严重烫伤大鼠骨骼肌泛素基因表达的变化
严重烫伤大鼠骨骼肌泛素基因表达的变化
谭银玲 董燕麟
关键词；烫伤；大鼠；骨骼肌；泛素 烧伤后机体蛋白质分解代谢增强，超过合成代谢，造成负氮平衡。本室研究表明，依赖三磷酸腺苷及泛素的26S蛋白酶复合体(ATP-ubiquitin-26S proteasome)系统为烫伤后骨骼肌蛋白质降解的主要途径[1]，且烫伤后泛素含量呈明显的进行性增加。笔者拟应用皮肤全层烫伤大鼠模型观察多聚泛素mRNA水平的变化，以探讨骨骼肌泛素基因表达的变化与蛋白质代谢的相关性。
一、材料与方法
1.实验动物：雄性健康Wistar大鼠40只，体重(150±20) g，本校动物所提供。
2.动物分组及处理:随机分为正常对照组及烫伤后第1，2，3天组共4组，每组10只。烫伤组大鼠用乙醚吸入麻醉后，剪去背部和一侧后肢的毛。将背部(占体表总面积的30%)置于90℃热水中7 s，将一侧后肢置于上述热水中3 s。
, http://www.100md.com
3.比目鱼肌中泛素的mRNA测定(DNA-RNA杂交法，即Northern Blot): 扩增多聚泛素质粒pRB130[以pUC19为基础构建，含有3个编码泛素的重复序列和3'端的335 bp(由Australian National University的Dr.Rohan Baker惠赠)]，制备探针，相关操作见《分子克隆实验指南》。
4. 统计学处理：对采用SPSS软件包进行单因素方差分析及t检验，数据以±s表示。
二、结果
Northern Blot杂交后吸光度扫描结果见表1。烫伤后第1，2，3天伤肢泛素 mRNA含量分别比对照组增加了90.7%、124.9%、168.0%，差异有显著性意义；同时相伤肢mRNA水平比未伤肢分别增加了36.7%、25.1%、22.5%，差异有显著性意义。烫伤后第1，2，3天未伤肢泛素 mRNA含量也分别比对照组增加了39.4%、79.7%、118.7%，差异具有显著性意义。
, 百拇医药
表1 严重烫伤大鼠骨骼肌多聚泛素mRNA水平(arbitary unit/μg RNA， ±s)
组别
鼠数
未伤肢
伤肢
烫伤后第1天
10
3.108±0.28*
4.250±0.32*△
烫伤后第2天
10
, 百拇医药
4.005±0.31*
5.011±0.41*△
烫伤后第3天
10
4.875±0.40*
5.972±0.54*△
注：对照组多聚泛素mRNA为(2.228±0.26) arbitary unit/μg RNA。与对照组比较：*P<0.05； 与未伤肢比较：△P<0.05 三、讨论
真核细胞中存在多种蛋白质降解途径，包括溶酶体组织蛋白酶途径、依赖Ca2+的中性蛋白酶途径、不依赖ATP的蛋白酶途径及依赖ATP-ubiquitin-26S proteasome途径。有研究表明,骨骼肌中也存在该ATP-ubiquitin-26S proteasome途径。而该途径作用的前提条件是底物蛋白与多聚泛素结合，进而提呈给26S蛋白酶复合体降解。本室的研究表明,烫伤后骨骼肌蛋白质降解增加也主要是通过该途径进行的,且泛素含量呈明显的进行性增加。
, 百拇医药
编码泛素的基因有两种，即多聚泛素基因和融合基因(即编码单个泛素的基因)。在一般生理条件下，这两种基因均存在于细胞内。但在应激情况下，多聚泛素基因被大量激活，其mRNA所产生的多聚泛素，较之于多个基因分别产生泛素更为经济和迅速，这样可以减少代谢的繁琐，更好地适应应激过程。此外，与底物蛋白结合并介导底物降解的泛素是多聚泛素，所以，多聚泛素基因的表达更有利于蛋白质分解代谢的需要。本实验结果显示，烫伤后骨骼肌蛋白质降解加强的同时，其多聚泛素mRNA水平呈明显的进行性增加，说明烫伤反应可激活多聚泛素基因的表达，这与本室观察到的烫伤后泛素含量显著增加的结果一致。
