人突变的载脂蛋白E对转基因小鼠学习与记忆能力的影响
人突变的载脂蛋白E对转基因小鼠学习与记忆能力的影响
廖峥嵘 琦祖和 孙明增 杨迪 恽君惕
摘 要 目的 研究突变的人载脂蛋白E(apoE)对大脑皮层功能的影响。方法 以F1代apoE4与apoE7转基因小鼠为研究对象，分别用Southern印迹分析及ELISA检测人apoE基因在F1代小鼠染色体上的整合与在血中的表达；以主动回避实验检测小鼠的学习能力和短期与长期记忆能力的变化，同时用酶法测定F1代小鼠的血脂水平。 结果 (1) 人apoE4和apoE7基因稳定地整合于F1代小鼠染色体上并高效表达于血清中；(2) F1代小鼠血脂升高的同时，apoE4小鼠学习能力与短期记忆能力均显著下降，apoE7小鼠短期记忆能力也下降。结论 人apoE4与apoE7基因过度表达均可使转基因小鼠大脑皮层功能受损害，提示人apoE基因突变可能与apoE4表型一样，也与早老性痴呆的发病有一定关系。
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关键词：人载脂蛋白E；转基因小鼠；学习；记忆
载脂蛋白E(apoE)是调节脂质代谢的重要蛋白质，其表型的多态性不仅与血清脂质水平明显相关[1]，而且apoE4表型与早老性痴呆(Alzheimer′s disease,AD)关系密切。流行病学调查表明，AD患者血清中apoE4的检出率明显升高[2]。体外实验表明apoE4与可溶性的βA4多肽结合，可使其溶解度改变而形成淀粉样蛋白(amyloid)沉积[3]。apoE4可导致tau蛋白的异常磷酸化，从而破坏神经细胞内微管的组装和稳定性，直至形成神经纤维缠结[4，5]。ApoE7是羧基端突变的稀有表型，实验证明它也具有和apoE4相同的致血脂升高的作用[6]，但它与AD或大脑皮层功能损伤的关系尚鲜见报道。欲了解apoE在分子水平发生的变化对神经系统特别是大脑皮层功能的影响，转基因动物是最理想的模型。本组在建立人apoE4与apoE7转基因小鼠模型的基础上，繁殖并筛选出F1代转基因杂合子小鼠，以进一步观察人突变apoE基因的表达对小鼠学习与记忆功能的影响。
, 百拇医药
材料和方法
材料 质粒pME4、pME7由本组提供[7]；内切酶EcoRⅠ、琼脂糖等购自华美、原平等公司；[α-32P]-dCTP购自福瑞公司；血清apoE ELISA试剂盒购自河南医科大学病理生理教研室；血清总胆固醇(TC)与甘油三酯(TG)测定试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司；其它试剂均为国产分析纯。
动物 转基因小鼠(首建鼠，F0代)及经鉴定有人apoE7基因整合与表达的F1代小鼠12只由本组提供。正常昆明小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所饲养场。为使人apoE基因高效表达，在小鼠的饮水中加入20 mmol/L ZnSO4，以诱导增强MT-1启动子活性。
F1代小鼠的繁殖与鉴定 转基因首建鼠F0代与正常昆明小鼠交配后繁殖F1代转基因小鼠。取4周龄仔鼠尾部组织少许，按文献[8]方法提取DNA。pME4或pME7质粒DNA经EcoRⅠ酶解回收2 kb片段，后者经[α-32P]标记后作为探针，用于Southern印迹杂交[9]。有杂交信号的为F1代转基因小鼠。用血清apoE ELISA试剂盒测定小鼠血清apoE水平。用TC、TG试剂盒测定血清TC、TG。
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转基因小鼠学习与记忆行为实验(主动回避实验)[10] 测定装置为11.5 cm×13 cm×9 cm的回避反应箱，箱底为铜栅，可通电流。另在箱内设置一直径3 cm、高4.5 cm的绝缘橡皮圆台作为小鼠回避电击时停留的安全区。实验开始时，先将小鼠放在箱内铜栅上任其自由活动5 min，然后接通电源(30 V)，受到电击后，小鼠逐渐学会跳上圆台，回避电击。以小鼠在圆台上持续停留5 min作为学会的标准，以达标前小鼠错误的次数及受电击时间的总和作为学习训练的成绩。休息15～30 min再给予电击，以5 min内记忆错误次数和受电击时间的总和作为短期记忆测验成绩。24 h后重复上述步骤，作为长期记忆测验成绩。对照组为正常昆明小鼠。
小鼠脑与肝组织胆固醇测定 行为实验结束后，将数量相同的正常小鼠、apoE4和apoE7 3组小鼠分别放血处死，取脑及肝脏冰冻保存。分别称取每只小鼠同等重量的肝、脑组织；并分别将3组相同组织混合后，加入1～2 ml(氯仿∶甲醇=2∶1)溶液，制成匀浆，反复数次，最后定容至10 ml，摇匀，澄清，取1 ml上清液置于60℃水浴蒸干后，按胆固醇测定说明书测定。
, 百拇医药
统计学处理 计数数据用秩和检验，计量数据组间差异的显著性用t检验。
结果和讨论
