺癌MCF-7细胞系中，对其细胞生物学行为及细胞周期相关基因表达的影响作了观察。
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材料和方法
1.材料：pRC-cyclin E质粒由美国哈佛医学院Arnold博士赠送，lipofectAMINE，G418购自Gibco公司，HindⅢ，T4 DNA连接酶、小牛肠碱性磷酸酶、Wizard DNA质粒提纯试剂盒、RNA体外转录Riboprobe试剂盒购自Promega公司，cyclin E单克隆抗体购自Santa Cruz公司, cyclin D1、 pRB、p27单克隆抗体购自福州迈新公司。人乳腺癌细胞MCF-7由军事医学科学院陆应麟教授惠赠。
2.MCF-7细胞cyclin E表达载体模型的建立：(1)DNA重组：质粒扩增，酶切，DNA连接，大肠杆菌转化参见文献[4]。(2)基因转染：采用Lipofect-AMINE基因转染技术，具体方法参见厂家说明。转染48 h后换含1 000 μg/ml G418的完全培养基筛选阳性克隆，G418持续加压3周。获得转化细胞系分别命名为MCF-7-cyclin E-s(正义)，MCF-7-cyclin E-as(反义)和MCF-7-pcDNA3(空载体)。
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3.Southern blot检测目的基因: 提取基因组DNA 20 μg，按3 μl/μg DNA的量加入限制性内切酶HindⅢ,反应总体积为300～400 μl, 37℃温育12 h。以α-32P标记的1.5 kb cyclin E cDNA片段为探针(Promega公司DNA随机引物标记试剂盒标记)。Southern印迹及杂交方法按常规方法进行。
4.蛋白质免疫印迹检测:培养细胞用PBS缓冲液洗2遍，用自制细胞刮子收集细胞，加入悬浮缓冲液混匀，加等体积的2×十二烷基硫磺酸钠(SDS)上样缓冲液，冰浴30 min，沸水中10 min，10 000 r/min离心 10 min，收集上清。用Lowry法测定蛋白浓度。每个泳道上样量为100 μg。抗体的浓度分别为cyclin E 1∶100、 cyclin D1 1∶20、pRB 1∶100、 p27 1∶20。
5.检测cyclin E基因转染对MCF-7细胞体外生长特性的影响[4，5]：(1)于25 ml培养瓶内接种1×105个对数生长期的细胞，每日计数3瓶细胞，连续8 d，绘制其生长曲线。(2)3H-TdR掺入:于96孔板内接种7.5×103个对数生长期的细胞，孵育箱中培养18 h时后取出，每孔加入18.5 TBq3H-TdR，继续培养6 h，收集细胞于玻璃纤维膜上，测定cpm值。(3)四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定:接种细胞数同3H-TdR掺入，孵育箱培养24 h后取出，每孔加入10 μl MTT(终浓度5 mg/ml)，继续培养4 h，见针状结晶形成，加入200 μl 二甲基亚砜(DMSO)，测570 nm时吸光度(A，曾称光密度OD)值。观察细胞存活情况。(4)软琼脂集落形成：于6孔板内将下层1.2%低熔点琼脂糖与2×DMEM培养基、上层0.7%低熔点琼脂糖与2×DMEM以1∶1混合，内含细胞600个，CO2孵箱内培养10 d。
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6.流式细胞仪分析：取对数生长期的MCF-7细胞，按常规方法收集细胞，固定后于FACScan流式细胞仪(BecTonDICKINSON公司)上检测。
7.统计学处理：样本均数间差异用t检验，周期分布组间差异用χ2检验。
结果
1.MCF-7细胞cyclin E表达模型的建立：(1)用Hind Ⅲ将1.5 kb的cyclin E cDNA片段从质粒pRC-cyclin E上切下，克隆到pcDNA3中的Hind Ⅲ位点，经PstⅠ及Bam HI双酶切鉴定筛选得到含正义及反义cyclin E cDNA 质粒，分别命名为pcDNA3-cyclin E-s和pcDNA3-cyclin E-as，见图1，2。(2)鉴定转染细胞克隆株：Southern blot 基因组DNA经HindⅢ酶切后，转膜后杂交，各组均可见一条5 kb左右的条带，而转染正义及反义组另见一1.5 kb的条带，为外源性插入片段，证明外源基因已整合于细胞染色体中，见图3。Western blot分析转染后cyclin E表达水平，得到cyclin E高、低表达的克隆各1个，见图4。
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图1 重组质粒图
1：λDNA HindⅢ标记物，2：cyclin E质粒，3：正义Pst Ⅰ酶切，4：正义Bam HI酶切，5：反义Bam HI酶切，6：反义PstⅠ酶切，7：cyclin E质粒，8：λDNA HindⅢ标记物
图2 重组质粒鉴定电泳结果
