微丝在碱性成纤维细胞生长因子调节伤口愈合中的作用
微丝在碱性成纤维细胞生长因子调节伤口愈合中的作用
顾海峰 何清濂 林子豪 刘麒 张杏梅
摘 要 目的 探讨微丝在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)调节伤口愈合中的作用。 方法 采用免疫荧光染色、显微荧光光度计及 3 H-TdR掺入法研究bFGF诱导的成纤维细胞微丝骨架的变化，观察用细胞松弛素B破坏微丝后，bFGF对细胞运动及细胞增殖的影响。 结果 bFGF使成纤维细胞微丝骨架发生有序的变化；使F-肌动蛋白(F-actin)含量增高，并呈一定的时间-剂量依赖关系。用细胞松弛素B破坏微丝，可明显抑制由bFGF 引起的细胞向创面的迁移,同时也显著抑制了bFGF引起的成纤维细胞 3 H-TdR掺入量。 结论 bFGF可通过微丝骨架的变化影响创伤愈合过程中细胞的迁移、分化和增殖。
关键词：细胞骨架；成纤维细胞生长因子，碱性；细胞外基质；创伤愈合
, 百拇医药
细胞生长因子可调节伤口愈合的许多重要过程，但生长因子参与调节伤口愈合过程的生物学机制尚不清楚。研究表明，细胞的许多功能如趋化、细胞运动和增殖都是通过细胞骨架介导或依赖细胞骨架功能的[1]。因此，推测细胞骨架系统可能直接或间接参与生长因子的调节。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是成纤维细胞生长因子家族成员之一，是成纤维细胞和血管内皮细胞有效的有丝分裂因子和趋化因子，在伤口愈合过程中起着重要作用[2]。为研究微丝骨架功能对bFGF生物作用的影响，笔者以培养成纤维细胞为靶细胞，观察bFGF引起的成纤维细胞骨架的变化，并对F-肌动蛋白作定量分析，观察阻断微丝功能后，对bFGF在调节细胞运动和细胞增殖中的影响。
材料与方法
1. 成纤维细胞的培养和创伤模型的建立：成纤维细胞源自皮肤瘢痕组织。采用组织块培养法，加入含体积分数为15%的胎牛血清的DMEM培养基(Gibco 公司，美国)，于37℃在体积分数为5%的CO2孵箱内培养，每2～3 d换液1次，取4～7代细胞作实验用。参照文献[3]，将细胞接种在含盖玻片的24孔培养板内，生长汇合成单层细胞后，去除盖玻片中央1.5 mm细胞，制成创面。用装有网格测微计的倒置相差显微镜观测创面闭合速度，并用下列公式计算某时刻创面闭合指数。创缘间距离取3处不同点测量，至少重复3次实验。
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2. 微丝的荧光染色：参照Barak等[4]方法。盖玻片以PBS冲洗3次×3 min，加质量浓度为40 g/L的多聚甲醛+TritonX-100固定10 min，0.1 mmol/L甘氨酸处理10 min，加Rhodamine-phalloidin (Molicular Probes 1∶20)染色40 min，PBS冲洗3次×3 min，加甘油/PBS(1∶1)封片，荧光显微镜观察。
3. F-肌动蛋白(F-actin)的定量分析：细胞以0.2×105/孔浓度接种于24孔板，培养至汇合后分组。第1组每孔加50 ng/ml bFGF(珠海东大生物制药有限公司)，分别在5，10，15，30，45，60和90 min时将微丝固定。第2组每孔分别加入浓度为0.1，1.0，5.0，10，50，100和200 ng/ml的bFGF，作用30 min后固定微丝。对照组加等量PBS。微丝固定后加rhodamine-phalloidin染色40 min(暗处)，PBS洗脱多余的rhodamine-phalloidin。然后每孔加1.5 ml甲醇，置暗处40 min，移取甲醇，于荧光分光光度计测量细胞内rhodamine-phalloidin荧光强度(激发光波长540 nm，发射光波长560 nm)。数据以对照组的百分率表示。每种浓度每时相复设3孔，重复3次。
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4. 创面闭合测定：实验分两组，第1组在损伤即刻每孔分别加入50 ng/ml bFGF，对照孔只加等量PBS。第2组在损伤前1 h每孔加1.0 μg/ml细胞松弛素B(Sigma公司，美国)，其余处理同第1组。分别测定损伤后24 h创面闭合指数.每种浓度每时相复设3孔，重复3次。