F1代人apoE4与apoE7转基因小鼠的鉴定 Southern印迹分析显示，F1代小鼠中，得到6只apoE4转基因小鼠，5只apoE7转基因小鼠。Southern印迹分析结果见附图。
附图 人apoE基因的Southern印迹分析
Fig The Southern blot analysis of human apoE gene
1，3：human apoE4 transgenic mice;4,5:human apoE7 transgenic mice;2:human genomic DNA as positive control
, 百拇医药
人apoE4与人apoE7基因在转基因小鼠体内的表达 ELISA测定结果表明，F1代小鼠中，人apoE4和apoE7转基因小鼠血清中表达的人apoE水平分别为对照小鼠的2.3倍与2.0倍(P<0.001)。用ZnSO4诱导后人apoE4与apoE7水平均比诱导前明显上升，差异有显著性(P<0.001)(表1)，说明人apoE基因在小鼠体内表达良好。
表1 转基因小鼠血清中人apoE水平
Table 1 The levels of human apoE in serum of
transgenic mice (±s，mg/L)
Transgenic mice
n
, 百拇医药
Pre-inducement
Post-inducement
apoE4
6
1717±72***
2390±317△△△
apoE7
5
1530±54***
2087±42△△△
Control
, 百拇医药
5
756±83----
t test,*** P<0.001 compared with control;△△△ P<0.001 compared with pre-inducement;----:undetermined
转基因小鼠的高脂血症 以血清TC和TG水平为指标，转基因小鼠血脂明显上升(P<0.001，除apoE7组的TC外)。经ZnSO4诱导后，apoE7组的TC和TG也比诱导前显著上升(P<0.001)(表2)。
表2 转基因小鼠血清TC、TG水平
Table 2 The levels of TC and TG of serum in transgenic mice(±s,mg/L)
, 百拇医药
Groups
n
Pre-inducement
TC TG
Post-inducement
TC TG
apoE4
6
1716±84***
1742±102***--------
apoE7
, 百拇医药 5
733±82
1650±166***
917±117##
2185±284##
Control
2
750±19
450±71--------
t test,*** P<0.001 compared with control; ## P<0.01 compared with pre-inducement;TC:total cholesterol; TG:triglyceride;----：undetermined 转基因小鼠学习与记忆行为的变化 主动回避实验结果显示，apoE4小鼠在学习与短期记忆期，受电击时间较对照组延长，短期记忆发生的错误次数也多(P<0.05)。apoE7小鼠短期忆能力比正常小鼠明显下降(P<0.05)(表3)。
, 百拇医药
表3 人ApoE4与apoE7转基因小鼠的学习、记忆(短期与长期)能力测定结果
Table 3 The active avoidance response test of human apoE4 and apoE7 transgenic mice
Groups
n
Learning score
EN Sh-D(s)
Short term memory
EN Sh-D(s)
Long term memory
, 百拇医药
EN Sh-D(s)
Control
6
3.8±3.3
0.4±0.3
0.5±1.2
0.1±0.1
1.2±1.3
0.1±0.1
apoE4
6
8.0±4.9
, 百拇医药
2.1±2.1*
1.5±1.9*
1.2±1.2*
1.0±1.9
0.2±0.2
Control
12
4.7±4.4
1.5±1.2
0.8±1.6
0.6±0.6
, 百拇医药 1.4±1.8
0.1±0.2
apoE7
12
5.4±2.9
2.6±2.2
2.2±2.1*
0.7±0.9
2.0±2.3
0.4±0.6
Rank sum test, * P<0.05 compared with normal mice;EN:number of error;Sh-D(s)：shock duration(second) apoE4、apoE7小鼠脑组织及肝脏胆固醇水平 将apoE4与apoE7两组小鼠测定结果合并，共同与对照组比较，结果显示，不论是诱导前还是诱导后，转基因小鼠脑组织及肝脏胆固醇水平与正常对照小鼠间差异均无显著性意义(P>0.05)。