2. cyclin E基因转染对MCF-7细胞体外生长特性的影响：生长速度测定表明，MCF-7-cyclin E-s细胞较对照组MCF-7-pcDNA3快，约为对照组的1.52倍。同样3H-TdR掺入率明显增高，是对照组细胞的4.2倍。MTT测定显示，MCF-7-cyclin E-s细胞的增殖及代谢能力是对照细胞的1.43倍，经检验P<0.05。而MCF-7-cyclin E-as细胞的生长较对照组明显减慢，生长抑制率达17.5%；3H-TdR掺入率降低，仅为对照的48.1%。MTT显示其生长抑制率为18.4%，P均<0.05，结果见图5，表1。说明cyclin E的高表达促进细胞生长及DNA合成，而反义cyclin E则降低细胞增殖，抑制DNA复制。软琼脂集落形成实验中，MCF-7-cyclin E-as所形成的集落较MCF-7-cyclin E-s少，而较MCF-7-pcDNA3多，但经统计学检验差别无显著性意义(表1)。
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1：空载体，2：正义，3：反义
图3 转染细胞Southern杂交结果
1：空载体，2：正义，3：反义
图4 Western blot检测cyclin E结果
表1 3H-TdR掺入值，MTTA值，周期分布及
软琼脂集落形成情况
细胞
3 H-TdR
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掺入值
MTTA值
周期分布(%)
软琼脂集落
形成率
(cpm，%，
±s)
(±s)
G1
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S
G2+
M
(%，±s)
MCF-7-
pcDNA3
2 013±
247
0.174±
0.001
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63.3
31.5
5.1
205.3±
20.4△
MCF-7-
cyclin
E-s
8 526±
485*
0.248±
0.009*
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55.4
38.3
6.3
271.6±
17.0△
MCF-7-
cyclin
E-as
969±
27*
0.142±
0.002*
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69.5
21.8
8.7
243.7±
11.0
注：3个细胞系，重复2次，每次3个孔，共6次，*P<0.05，△P>0.05
图5 MCF-7细胞生长曲线
3.细胞周期的改变(表1)：(1)分析表明，停滞于G1期的MCF-7-cyclin E-as细胞(69.5%)较MCF-7-pcDNA3(63.3%)多，而MCF-7-cyclin E-s细胞(55.4%)则较MCF-7-pcDNA3细胞(63.3%)少，S期细胞相应增多。说明 cyclin E的高表达促进G1到S期的移行，而低表达则抑制这种过渡，但差异无显著性(χ2=7.059，P>0.05)。(2)Cyclin E基因表达对 pRB, p27, cyclin D1蛋白水平的影响：如图6所示，对照组有pRB的表达，当转入cyclin E后，pRB的表达状态及量均受cyclin E表达水平的影响。具体表现为cyclin E表达增高时pRB高磷酸化(ppRB)的状态明显增多(即泳动较慢的条带)，大约是对照组的3倍；而cyclin E表达状态降低时失活状态的非磷酸化的状态增多，而高磷酸化状态略有减少。p27的表达则随着cyclin E的增高或降低而升高或降低(图7)。cyclin D1的表达未见明显的改变，(图8)。
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图6 Western blot检测
pRB的表达结果
图7 Western blot检测p27的表达结果
图8 cyclin D1的Western blot检测结果
讨论
在多种肿瘤中cyclin E有基因扩增及过表达，与乳腺癌的预后关系密切[2]；并与ras共同使鼠纤维母细胞发生恶性转化[3]；转基因鼠可以引起细胞的异常增殖及乳腺癌的发生[6]；cyclin E高表达可加速G1期进程[7]，并可逆转p27引起的G1期阻滞[8]。这些都表明cyclin E可以促进细胞的生长，增殖，并可能通过调节G1期和S期的移行而发挥作用。在本研究中，导入正义cyclin E后MCF-7细胞生长速度、DNA合成及细胞增殖和代谢的能力均明显上升。与此相对应的是G1期细胞数目减少，S期细胞增加。导入反义cyclin E后细胞生长速度、DNA合成及细胞增殖和代谢的能力均下降，G1期细胞数目增多，S期细胞减少。这一结果与以往研究一致，表明cyclin E的高表达促进细胞的生长，而降低cyclin E可以部分延缓细胞的增殖。但是在软琼脂集落形成实验中，cyclin E的表达未能显著影响细胞的停泊依赖性生长，这也可解释cyclin E尚不能使细胞获得完全性自主生长[3]。
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周期蛋白E是G1期重要的周期蛋白，它与CDK2形成复合物，促进pRB磷酸化[9]。实验也同样显示 cyclin E的高表达使pRB磷酸化的形式明显增多，大约是对照组的3倍；而cyclin E的低表达则使pRB的低磷酸化形式增多。说明cyclinE通过对pRB的磷酸化作用影响细胞的生长及周期的进程。
