新生隐球菌产黑素野生株和白化突变株的比较研究
http://www.100md.com
中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
新生隐球菌产黑素野生株和白化突变株的比较研究
桑红 廖万清 陈江汉 温海 顾菊林 王学敏 李林
关键词：新生隐球菌
新生隐球菌是一重要条件致病菌，其黑素对毒力的影响已经得到广泛的证实，而酚氧化酶是催化产生黑素的酶类，CNLAC1是编码新生隐球菌酚氧化酶的结构基因，Willimson等分离纯化了该酶[1]，并据其N末端氨基酸序列克隆了编码其合成的cDNA序列和染色体基因[2]；自然界中存在野生株和天然突变株，本研究应用PCR技术检测天然变异株突变情况，旨在进行野生产黑素株与白化突变株的比较研究。
一、材料和方法
(一)研究对象：128株隐球菌取自第二军医大学附属长征医院皮肤科真菌病研究室，并用多巴胺及咖啡酸培养基筛选出1株不产黑素的突变株CCCC10148，同时取1株野生CCCC10297菌株(产黑素株)。
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(二)多巴胺培养基(CT)参考文献[3]，由两部分组成：①多巴0.2g/L，5-氨基水杨酸0.5g/L，3,4-二氨基苯甲酸1.0g/L，加入天冬酰氨1.0g，谷氨酰胺1.0g，甘氨酸1.0g，用1mol/LK2HPO4调pH至5.5，用0.45μm滤膜滤过除菌。②K2HPO44.0g，MgSO47H2O2.5g，硫胺素10mg，生物素20μg，葡萄糖0.5～5.0g，琼脂25g溶于800mL去离子水，pH调至5.5，高压灭菌15min。咖啡酸玉米吐温培养基为咖啡酸0.3g，吐温8020mL，米粉10g，琼脂20g，定容至1000mL。
(三)PCR引物：参照新生隐球菌酚氧化酶结构基因CNLAC1设计4对引物，分别由中国科学院上海生化所及Takara公司合成，各用于扩增野生株及突变株CNLAC1片段。引物序列、位点分布如下：正向1：5′-AGACTTCTGCTTGGAGTGATCTA
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GCGGG3′(44～71bp),反向1：5′-GCCA
ATGATTCTTCCAACCCGAGCG-3′(825～849bp)；正向2：5′-TTGTTTCCAGCGTCC
ATAATACTCTATGC-3′(36～64bp)，反向2：5′-GCAATGTTCTTTCTTACAGTCAGTG
TTGG-3′(1131～1159bp);正向3：5′-AAGAAAGAACATTGCTCCTCCACAAGG
-3′(0.1145～1171bp),反向3：5′-GAAGGTATTACCAAGAACATTCACAAAGG
C-3′(1887～1916bp)；正向4：5′-CGTAGACCACGAGACAGTCTTAGTGC-3′(1715～1740bp)，反向4：5′-AATGATT
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CTTCCAACCCGAGCG-3′(2596～2617bp)。
(四)新生隐球菌基因组DNA的提取：提取CCCC10148及CCCC10297基因组DNA均参考文献[8]并改进。操作过程：实验菌株在沙堡琼脂培养基上30℃培养48h，然后转种到YEPD(酵母浸膏占1%，蛋白胨占2%，葡萄糖占2%)培养液100mL中，30℃摇床16h，菌体离心4000r/min5min，用无菌水洗2次。用5mLSCE(0.1mol/L柠檬酸三钠，1mol/L山梨醇，10mmol/LEDTA，pH5.8)重浮，1mLSCE内含1mgNovozyme234。离心取沉淀，充分混悬于含1%SDS的Tris-EDTA，65℃，30min，同时加入蛋白酶K50μg/mL，加2/5体积预冷的5mol/L乙酸钾，冰浴30min，12000r/min离心15min，上清液用酚氯仿抽提1次，上清液用2倍体积无水乙醇沉淀，4℃2h，12000r/min离心10min，弃上清液，收集DNA，15.2mol/L(70%)乙醇洗2次，真空干燥，加80μLTE，再加入4/5μLRNA酶，65℃20min，移入Eppendorf管中，再用饱和酚氯仿抽提1次，2倍体积无水乙醇沉淀4℃过夜，12000r/min离心10min，15.2mol/L乙醇洗涤，真空抽干，溶于200μLTE，-20℃保存。