5. 细胞增殖测定：细胞接种至24孔板，生长至汇合后，换无血清DMEM培养24 h分组。 第1组在损伤即刻每孔分别加入50 ng/ml bFGF，对照孔只加等量PBS。第2组在损伤前1 h每孔加1.0 μg/ml细胞松弛素B，其余处理同第1组。于损伤后24 h收集样本，收集前4 h每孔分别加37 kBq(1.0 μCi)3H-TdR(上海原子能研究所)，自动液闪记录仪测定样本每分钟脉冲数。每种浓度每时相复设3孔，重复3次。
6. 统计学处理：以方差分析及t检验作统计学分析。
结 果
, 百拇医药
1. 细胞形态改变：生长汇合成单层的成纤维细胞为菱形，细胞呈紧密接触。此时微丝骨架大部分以张力纤维形态分布在细胞外周及细胞间黏着处，中央微丝束较少，细胞间黏着较密集。而50 ng/ml bFGF作用30 min时，细胞大多呈伸展、游走状态，此时中央微丝束明显增多，外周张力纤维相应减少，细胞间黏着减少。
2. F-肌动蛋白定量分析结果：当以不同浓度bFGF作用时，随着浓度升高，F-actin含量也逐渐升高，其峰值浓度在50～100 ng/ml。使F-actin含量有明显变化的最低浓度为0.1 ng/ml bFGF(P<0.05)(图1)。当以50 ng/ml bFGF作用5 min时，F-actin即有明显升高(P<0.05)，至30 min时达峰值，随后逐渐下降，但仍高于对照组(P<0.05)(图2)。
3. 微丝功能对创面闭合的影响：损伤后24 h，应用bFGF组的创面闭合指数显著升高(P<0.05)，而用细胞松弛素B使微丝解聚后，创面闭合指数则明显下降(P<0.05)(图3)。说明bFGF能加快创面闭合速度，而细胞松弛素B则能抑制这种作用。
, 百拇医药
图1 bFGF作用后成纤维细胞F-actin的浓度反应曲线
图2 bFGF作用后成纤维细胞F-actin含量的时间反应曲线
与对照组比较：*P<0.05；
与细胞松弛素B 0 μg/ml组比较：△P<0.05
图3 细胞松弛素B对bFGF促创面愈合作用的影响
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4. 细胞增殖测定：加入bFGF处理的细胞的3 H-TdR掺入量显著增高(P<0.05)，而细胞松弛素B则明显降低了相应组细胞的3H-TdR掺入量(P<0.05)(图4)。说明细胞松弛素B可抑制bFGF的促细胞增殖作用。
与细胞松弛素B 0 μg/ml组比较：△P<0.05；
与对照组比较：*P<0.05
图4 细胞松弛素B对bFGF的细胞增殖作用的影响
讨 论
, 百拇医药
伤口愈合是有多种细胞活动参与的有序的反应过程，包括急性和慢性炎症，细胞迁移，有丝分裂和基质成分的沉积。 许多因素对愈合过程中各种细胞活动都有调节作用，如细胞间相互作用，细胞与基质的黏附，细胞生长因子和细胞外基质成分及其他调节因子等。尤其是细胞生长因子，如转化生长因子(TGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、白细胞介素-1(IL-1)等在伤口愈合过程的调节中起重要作用[5，6]。 目前，对生长因子在伤口愈合中的调节机制尚不清楚。研究表明， 愈合过程中细胞的迁移、分化和增殖都伴随着细胞骨架系统的明显变化[1，7]。细胞骨架的变化结果又能影响细胞与细胞、 细胞与基质的相互作用[8]，从而引起细胞活动和功能的改变。因此，细胞骨架系统可能参与对生长因子的调节。本实验结果证实，外源性bFGF可以引起成纤维细胞微丝骨架的明显变化，并呈一定的时间和剂量依赖关系。当用细胞松弛素B使微丝解聚时，可明显抑制bFGF促伤口闭合及细胞增殖作用。
, 百拇医药
细胞生长因子与细胞间及细胞外基质的相互作用，借助细胞表面的整合素与细胞外基质和细胞骨架相连接，整合素可通过旁路途径传导损伤刺激信号并触发细胞因子受体[8]，从而通过跨膜效应将信号传至细胞膜内侧的微丝或微管系统，再传导至细胞核并启动DNA合成，从而调节细胞的运动、分裂和识别。笔者观察到外源性bFGF引起成纤维细胞周围微丝纤维减少，中央微丝束增多，而细胞间黏着减少，使细胞黏附力下降，有利于细胞的伸展和游走。F-actin含量的增多可能有助于提供化学机械动力，这一过程需ATP、Ca2+、Mg2+的参与。当用细胞松弛素破坏微丝系统使细胞迁移受抑制时，细胞增殖就成为主要的、持续完成修复的方式，尽管其修复速度减慢。