p27为周期蛋白/CDKs复合物的抑制剂，因而抑制细胞周期的演进。但本研究显示cyclin E与p27的表达有一致性，这与cyclin D1与p27的表达的相关性相似：在8个食管癌细胞系中cyclin D1与p27的表达有明显的正相关，并且cyclin D1的转染可增强p27的表达[10]。Pagano M等[11]认为，可能在部分细胞中pRB、cyclin D1和p27之间存在一个稳态正反馈调节通路，并可能与泛素-蛋白酶路径参与p27蛋白的降解有关。
有研究显示cyclin D1可促进cyclin E基因的表达，因其激活子上存在一个与E2F结合的位点[12]，当高表达cyclin D1时促进pRB的失活，解离出的E2F与cyclin E的启动子结合，因而活化cyclin E基因。在本实验中，cyclin E基因转染对cyclin D1未见明显影响。可能两者的作用是单向的，或与实验用细胞系有关。
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我们通过基因转染直接观察了cyclin E基因表达对癌生物学特性的影响，表明上调cyclin E可以通过对pRB的磷酸化的调节而影响细胞周期的进程，从而调节细胞的生长和增殖；并可同时影响p27基因状态。这对于阐明cyclin E基因表达与乳腺癌细胞生物学特性的关系有一定的帮助。
作者单位：黄玫(100083 北京医科大学病理学系)
杨邵敏(100083 北京医科大学病理学系)
通信作者：杨邵敏、廖松林
参考文献
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3 Haas K, Johannes C, Geisen C, et al. Malignant transformation by cyclin E and Ha-Ras correlates with lower sensitivity towards induction of cell death but requires functional Myc and CDK4. Oncogene, 1997,20,15:2615-2623.
4 鄂征. 培养细胞生物学性状检测. 见：鄂征主编，组织培养和分子细胞学技术. 北京：北京出版社,1995. 151-161.
5 韩复生，张霆钧. 抗癌药物耐药性的检测. 见：鄂征主编，组织培养和分子细胞学技术. 北京：北京出版社,1995.434-449.
6 Bortner DM, Rosenberg MP. Induction of mammary gland hyperplasia and carcinomas in transgenic mice expressing human cyclin E. Mol Cell Biol, 1997,17:453-459.
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7 Wimmel A, Lucibello FC, Sewing A, et al. Inducible acceleration of G1 progression through tetracycline-regulated expression of human cyclin E. Oncogene, 1994,9:995-997.
8 Kwon TK, Nordin AA. Overexpression of cyclin E and cyclin-dependent kinase inhibitor p27(kip1) : effect on cell cycle regulation in Hela cell. Biochem Biophys Res Commun, 1997,238:534-538.
9 Sauer K, Lehner CF. The role of cyclin E in the regulation of entry into S phase. Prog Cell Cycle Res, 1995,1:135-139.
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10 Doki Y, Imoto M, Han EK, et al. Increased expression of the p27kip1 protein in human esophageal cancer cell lines that over-express cyclin D1. Carcinogenesis, 1997,18:1139-1148.
11 Pagano M, Tam SW, Theodoras AM, et al. Role of the ubiquitin-proteasome pathway in regulating abundance of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Science, 1995,269:682-685.