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以上结果说明，重组人apoE4与apoE7基因组DNA，在F1代转基因小鼠染色体上已稳定整合并表达了具有生物学功能的物质，从而使小鼠出现高脂血症，同时还出现学习与记忆功能减退，且apoE4与apoE7小鼠表现相似；说明不仅apoE4表型与大脑皮层功能有关，而且apoE基因其它位点发生的突变(如apoE7为244，245Glu-lys)也影响大脑皮层的功能。本研究结果为深入探讨apoE基因突变与AD等脑疾患的关系提供了实验根据。至于本实验中转基因小鼠大脑皮层功能的改变究竟是由于高胆固醇、高甘油三酯所致，还是突变的apoE蛋白质直接发生作用的结果，尚有待探讨。根据apoE基因表达组织专一性的测定(将在另文报道)表明，这两种重组的apoE基因主要在肾脏表达，肝脏与脑表达量极微，本实验结果也显示肝脏与脑组织胆固醇水平无明显变化，提示高血脂可能不是重要因素。但另一方面也应该考虑到，本实验组小鼠为杂合子，较纯合子的基因表达减弱，这也可能是某些指标变化不够突出的原因。
此外，必须说明的是，本组以往曾在测定转基因小鼠血清TC、TG水平的同时，测定了10只正常小鼠(40份样品)血清TC、TG水平，结果显示，正常小鼠血清TC、TG水平较转基因小鼠的明显低下，二者差异有显著性意义(P<0.01)，而且正常小鼠TC、TG水平不受ZnSO4诱导的影响[6,11]。
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廖峥嵘(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
琦祖和(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
孙明增(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
杨迪(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
恽君惕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
参考文献
, 百拇医药 1，Davignon J,Gregg RE,Sing CF.Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis. Arteriosclerosis,1988,8:1-21
2，Strittmgter WJ,Roses AD. Apolipoprotein E and Alzheimer′s disease. Annu Rev Neurosci, 1996,10:53-77
3，Naslund J,Theberg J, Tjernberg LO,et al. Characterization of stable complexes involving apolipoprotein E and the amyloid β-peptide in Alzheimer′sdisease brain. Neuron,1995,15:219-228
4，Ohm TG,Kirca M, Bohl J, et al. Apolipoprotein E polymorphism influences not only cerebral senile plaque load but also Alzheimer-type neurofibrillary tangle formation. Neurosci, 1995,66(3):583-587
, 百拇医药
5，Castano EM,Prelli F, Wisniewski T,et al. Fibrillogenesis in Alzheimer′s disease of amyloid β-peptides and apolipoprotein E. Biochem J, 1995,306:599-604
6，孙明增，琦祖和.人突变apoE基因在转基因小鼠体内的表达及血清脂质变化.中国生物化学与分子生物学报，1998，4(3):334-338
7，琦祖和，汝 昆，孙明增，等.重组人apoE基因表达活性和转基因小鼠研究.生物化学杂志，1997，13(1)：24-28
8，Hogan BL,Constantini F,Lacy E.Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour laboratory. New York: Cold Spring Harbor Press,1986.89
9，萨姆布鲁克，著，金冬雁，译.分子克隆 实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992.12
10，李 巍，张士仪，赵慧敏，等.小鼠脑缺血性学习记忆障碍方法的建立.基础医学与临床，1995，15(6)：46-49
11，孙明增，琦祖和，杨 鹏.人突变apoE基因转基因小鼠的异常表现.中国医学科学院学报，1999，21(6)：497-498, 百拇医药