另外，细胞内的信息也可通过细胞骨架系统逆向传至细胞外，形成从内到外的信息传导方式。有研究表明，膜受体被细胞因子等可溶性因子占据以及膜蛋白与细胞外基质相互作用可影响细胞内微丝及微管系统的结构变化，继而引起细胞表面各种受体的重新分布和展现，某些情况下也控制其反应性。研究表明，在生长因子诱导的微丝变化中，三磷酸鸟苷(GTP)酶激活蛋白被认为是介导旁路信号传导的重要成员[9]。用细胞松弛素可以阻断CD11a/CD18介导的细胞黏附及游走，表明微丝骨架的重排以及整合素与细胞骨架相互作用可通过后受体效应调节细胞的功能[10]。总之，伤口愈合的调节十分复杂且有多因素参与。本研究结果表明，bFGF对成纤维细胞的运动及增殖的调节是与微丝骨架功能相关的。愈合过程中，微丝骨架系统可能直接或间接参与对生长因子的生物学调控。
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顾海峰(200052 上海，解放军第八十五医院整形外科)
张杏梅(200052 上海，解放军第八十五医院整形外科)
何清濂(上海第二军医大学附属长征医院整形外科)
林子豪(上海第二军医大学附属长征医院整形外科)
刘麒(上海第二军医大学附属长征医院整形外科)
参考文献
1，Desmouliere A, Gabbiani G. Modulation of fibroblastic cytoskeletal features during pathological situations: the role of extracellular matrix and cytokines. Cell Motil Cytoskeleton, 1994， 29:195-203.
, 百拇医药
2，Basilica C, Moscatollic D. The bFGF family of growth factors and oncogenes. Adv Cancer Res, 1992， 59:115-121.
3，Burk RR. A factor from a transformed cell line that affects migration.Proc Natl Acad Sci USA, 1973， 70:369-377.
4，Barak LS,Yocum RR,Nothnagel EA, et al. Fluorescence staining of the acting cytoskeleton in living cells with 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole-phalloidin. Proc Natl Acad Sci USA,1980， 77:980-988.
, http://www.100md.com
5，Knighto DR, Ficgel VD. Macrophage derived growth factors in wound healing. Regulation of growth factor production by oxygen microenvironment. Am Rev Respir Dis,1989， 140:1108-1117.
6，Nathan C, Sporn M. Cytokines in context. J Cell Biol, 1991， 113:981-995.
7，Gotlieb AI, Langille BL, Wong MKK, et al. Structure and function of the endothelial cytoskeleton. Lab Invest,1991， 65:123-145.
8，Gailit J, Clark RA. Wound repair in the context of extracellular matrix. Curr Opin Cell Biol, 1994， 6:717-722.
, 百拇医药
9，Herrera R, Shivers BD. Expression of α 1-chimaerin (rac-1 GAP) alters the cytoskelelal and adhesive properties of fibroblasts. J Cell Biochem, 1994， 56:582-598.