12 Ohtani K, DeGregori J, Nevins JR. Regulation of the cyclin E gene by transcription factor E2F. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995,92:12146-12150., 百拇医药
摘 要 目的 观察细胞周期蛋白(cyclin)E的表达对乳腺癌细胞MCF-7生长及其他周期相关基因的影响。方法 构建正义和反义cyclin E cDNA真核表达载体，并采用lipofect AMINE转染，将其导入MCF-7细胞，获得稳定表达正义及反义cyclin E的细胞系，经Southern和Western blot检测有外源性片段的插入及表达；并作细胞生长曲线、四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞计数分析；用Western blot检测其他周期相关基因的表达。结果 cyclin E的高表达可以使细胞的生长速度加快(1.52倍)，DNA合成增加(4.2倍)，G1-S期的移行加速，pRB的磷酸化形式增多(约为对照组的3倍)，但同时也上调p27的表达；而反义cyclin E则有相反的结果，降低cyclin E表达，并使细胞的生长减缓(抑制率为17.5%)，DNA合成下降(48.6%), G1-S期移行减缓；同时pRB的低磷酸化形式增多，并下调p27。结论 cyclin E的表达可以影响乳腺癌MCF-7细胞的生长及增殖，并可能通过pRB的磷酸化而影响细胞周期G1-S期移行，而实现其调节功能。
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关键词：乳腺肿瘤；细胞周期蛋白质类；基因，CDC；转染；肿瘤细胞，培养的
细胞周期蛋白E( cyclin E )是G1期重要的周期蛋白，与细胞周期蛋白质依赖激酶(cyclin dependent kinase 2，CDK2)结合促进pRB的磷酸化，并与增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期蛋白质依赖激酶抑制因子(CKI)家族基因结合，促进细胞周期G1-S移行的进程，加速细胞的生长、增殖[1]。近年来发现，多种人类肿瘤有cyclin E基因的扩增和过度表达；cyclin E与乳腺癌的预后密切相关[2]，可协同某些癌基因转化细胞和增强细胞的癌变倾向[3]。为了直接探讨cyclin E的表达对人乳腺癌细胞的生长调控及对周期其他相关基因的影响，我们将正、反义cyclin E导入乳腺癌MCF-7细胞系中，对其细胞生物学行为及细胞周期相关基因表达的影响作了观察。
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材料和方法
1.材料：pRC-cyclin E质粒由美国哈佛医学院Arnold博士赠送，lipofectAMINE，G418购自Gibco公司，HindⅢ，T4 DNA连接酶、小牛肠碱性磷酸酶、Wizard DNA质粒提纯试剂盒、RNA体外转录Riboprobe试剂盒购自Promega公司，cyclin E单克隆抗体购自Santa Cruz公司, cyclin D1、 pRB、p27单克隆抗体购自福州迈新公司。人乳腺癌细胞MCF-7由军事医学科学院陆应麟教授惠赠。
2.MCF-7细胞cyclin E表达载体模型的建立：(1)DNA重组：质粒扩增，酶切，DNA连接，大肠杆菌转化参见文献[4]。(2)基因转染：采用Lipofect-AMINE基因转染技术，具体方法参见厂家说明。转染48 h后换含1 000 μg/ml G418的完全培养基筛选阳性克隆，G418持续加压3周。获得转化细胞系分别命名为MCF-7-cyclin E-s(正义)，MCF-7-cyclin E-as(反义)和MCF-7-pcDNA3(空载体)。
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3.Southern blot检测目的基因: 提取基因组DNA 20 μg，按3 μl/μg DNA的量加入限制性内切酶HindⅢ,反应总体积为300～400 μl, 37℃温育12 h。以α-32P标记的1.5 kb cyclin E cDNA片段为探针(Promega公司DNA随机引物标记试剂盒标记)。Southern印迹及杂交方法按常规方法进行。
4.蛋白质免疫印迹检测:培养细胞用PBS缓冲液洗2遍，用自制细胞刮子收集细胞，加入悬浮缓冲液混匀，加等体积的2×十二烷基硫磺酸钠(SDS)上样缓冲液，冰浴30 min，沸水中10 min，10 000 r/min离心 10 min，收集上清。用Lowry法测定蛋白浓度。每个泳道上样量为100 μg。抗体的浓度分别为cyclin E 1∶100、 cyclin D1 1∶20、pRB 1∶100、 p27 1∶20。