廖峥嵘 琦祖和 孙明增 杨迪 恽君惕
摘 要 目的 研究突变的人载脂蛋白E(apoE)对大脑皮层功能的影响。方法 以F1代apoE4与apoE7转基因小鼠为研究对象，分别用Southern印迹分析及ELISA检测人apoE基因在F1代小鼠染色体上的整合与在血中的表达；以主动回避实验检测小鼠的学习能力和短期与长期记忆能力的变化，同时用酶法测定F1代小鼠的血脂水平。 结果 (1) 人apoE4和apoE7基因稳定地整合于F1代小鼠染色体上并高效表达于血清中；(2) F1代小鼠血脂升高的同时，apoE4小鼠学习能力与短期记忆能力均显著下降，apoE7小鼠短期记忆能力也下降。结论 人apoE4与apoE7基因过度表达均可使转基因小鼠大脑皮层功能受损害，提示人apoE基因突变可能与apoE4表型一样，也与早老性痴呆的发病有一定关系。
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关键词：人载脂蛋白E；转基因小鼠；学习；记忆
载脂蛋白E(apoE)是调节脂质代谢的重要蛋白质，其表型的多态性不仅与血清脂质水平明显相关[1]，而且apoE4表型与早老性痴呆(Alzheimer′s disease,AD)关系密切。流行病学调查表明，AD患者血清中apoE4的检出率明显升高[2]。体外实验表明apoE4与可溶性的βA4多肽结合，可使其溶解度改变而形成淀粉样蛋白(amyloid)沉积[3]。apoE4可导致tau蛋白的异常磷酸化，从而破坏神经细胞内微管的组装和稳定性，直至形成神经纤维缠结[4，5]。ApoE7是羧基端突变的稀有表型，实验证明它也具有和apoE4相同的致血脂升高的作用[6]，但它与AD或大脑皮层功能损伤的关系尚鲜见报道。欲了解apoE在分子水平发生的变化对神经系统特别是大脑皮层功能的影响，转基因动物是最理想的模型。本组在建立人apoE4与apoE7转基因小鼠模型的基础上，繁殖并筛选出F1代转基因杂合子小鼠，以进一步观察人突变apoE基因的表达对小鼠学习与记忆功能的影响。
, 百拇医药
材料和方法
材料 质粒pME4、pME7由本组提供[7]；内切酶EcoRⅠ、琼脂糖等购自华美、原平等公司；[α-32P]-dCTP购自福瑞公司；血清apoE ELISA试剂盒购自河南医科大学病理生理教研室；血清总胆固醇(TC)与甘油三酯(TG)测定试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司；其它试剂均为国产分析纯。
动物 转基因小鼠(首建鼠，F0代)及经鉴定有人apoE7基因整合与表达的F1代小鼠12只由本组提供。正常昆明小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所饲养场。为使人apoE基因高效表达，在小鼠的饮水中加入20 mmol/L ZnSO4，以诱导增强MT-1启动子活性。
F1代小鼠的繁殖与鉴定 转基因首建鼠F0代与正常昆明小鼠交配后繁殖F1代转基因小鼠。取4周龄仔鼠尾部组织少许，按文献[8]方法提取DNA。pME4或pME7质粒DNA经EcoRⅠ酶解回收2 kb片段，后者经[α-32P]标记后作为探针，用于Southern印迹杂交[9]。有杂交信号的为F1代转基因小鼠。用血清apoE ELISA试剂盒测定小鼠血清apoE水平。用TC、TG试剂盒测定血清TC、TG。
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转基因小鼠学习与记忆行为实验(主动回避实验)[10] 测定装置为11.5 cm×13 cm×9 cm的回避反应箱，箱底为铜栅，可通电流。另在箱内设置一直径3 cm、高4.5 cm的绝缘橡皮圆台作为小鼠回避电击时停留的安全区。实验开始时，先将小鼠放在箱内铜栅上任其自由活动5 min，然后接通电源(30 V)，受到电击后，小鼠逐渐学会跳上圆台，回避电击。以小鼠在圆台上持续停留5 min作为学会的标准，以达标前小鼠错误的次数及受电击时间的总和作为学习训练的成绩。休息15～30 min再给予电击，以5 min内记忆错误次数和受电击时间的总和作为短期记忆测验成绩。24 h后重复上述步骤，作为长期记忆测验成绩。对照组为正常昆明小鼠。
小鼠脑与肝组织胆固醇测定 行为实验结束后，将数量相同的正常小鼠、apoE4和apoE7 3组小鼠分别放血处死，取脑及肝脏冰冻保存。分别称取每只小鼠同等重量的肝、脑组织；并分别将3组相同组织混合后，加入1～2 ml(氯仿∶甲醇=2∶1)溶液，制成匀浆，反复数次，最后定容至10 ml，摇匀，澄清，取1 ml上清液置于60℃水浴蒸干后，按胆固醇测定说明书测定。
, 百拇医药
统计学处理 计数数据用秩和检验，计量数据组间差异的显著性用t检验。
结果和讨论
F1代人apoE4与apoE7转基因小鼠的鉴定 Southern印迹分析显示，F1代小鼠中，得到6只apoE4转基因小鼠，5只apoE7转基因小鼠。Southern印迹分析结果见附图。