10，Peter K, O'Toole TE. Modulation of cell adhesion by changes in α 1 beta 2(LFA-1, CD11a/CD18) cytoplasmic domain/cytoskeleton interaction. J Exp Med, 1995， 181:815-826., 百拇医药
顾海峰 何清濂 林子豪 刘麒 张杏梅
摘 要 目的 探讨微丝在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)调节伤口愈合中的作用。 方法 采用免疫荧光染色、显微荧光光度计及 3 H-TdR掺入法研究bFGF诱导的成纤维细胞微丝骨架的变化，观察用细胞松弛素B破坏微丝后，bFGF对细胞运动及细胞增殖的影响。 结果 bFGF使成纤维细胞微丝骨架发生有序的变化；使F-肌动蛋白(F-actin)含量增高，并呈一定的时间-剂量依赖关系。用细胞松弛素B破坏微丝，可明显抑制由bFGF 引起的细胞向创面的迁移,同时也显著抑制了bFGF引起的成纤维细胞 3 H-TdR掺入量。 结论 bFGF可通过微丝骨架的变化影响创伤愈合过程中细胞的迁移、分化和增殖。
关键词：细胞骨架；成纤维细胞生长因子，碱性；细胞外基质；创伤愈合
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细胞生长因子可调节伤口愈合的许多重要过程，但生长因子参与调节伤口愈合过程的生物学机制尚不清楚。研究表明，细胞的许多功能如趋化、细胞运动和增殖都是通过细胞骨架介导或依赖细胞骨架功能的[1]。因此，推测细胞骨架系统可能直接或间接参与生长因子的调节。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是成纤维细胞生长因子家族成员之一，是成纤维细胞和血管内皮细胞有效的有丝分裂因子和趋化因子，在伤口愈合过程中起着重要作用[2]。为研究微丝骨架功能对bFGF生物作用的影响，笔者以培养成纤维细胞为靶细胞，观察bFGF引起的成纤维细胞骨架的变化，并对F-肌动蛋白作定量分析，观察阻断微丝功能后，对bFGF在调节细胞运动和细胞增殖中的影响。
材料与方法
1. 成纤维细胞的培养和创伤模型的建立：成纤维细胞源自皮肤瘢痕组织。采用组织块培养法，加入含体积分数为15%的胎牛血清的DMEM培养基(Gibco 公司，美国)，于37℃在体积分数为5%的CO2孵箱内培养，每2～3 d换液1次，取4～7代细胞作实验用。参照文献[3]，将细胞接种在含盖玻片的24孔培养板内，生长汇合成单层细胞后，去除盖玻片中央1.5 mm细胞，制成创面。用装有网格测微计的倒置相差显微镜观测创面闭合速度，并用下列公式计算某时刻创面闭合指数。创缘间距离取3处不同点测量，至少重复3次实验。
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2. 微丝的荧光染色：参照Barak等[4]方法。盖玻片以PBS冲洗3次×3 min，加质量浓度为40 g/L的多聚甲醛+TritonX-100固定10 min，0.1 mmol/L甘氨酸处理10 min，加Rhodamine-phalloidin (Molicular Probes 1∶20)染色40 min，PBS冲洗3次×3 min，加甘油/PBS(1∶1)封片，荧光显微镜观察。
3. F-肌动蛋白(F-actin)的定量分析：细胞以0.2×105/孔浓度接种于24孔板，培养至汇合后分组。第1组每孔加50 ng/ml bFGF(珠海东大生物制药有限公司)，分别在5，10，15，30，45，60和90 min时将微丝固定。第2组每孔分别加入浓度为0.1，1.0，5.0，10，50，100和200 ng/ml的bFGF，作用30 min后固定微丝。对照组加等量PBS。微丝固定后加rhodamine-phalloidin染色40 min(暗处)，PBS洗脱多余的rhodamine-phalloidin。然后每孔加1.5 ml甲醇，置暗处40 min，移取甲醇，于荧光分光光度计测量细胞内rhodamine-phalloidin荧光强度(激发光波长540 nm，发射光波长560 nm)。数据以对照组的百分率表示。每种浓度每时相复设3孔，重复3次。
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4. 创面闭合测定：实验分两组，第1组在损伤即刻每孔分别加入50 ng/ml bFGF，对照孔只加等量PBS。第2组在损伤前1 h每孔加1.0 μg/ml细胞松弛素B(Sigma公司，美国)，其余处理同第1组。分别测定损伤后24 h创面闭合指数.每种浓度每时相复设3孔，重复3次。