但有关该途径在烫伤后被激活的原因和机制还不清楚。创伤、炎症等刺激可使炎症细胞产生TNF、IL-1、IL-6等细胞因子，这些因子能作用于多种器官，刺激糖皮质激素和胰高血糖素的产生，并与它们协调作用，对骨骼肌蛋白质降解产生影响。本室的研究证明，TNF、IL-1均可加强烫伤后骨骼肌中蛋白质的降解，且对烫伤局部比对远隔部位影响更大。Garcia-Martinez等[2]报告，TNF-α可促进泛素基因表达及泛素结合物水平升高。Wing等[3]认为，依赖ATP-ubiquitin-26S proteasome系统对骨骼肌蛋白质的降解是通过糖皮质激素介导的。但烧伤后TNF和糖皮质激素对ATP-ubiquitin-26S proteasome系统的作用尚不清楚，需进一步研究。
, 百拇医药
作者单位：谭银玲(400038 重庆，第三军医大学生化教研室)
董燕麟(400038 重庆，第三军医大学生化教研室)
参考文献
1，谭银玲, 董燕麟.严重烫伤大鼠骨骼肌蛋白质降解途径及泛素作用的研究.中华创伤杂志， 1998，14：384-386.
2，Garcia-Martinez C,Agell N,Lovera M,et al.TNF-α increases the ubiquitinazation of rat skeletal muscle protein.FEBS,1993,323:211-214.
3，Wing SS,Hass AL,Goldberg AL.Increase in ubiquitin-protein conjugates concomitant with the increase in proteolysis in rat skeletal muscle during starvation and atrophy denervation.Biochem J, 1995,307:639-645., 百拇医药
谭银玲 董燕麟
关键词；烫伤；大鼠；骨骼肌；泛素 烧伤后机体蛋白质分解代谢增强，超过合成代谢，造成负氮平衡。本室研究表明，依赖三磷酸腺苷及泛素的26S蛋白酶复合体(ATP-ubiquitin-26S proteasome)系统为烫伤后骨骼肌蛋白质降解的主要途径[1]，且烫伤后泛素含量呈明显的进行性增加。笔者拟应用皮肤全层烫伤大鼠模型观察多聚泛素mRNA水平的变化，以探讨骨骼肌泛素基因表达的变化与蛋白质代谢的相关性。
一、材料与方法
1.实验动物：雄性健康Wistar大鼠40只，体重(150±20) g，本校动物所提供。
2.动物分组及处理:随机分为正常对照组及烫伤后第1，2，3天组共4组，每组10只。烫伤组大鼠用乙醚吸入麻醉后，剪去背部和一侧后肢的毛。将背部(占体表总面积的30%)置于90℃热水中7 s，将一侧后肢置于上述热水中3 s。
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3.比目鱼肌中泛素的mRNA测定(DNA-RNA杂交法，即Northern Blot): 扩增多聚泛素质粒pRB130[以pUC19为基础构建，含有3个编码泛素的重复序列和3'端的335 bp(由Australian National University的Dr.Rohan Baker惠赠)]，制备探针，相关操作见《分子克隆实验指南》。
4. 统计学处理：对采用SPSS软件包进行单因素方差分析及t检验，数据以±s表示。
二、结果
Northern Blot杂交后吸光度扫描结果见表1。烫伤后第1，2，3天伤肢泛素 mRNA含量分别比对照组增加了90.7%、124.9%、168.0%，差异有显著性意义；同时相伤肢mRNA水平比未伤肢分别增加了36.7%、25.1%、22.5%，差异有显著性意义。烫伤后第1，2，3天未伤肢泛素 mRNA含量也分别比对照组增加了39.4%、79.7%、118.7%，差异具有显著性意义。
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表1 严重烫伤大鼠骨骼肌多聚泛素mRNA水平(arbitary unit/μg RNA， ±s)