附图 人apoE基因的Southern印迹分析
Fig The Southern blot analysis of human apoE gene
1，3：human apoE4 transgenic mice;4,5:human apoE7 transgenic mice;2:human genomic DNA as positive control
, 百拇医药
人apoE4与人apoE7基因在转基因小鼠体内的表达 ELISA测定结果表明，F1代小鼠中，人apoE4和apoE7转基因小鼠血清中表达的人apoE水平分别为对照小鼠的2.3倍与2.0倍(P<0.001)。用ZnSO4诱导后人apoE4与apoE7水平均比诱导前明显上升，差异有显著性(P<0.001)(表1)，说明人apoE基因在小鼠体内表达良好。
表1 转基因小鼠血清中人apoE水平
Table 1 The levels of human apoE in serum of
transgenic mice (±s，mg/L)
Transgenic mice
n
, 百拇医药
Pre-inducement
Post-inducement
apoE4
6
1717±72***
2390±317△△△
apoE7
5
1530±54***
2087±42△△△
Control
, 百拇医药
5
756±83----
t test,*** P<0.001 compared with control;△△△ P<0.001 compared with pre-inducement;----:undetermined
转基因小鼠的高脂血症 以血清TC和TG水平为指标，转基因小鼠血脂明显上升(P<0.001，除apoE7组的TC外)。经ZnSO4诱导后，apoE7组的TC和TG也比诱导前显著上升(P<0.001)(表2)。
表2 转基因小鼠血清TC、TG水平
Table 2 The levels of TC and TG of serum in transgenic mice(±s,mg/L)
, 百拇医药
Groups
n
Pre-inducement
TC TG
Post-inducement
TC TG
apoE4
6
1716±84***
1742±102***--------
apoE7
, 百拇医药 5
733±82
1650±166***
917±117##
2185±284##
Control
2
750±19
450±71--------
t test,*** P<0.001 compared with control; ## P<0.01 compared with pre-inducement;TC:total cholesterol; TG:triglyceride;----：undetermined 转基因小鼠学习与记忆行为的变化 主动回避实验结果显示，apoE4小鼠在学习与短期记忆期，受电击时间较对照组延长，短期记忆发生的错误次数也多(P<0.05)。apoE7小鼠短期忆能力比正常小鼠明显下降(P<0.05)(表3)。
, 百拇医药
表3 人ApoE4与apoE7转基因小鼠的学习、记忆(短期与长期)能力测定结果
Table 3 The active avoidance response test of human apoE4 and apoE7 transgenic mice
Groups
n
Learning score
EN Sh-D(s)
Short term memory
EN Sh-D(s)
Long term memory
, 百拇医药
EN Sh-D(s)
Control
6
3.8±3.3
0.4±0.3
0.5±1.2
0.1±0.1
1.2±1.3
0.1±0.1
apoE4
6
8.0±4.9
, 百拇医药
2.1±2.1*
1.5±1.9*
1.2±1.2*
1.0±1.9
0.2±0.2
Control
12
4.7±4.4
1.5±1.2
0.8±1.6
0.6±0.6
, 百拇医药 1.4±1.8
0.1±0.2
apoE7
12
5.4±2.9
2.6±2.2
2.2±2.1*
0.7±0.9
2.0±2.3
0.4±0.6
Rank sum test, * P<0.05 compared with normal mice;EN:number of error;Sh-D(s)：shock duration(second) apoE4、apoE7小鼠脑组织及肝脏胆固醇水平 将apoE4与apoE7两组小鼠测定结果合并，共同与对照组比较，结果显示，不论是诱导前还是诱导后，转基因小鼠脑组织及肝脏胆固醇水平与正常对照小鼠间差异均无显著性意义(P>0.05)。