5. 细胞增殖测定：细胞接种至24孔板，生长至汇合后，换无血清DMEM培养24 h分组。 第1组在损伤即刻每孔分别加入50 ng/ml bFGF，对照孔只加等量PBS。第2组在损伤前1 h每孔加1.0 μg/ml细胞松弛素B，其余处理同第1组。于损伤后24 h收集样本，收集前4 h每孔分别加37 kBq(1.0 μCi)3H-TdR(上海原子能研究所)，自动液闪记录仪测定样本每分钟脉冲数。每种浓度每时相复设3孔，重复3次。
6. 统计学处理：以方差分析及t检验作统计学分析。
结 果
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1. 细胞形态改变：生长汇合成单层的成纤维细胞为菱形，细胞呈紧密接触。此时微丝骨架大部分以张力纤维形态分布在细胞外周及细胞间黏着处，中央微丝束较少，细胞间黏着较密集。而50 ng/ml bFGF作用30 min时，细胞大多呈伸展、游走状态，此时中央微丝束明显增多，外周张力纤维相应减少，细胞间黏着减少。
2. F-肌动蛋白定量分析结果：当以不同浓度bFGF作用时，随着浓度升高，F-actin含量也逐渐升高，其峰值浓度在50～100 ng/ml。使F-actin含量有明显变化的最低浓度为0.1 ng/ml bFGF(P<0.05)(图1)。当以50 ng/ml bFGF作用5 min时，F-actin即有明显升高(P<0.05)，至30 min时达峰值，随后逐渐下降，但仍高于对照组(P<0.05)(图2)。
3. 微丝功能对创面闭合的影响：损伤后24 h，应用bFGF组的创面闭合指数显著升高(P<0.05)，而用细胞松弛素B使微丝解聚后，创面闭合指数则明显下降(P<0.05)(图3)。说明bFGF能加快创面闭合速度，而细胞松弛素B则能抑制这种作用。
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图1 bFGF作用后成纤维细胞F-actin的浓度反应曲线
图2 bFGF作用后成纤维细胞F-actin含量的时间反应曲线
与对照组比较：*P<0.05；
与细胞松弛素B 0 μg/ml组比较：△P<0.05
图3 细胞松弛素B对bFGF促创面愈合作用的影响
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4. 细胞增殖测定：加入bFGF处理的细胞的3 H-TdR掺入量显著增高(P<0.05)，而细胞松弛素B则明显降低了相应组细胞的3H-TdR掺入量(P<0.05)(图4)。说明细胞松弛素B可抑制bFGF的促细胞增殖作用。
与细胞松弛素B 0 μg/ml组比较：△P<0.05；
与对照组比较：*P<0.05
图4 细胞松弛素B对bFGF的细胞增殖作用的影响
讨 论
, 百拇医药
伤口愈合是有多种细胞活动参与的有序的反应过程，包括急性和慢性炎症，细胞迁移，有丝分裂和基质成分的沉积。 许多因素对愈合过程中各种细胞活动都有调节作用，如细胞间相互作用，细胞与基质的黏附，细胞生长因子和细胞外基质成分及其他调节因子等。尤其是细胞生长因子，如转化生长因子(TGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、白细胞介素-1(IL-1)等在伤口愈合过程的调节中起重要作用[5，6]。 目前，对生长因子在伤口愈合中的调节机制尚不清楚。研究表明， 愈合过程中细胞的迁移、分化和增殖都伴随着细胞骨架系统的明显变化[1，7]。细胞骨架的变化结果又能影响细胞与细胞、 细胞与基质的相互作用[8]，从而引起细胞活动和功能的改变。因此，细胞骨架系统可能参与对生长因子的调节。本实验结果证实，外源性bFGF可以引起成纤维细胞微丝骨架的明显变化，并呈一定的时间和剂量依赖关系。当用细胞松弛素B使微丝解聚时，可明显抑制bFGF促伤口闭合及细胞增殖作用。
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细胞生长因子与细胞间及细胞外基质的相互作用，借助细胞表面的整合素与细胞外基质和细胞骨架相连接，整合素可通过旁路途径传导损伤刺激信号并触发细胞因子受体[8]，从而通过跨膜效应将信号传至细胞膜内侧的微丝或微管系统，再传导至细胞核并启动DNA合成，从而调节细胞的运动、分裂和识别。笔者观察到外源性bFGF引起成纤维细胞周围微丝纤维减少，中央微丝束增多，而细胞间黏着减少，使细胞黏附力下降，有利于细胞的伸展和游走。F-actin含量的增多可能有助于提供化学机械动力，这一过程需ATP、Ca2+、Mg2+的参与。当用细胞松弛素破坏微丝系统使细胞迁移受抑制时，细胞增殖就成为主要的、持续完成修复的方式，尽管其修复速度减慢。另外，细胞内的信息也可通过细胞骨架系统逆向传至细胞外，形成从内到外的信息传导方式。有研究表明，膜受体被细胞因子等可溶性因子占据以及膜蛋白与细胞外基质相互作用可影响细胞内微丝及微管系统的结构变化，继而引起细胞表面各种受体的重新分布和展现，某些情况下也控制其反应性。研究表明，在生长因子诱导的微丝变化中，三磷酸鸟苷(GTP)酶激活蛋白被认为是介导旁路信号传导的重要成员[9]。用细胞松弛素可以阻断CD11a/CD18介导的细胞黏附及游走，表明微丝骨架的重排以及整合素与细胞骨架相互作用可通过后受体效应调节细胞的功能[10]。总之，伤口愈合的调节十分复杂且有多因素参与。本研究结果表明，bFGF对成纤维细胞的运动及增殖的调节是与微丝骨架功能相关的。愈合过程中，微丝骨架系统可能直接或间接参与对生长因子的生物学调控。