5.检测cyclin E基因转染对MCF-7细胞体外生长特性的影响[4，5]：(1)于25 ml培养瓶内接种1×105个对数生长期的细胞，每日计数3瓶细胞，连续8 d，绘制其生长曲线。(2)3H-TdR掺入:于96孔板内接种7.5×103个对数生长期的细胞，孵育箱中培养18 h时后取出，每孔加入18.5 TBq3H-TdR，继续培养6 h，收集细胞于玻璃纤维膜上，测定cpm值。(3)四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定:接种细胞数同3H-TdR掺入，孵育箱培养24 h后取出，每孔加入10 μl MTT(终浓度5 mg/ml)，继续培养4 h，见针状结晶形成，加入200 μl 二甲基亚砜(DMSO)，测570 nm时吸光度(A，曾称光密度OD)值。观察细胞存活情况。(4)软琼脂集落形成：于6孔板内将下层1.2%低熔点琼脂糖与2×DMEM培养基、上层0.7%低熔点琼脂糖与2×DMEM以1∶1混合，内含细胞600个，CO2孵箱内培养10 d。
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6.流式细胞仪分析：取对数生长期的MCF-7细胞，按常规方法收集细胞，固定后于FACScan流式细胞仪(BecTonDICKINSON公司)上检测。
7.统计学处理：样本均数间差异用t检验，周期分布组间差异用χ2检验。
结果
1.MCF-7细胞cyclin E表达模型的建立：(1)用Hind Ⅲ将1.5 kb的cyclin E cDNA片段从质粒pRC-cyclin E上切下，克隆到pcDNA3中的Hind Ⅲ位点，经PstⅠ及Bam HI双酶切鉴定筛选得到含正义及反义cyclin E cDNA 质粒，分别命名为pcDNA3-cyclin E-s和pcDNA3-cyclin E-as，见图1，2。(2)鉴定转染细胞克隆株：Southern blot 基因组DNA经HindⅢ酶切后，转膜后杂交，各组均可见一条5 kb左右的条带，而转染正义及反义组另见一1.5 kb的条带，为外源性插入片段，证明外源基因已整合于细胞染色体中，见图3。Western blot分析转染后cyclin E表达水平，得到cyclin E高、低表达的克隆各1个，见图4。
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图1 重组质粒图
1：λDNA HindⅢ标记物，2：cyclin E质粒，3：正义Pst Ⅰ酶切，4：正义Bam HI酶切，5：反义Bam HI酶切，6：反义PstⅠ酶切，7：cyclin E质粒，8：λDNA HindⅢ标记物
图2 重组质粒鉴定电泳结果
2. cyclin E基因转染对MCF-7细胞体外生长特性的影响：生长速度测定表明，MCF-7-cyclin E-s细胞较对照组MCF-7-pcDNA3快，约为对照组的1.52倍。同样3H-TdR掺入率明显增高，是对照组细胞的4.2倍。MTT测定显示，MCF-7-cyclin E-s细胞的增殖及代谢能力是对照细胞的1.43倍，经检验P<0.05。而MCF-7-cyclin E-as细胞的生长较对照组明显减慢，生长抑制率达17.5%；3H-TdR掺入率降低，仅为对照的48.1%。MTT显示其生长抑制率为18.4%，P均<0.05，结果见图5，表1。说明cyclin E的高表达促进细胞生长及DNA合成，而反义cyclin E则降低细胞增殖，抑制DNA复制。软琼脂集落形成实验中，MCF-7-cyclin E-as所形成的集落较MCF-7-cyclin E-s少，而较MCF-7-pcDNA3多，但经统计学检验差别无显著性意义(表1)。
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1：空载体，2：正义，3：反义
图3 转染细胞Southern杂交结果
1：空载体，2：正义，3：反义
图4 Western blot检测cyclin E结果
表1 3H-TdR掺入值，MTTA值，周期分布及
软琼脂集落形成情况
细胞
3 H-TdR
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掺入值
MTTA值
周期分布(%)
软琼脂集落
形成率
(cpm，%，
±s)(
±s)G1
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S
G2+
M
(%，
±s)MCF-7-
pcDNA3
2 013±
247
0.174±
0.001
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63.3
31.5
5.1
205.3±
20.4△
MCF-7-
cyclin
E-s
8 526±
485*
0.248±
0.009*
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55.4
38.3
6.3