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(五)PCR扩增：TaqDNA聚合酶是由德国BoehringerMannbeim生产的高保真PwoDNApolymerase，PCR扩增仪为美国生产PTC-100ProgrammableThermalController。PCR标准反应体系在0.5mL进口硅化Eppendorf管中进行，反应体积为50μL，加入10×缓冲液(TaqDNA配套缓冲液，MgCl2浓度为25mmol/L)，引物均为25pmol,4×dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP，Promega公司)各为250μmol/L，模板(基因组DNA)100ng加灭菌三蒸水补足体积至50μL，96℃变性5min，加入TaqDNA聚合酶2.5U(0.5μL)，循环条件为94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，再以72℃延伸10min使新链延伸完全。
(六)PCR产物鉴定：PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，Marker(Takara公司生产的DNAMarkerDL-2000)对照，照相，又进行了3.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进一步鉴定。
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二、结果
新生隐球菌白化突变株酚氧化酶结构基因DNA编码出现异常情况。
图1 PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶结构基因
图2 PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶结构基因
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图3PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶
结构基因(引物4)
由4对引物分别对新生隐球菌野生株和白化突变株进行DNA扩增，检测结果发现，第1～3对引物的扩增带未见明显异常，2%琼脂糖凝胶电泳及3.5%PAGE结果一致(图1,2，第2对引物扩增包含了第1对引物扩增范围)。由第4对引物扩增出的酚氧化酶结构基因扩增带在株与株之间出现了明显的差异(1715bp～2617bp)，产黑野生株如预期结果扩增出约900bp的条带，而白化突变株则出现约450bp的条带，重复8次结果完全一致，条带细亮特异，与Marker对照缺失约450bp(图3)。
三、讨论
新生隐球菌多糖荚膜和黑素的产生在其毒力中的重要性已得到证实。而新生隐球菌黑素的毒力作用主要与它保护酵母细胞抵抗游离氧和氮氧化剂，清除吞噬细胞内产生的抗微生物氧化物有关，它可以保护酵母细胞免受宿主效应细胞产生氧化物的破坏，并抵抗紫外线的抗真菌效应和降低对两性霉素B的敏感性。天然突变株不产生黑素的分子研究为人们诊断和治疗提供可能的靶目标，目前对酚氧化酶结构基因CNLAC1的进一步研究，国内外刚刚起步，本研究将第二军医大学附属长征医院皮肤科真菌病研究室保藏的128株隐球菌，用多巴胺及咖啡酸培养基筛选出不产黑素的突变株，根据Willimson克隆编码酚氧化酶合成的cDNA序列，设计了4对引物，分别用PCR技术对野生产黑素株及不产黑素的变异株进行扩增，发现白化突变株与野生产黑素株酚氧化酶结构基因存在明显差异(1715bp～2617bp)。
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国家自然科学基金资助项目(39870658)
作者单位：廖万清(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
陈江汉(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
温海(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
顾菊林(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
桑红(现在南京军区总医院皮肤科210002)
王学敏(第二军医大学生化教研室指导者)
李林(中国科学院上海生化所指导者)
参考文献
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[1] Chartier FL,Keer JT,Sutcliffe MJ,et al. Construction of a mouse yeast artificial chromosome library in a recombination deficient strain of yeast.Nat Genet,1992,1:132- 138.
[2] Williamson PR. Biochemical and molecular characterization of the diphenol oxidase of Cryptococcus neoformans:identification as a laccase.J Bacteriol,1994,176:656- 664.