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顾海峰(200052 上海，解放军第八十五医院整形外科)
张杏梅(200052 上海，解放军第八十五医院整形外科)
何清濂(上海第二军医大学附属长征医院整形外科)
林子豪(上海第二军医大学附属长征医院整形外科)
刘麒(上海第二军医大学附属长征医院整形外科)
参考文献
1，Desmouliere A, Gabbiani G. Modulation of fibroblastic cytoskeletal features during pathological situations: the role of extracellular matrix and cytokines. Cell Motil Cytoskeleton, 1994， 29:195-203.
, 百拇医药
2，Basilica C, Moscatollic D. The bFGF family of growth factors and oncogenes. Adv Cancer Res, 1992， 59:115-121.
3，Burk RR. A factor from a transformed cell line that affects migration.Proc Natl Acad Sci USA, 1973， 70:369-377.
4，Barak LS,Yocum RR,Nothnagel EA, et al. Fluorescence staining of the acting cytoskeleton in living cells with 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole-phalloidin. Proc Natl Acad Sci USA,1980， 77:980-988.
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5，Knighto DR, Ficgel VD. Macrophage derived growth factors in wound healing. Regulation of growth factor production by oxygen microenvironment. Am Rev Respir Dis,1989， 140:1108-1117.
6，Nathan C, Sporn M. Cytokines in context. J Cell Biol, 1991， 113:981-995.
7，Gotlieb AI, Langille BL, Wong MKK, et al. Structure and function of the endothelial cytoskeleton. Lab Invest,1991， 65:123-145.
8，Gailit J, Clark RA. Wound repair in the context of extracellular matrix. Curr Opin Cell Biol, 1994， 6:717-722.
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9，Herrera R, Shivers BD. Expression of α 1-chimaerin (rac-1 GAP) alters the cytoskelelal and adhesive properties of fibroblasts. J Cell Biochem, 1994， 56:582-598.
10，Peter K, O'Toole TE. Modulation of cell adhesion by changes in α 1 beta 2(LFA-1, CD11a/CD18) cytoplasmic domain/cytoskeleton interaction. J Exp Med, 1995， 181:815-826., 百拇医药