组别
鼠数
未伤肢
伤肢
烫伤后第1天
10
3.108±0.28*
4.250±0.32*△
烫伤后第2天
10
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4.005±0.31*
5.011±0.41*△
烫伤后第3天
10
4.875±0.40*
5.972±0.54*△
注：对照组多聚泛素mRNA为(2.228±0.26) arbitary unit/μg RNA。与对照组比较：*P<0.05； 与未伤肢比较：△P<0.05 三、讨论
真核细胞中存在多种蛋白质降解途径，包括溶酶体组织蛋白酶途径、依赖Ca2+的中性蛋白酶途径、不依赖ATP的蛋白酶途径及依赖ATP-ubiquitin-26S proteasome途径。有研究表明,骨骼肌中也存在该ATP-ubiquitin-26S proteasome途径。而该途径作用的前提条件是底物蛋白与多聚泛素结合，进而提呈给26S蛋白酶复合体降解。本室的研究表明,烫伤后骨骼肌蛋白质降解增加也主要是通过该途径进行的,且泛素含量呈明显的进行性增加。
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编码泛素的基因有两种，即多聚泛素基因和融合基因(即编码单个泛素的基因)。在一般生理条件下，这两种基因均存在于细胞内。但在应激情况下，多聚泛素基因被大量激活，其mRNA所产生的多聚泛素，较之于多个基因分别产生泛素更为经济和迅速，这样可以减少代谢的繁琐，更好地适应应激过程。此外，与底物蛋白结合并介导底物降解的泛素是多聚泛素，所以，多聚泛素基因的表达更有利于蛋白质分解代谢的需要。本实验结果显示，烫伤后骨骼肌蛋白质降解加强的同时，其多聚泛素mRNA水平呈明显的进行性增加，说明烫伤反应可激活多聚泛素基因的表达，这与本室观察到的烫伤后泛素含量显著增加的结果一致。
但有关该途径在烫伤后被激活的原因和机制还不清楚。创伤、炎症等刺激可使炎症细胞产生TNF、IL-1、IL-6等细胞因子，这些因子能作用于多种器官，刺激糖皮质激素和胰高血糖素的产生，并与它们协调作用，对骨骼肌蛋白质降解产生影响。本室的研究证明，TNF、IL-1均可加强烫伤后骨骼肌中蛋白质的降解，且对烫伤局部比对远隔部位影响更大。Garcia-Martinez等[2]报告，TNF-α可促进泛素基因表达及泛素结合物水平升高。Wing等[3]认为，依赖ATP-ubiquitin-26S proteasome系统对骨骼肌蛋白质的降解是通过糖皮质激素介导的。但烧伤后TNF和糖皮质激素对ATP-ubiquitin-26S proteasome系统的作用尚不清楚，需进一步研究。
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作者单位：谭银玲(400038 重庆，第三军医大学生化教研室)
董燕麟(400038 重庆，第三军医大学生化教研室)
参考文献
1，谭银玲, 董燕麟.严重烫伤大鼠骨骼肌蛋白质降解途径及泛素作用的研究.中华创伤杂志， 1998，14：384-386.
2，Garcia-Martinez C,Agell N,Lovera M,et al.TNF-α increases the ubiquitinazation of rat skeletal muscle protein.FEBS,1993,323:211-214.
3，Wing SS,Hass AL,Goldberg AL.Increase in ubiquitin-protein conjugates concomitant with the increase in proteolysis in rat skeletal muscle during starvation and atrophy denervation.Biochem J, 1995,307:639-645., 百拇医药