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以上结果说明，重组人apoE4与apoE7基因组DNA，在F1代转基因小鼠染色体上已稳定整合并表达了具有生物学功能的物质，从而使小鼠出现高脂血症，同时还出现学习与记忆功能减退，且apoE4与apoE7小鼠表现相似；说明不仅apoE4表型与大脑皮层功能有关，而且apoE基因其它位点发生的突变(如apoE7为244，245Glu-lys)也影响大脑皮层的功能。本研究结果为深入探讨apoE基因突变与AD等脑疾患的关系提供了实验根据。至于本实验中转基因小鼠大脑皮层功能的改变究竟是由于高胆固醇、高甘油三酯所致，还是突变的apoE蛋白质直接发生作用的结果，尚有待探讨。根据apoE基因表达组织专一性的测定(将在另文报道)表明，这两种重组的apoE基因主要在肾脏表达，肝脏与脑表达量极微，本实验结果也显示肝脏与脑组织胆固醇水平无明显变化，提示高血脂可能不是重要因素。但另一方面也应该考虑到，本实验组小鼠为杂合子，较纯合子的基因表达减弱，这也可能是某些指标变化不够突出的原因。
此外，必须说明的是，本组以往曾在测定转基因小鼠血清TC、TG水平的同时，测定了10只正常小鼠(40份样品)血清TC、TG水平，结果显示，正常小鼠血清TC、TG水平较转基因小鼠的明显低下，二者差异有显著性意义(P<0.01)，而且正常小鼠TC、TG水平不受ZnSO4诱导的影响[6,11]。
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廖峥嵘(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
琦祖和(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
孙明增(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
杨迪(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
恽君惕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
参考文献
, 百拇医药 1，Davignon J,Gregg RE,Sing CF.Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis. Arteriosclerosis,1988,8:1-21
2，Strittmgter WJ,Roses AD. Apolipoprotein E and Alzheimer′s disease. Annu Rev Neurosci, 1996,10:53-77
3，Naslund J,Theberg J, Tjernberg LO,et al. Characterization of stable complexes involving apolipoprotein E and the amyloid β-peptide in Alzheimer′sdisease brain. Neuron,1995,15:219-228
4，Ohm TG,Kirca M, Bohl J, et al. Apolipoprotein E polymorphism influences not only cerebral senile plaque load but also Alzheimer-type neurofibrillary tangle formation. Neurosci, 1995,66(3):583-587
, 百拇医药
5，Castano EM,Prelli F, Wisniewski T,et al. Fibrillogenesis in Alzheimer′s disease of amyloid β-peptides and apolipoprotein E. Biochem J, 1995,306:599-604
6，孙明增，琦祖和.人突变apoE基因在转基因小鼠体内的表达及血清脂质变化.中国生物化学与分子生物学报，1998，4(3):334-338
7，琦祖和，汝 昆，孙明增，等.重组人apoE基因表达活性和转基因小鼠研究.生物化学杂志，1997，13(1)：24-28
8，Hogan BL,Constantini F,Lacy E.Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour laboratory. New York: Cold Spring Harbor Press,1986.89
9，萨姆布鲁克，著，金冬雁，译.分子克隆 实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992.12
10，李 巍，张士仪，赵慧敏，等.小鼠脑缺血性学习记忆障碍方法的建立.基础医学与临床，1995，15(6)：46-49
11，孙明增，琦祖和，杨 鹏.人突变apoE基因转基因小鼠的异常表现.中国医学科学院学报，1999，21(6)：497-498, 百拇医药