271.6±
17.0△
MCF-7-
cyclin
E-as
969±
27*
0.142±
0.002*
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69.5
21.8
8.7
243.7±
11.0
注：3个细胞系，重复2次，每次3个孔，共6次，*P<0.05，△P>0.05
图5 MCF-7细胞生长曲线
3.细胞周期的改变(表1)：(1)分析表明，停滞于G1期的MCF-7-cyclin E-as细胞(69.5%)较MCF-7-pcDNA3(63.3%)多，而MCF-7-cyclin E-s细胞(55.4%)则较MCF-7-pcDNA3细胞(63.3%)少，S期细胞相应增多。说明 cyclin E的高表达促进G1到S期的移行，而低表达则抑制这种过渡，但差异无显著性(χ2=7.059，P>0.05)。(2)Cyclin E基因表达对 pRB, p27, cyclin D1蛋白水平的影响：如图6所示，对照组有pRB的表达，当转入cyclin E后，pRB的表达状态及量均受cyclin E表达水平的影响。具体表现为cyclin E表达增高时pRB高磷酸化(ppRB)的状态明显增多(即泳动较慢的条带)，大约是对照组的3倍；而cyclin E表达状态降低时失活状态的非磷酸化的状态增多，而高磷酸化状态略有减少。p27的表达则随着cyclin E的增高或降低而升高或降低(图7)。cyclin D1的表达未见明显的改变，(图8)。
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图6 Western blot检测
pRB的表达结果
图7 Western blot检测p27的表达结果
图8 cyclin D1的Western blot检测结果
讨论
在多种肿瘤中cyclin E有基因扩增及过表达，与乳腺癌的预后关系密切[2]；并与ras共同使鼠纤维母细胞发生恶性转化[3]；转基因鼠可以引起细胞的异常增殖及乳腺癌的发生[6]；cyclin E高表达可加速G1期进程[7]，并可逆转p27引起的G1期阻滞[8]。这些都表明cyclin E可以促进细胞的生长，增殖，并可能通过调节G1期和S期的移行而发挥作用。在本研究中，导入正义cyclin E后MCF-7细胞生长速度、DNA合成及细胞增殖和代谢的能力均明显上升。与此相对应的是G1期细胞数目减少，S期细胞增加。导入反义cyclin E后细胞生长速度、DNA合成及细胞增殖和代谢的能力均下降，G1期细胞数目增多，S期细胞减少。这一结果与以往研究一致，表明cyclin E的高表达促进细胞的生长，而降低cyclin E可以部分延缓细胞的增殖。但是在软琼脂集落形成实验中，cyclin E的表达未能显著影响细胞的停泊依赖性生长，这也可解释cyclin E尚不能使细胞获得完全性自主生长[3]。
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周期蛋白E是G1期重要的周期蛋白，它与CDK2形成复合物，促进pRB磷酸化[9]。实验也同样显示 cyclin E的高表达使pRB磷酸化的形式明显增多，大约是对照组的3倍；而cyclin E的低表达则使pRB的低磷酸化形式增多。说明cyclinE通过对pRB的磷酸化作用影响细胞的生长及周期的进程。
p27为周期蛋白/CDKs复合物的抑制剂，因而抑制细胞周期的演进。但本研究显示cyclin E与p27的表达有一致性，这与cyclin D1与p27的表达的相关性相似：在8个食管癌细胞系中cyclin D1与p27的表达有明显的正相关，并且cyclin D1的转染可增强p27的表达[10]。Pagano M等[11]认为，可能在部分细胞中pRB、cyclin D1和p27之间存在一个稳态正反馈调节通路，并可能与泛素-蛋白酶路径参与p27蛋白的降解有关。
有研究显示cyclin D1可促进cyclin E基因的表达，因其激活子上存在一个与E2F结合的位点[12]，当高表达cyclin D1时促进pRB的失活，解离出的E2F与cyclin E的启动子结合，因而活化cyclin E基因。在本实验中，cyclin E基因转染对cyclin D1未见明显影响。可能两者的作用是单向的，或与实验用细胞系有关。
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我们通过基因转染直接观察了cyclin E基因表达对癌生物学特性的影响，表明上调cyclin E可以通过对pRB的磷酸化的调节而影响细胞周期的进程，从而调节细胞的生长和增殖；并可同时影响p27基因状态。这对于阐明cyclin E基因表达与乳腺癌细胞生物学特性的关系有一定的帮助。
作者单位：黄玫(100083 北京医科大学病理学系)
杨邵敏(100083 北京医科大学病理学系)
通信作者：杨邵敏、廖松林
参考文献
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