[3] Nurudeen TA, Aearn DG. Regulation of melanin production by Cryptococcus neoformans. J Clin Microbial,1979,10:724- 729., 百拇医药
桑红 廖万清 陈江汉 温海 顾菊林 王学敏 李林
关键词：新生隐球菌
新生隐球菌是一重要条件致病菌，其黑素对毒力的影响已经得到广泛的证实，而酚氧化酶是催化产生黑素的酶类，CNLAC1是编码新生隐球菌酚氧化酶的结构基因，Willimson等分离纯化了该酶[1]，并据其N末端氨基酸序列克隆了编码其合成的cDNA序列和染色体基因[2]；自然界中存在野生株和天然突变株，本研究应用PCR技术检测天然变异株突变情况，旨在进行野生产黑素株与白化突变株的比较研究。
一、材料和方法
(一)研究对象：128株隐球菌取自第二军医大学附属长征医院皮肤科真菌病研究室，并用多巴胺及咖啡酸培养基筛选出1株不产黑素的突变株CCCC10148，同时取1株野生CCCC10297菌株(产黑素株)。
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(二)多巴胺培养基(CT)参考文献[3]，由两部分组成：①多巴0.2g/L，5-氨基水杨酸0.5g/L，3,4-二氨基苯甲酸1.0g/L，加入天冬酰氨1.0g，谷氨酰胺1.0g，甘氨酸1.0g，用1mol/LK2HPO4调pH至5.5，用0.45μm滤膜滤过除菌。②K2HPO44.0g，MgSO47H2O2.5g，硫胺素10mg，生物素20μg，葡萄糖0.5～5.0g，琼脂25g溶于800mL去离子水，pH调至5.5，高压灭菌15min。咖啡酸玉米吐温培养基为咖啡酸0.3g，吐温8020mL，米粉10g，琼脂20g，定容至1000mL。
(三)PCR引物：参照新生隐球菌酚氧化酶结构基因CNLAC1设计4对引物，分别由中国科学院上海生化所及Takara公司合成，各用于扩增野生株及突变株CNLAC1片段。引物序列、位点分布如下：正向1：5′-AGACTTCTGCTTGGAGTGATCTA
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GCGGG3′(44～71bp),反向1：5′-GCCA
ATGATTCTTCCAACCCGAGCG-3′(825～849bp)；正向2：5′-TTGTTTCCAGCGTCC
ATAATACTCTATGC-3′(36～64bp)，反向2：5′-GCAATGTTCTTTCTTACAGTCAGTG
TTGG-3′(1131～1159bp);正向3：5′-AAGAAAGAACATTGCTCCTCCACAAGG
-3′(0.1145～1171bp),反向3：5′-GAAGGTATTACCAAGAACATTCACAAAGG
C-3′(1887～1916bp)；正向4：5′-CGTAGACCACGAGACAGTCTTAGTGC-3′(1715～1740bp)，反向4：5′-AATGATT
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CTTCCAACCCGAGCG-3′(2596～2617bp)。
(四)新生隐球菌基因组DNA的提取：提取CCCC10148及CCCC10297基因组DNA均参考文献[8]并改进。操作过程：实验菌株在沙堡琼脂培养基上30℃培养48h，然后转种到YEPD(酵母浸膏占1%，蛋白胨占2%，葡萄糖占2%)培养液100mL中，30℃摇床16h，菌体离心4000r/min5min，用无菌水洗2次。用5mLSCE(0.1mol/L柠檬酸三钠，1mol/L山梨醇，10mmol/LEDTA，pH5.8)重浮，1mLSCE内含1mgNovozyme234。离心取沉淀，充分混悬于含1%SDS的Tris-EDTA，65℃，30min，同时加入蛋白酶K50μg/mL，加2/5体积预冷的5mol/L乙酸钾，冰浴30min，12000r/min离心15min，上清液用酚氯仿抽提1次，上清液用2倍体积无水乙醇沉淀，4℃2h，12000r/min离心10min，弃上清液，收集DNA，15.2mol/L(70%)乙醇洗2次，真空干燥，加80μLTE，再加入4/5μLRNA酶，65℃20min，移入Eppendorf管中，再用饱和酚氯仿抽提1次，2倍体积无水乙醇沉淀4℃过夜，12000r/min离心10min，15.2mol/L乙醇洗涤，真空抽干，溶于200μLTE，-20℃保存。
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(五)PCR扩增：TaqDNA聚合酶是由德国BoehringerMannbeim生产的高保真PwoDNApolymerase，PCR扩增仪为美国生产PTC-100ProgrammableThermalController。PCR标准反应体系在0.5mL进口硅化Eppendorf管中进行，反应体积为50μL，加入10×缓冲液(TaqDNA配套缓冲液，MgCl2浓度为25mmol/L)，引物均为25pmol,4×dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP，Promega公司)各为250μmol/L，模板(基因组DNA)100ng加灭菌三蒸水补足体积至50μL，96℃变性5min，加入TaqDNA聚合酶2.5U(0.5μL)，循环条件为94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，再以72℃延伸10min使新链延伸完全。
(六)PCR产物鉴定：PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，Marker(Takara公司生产的DNAMarkerDL-2000)对照，照相，又进行了3.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进一步鉴定。
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二、结果
新生隐球菌白化突变株酚氧化酶结构基因DNA编码出现异常情况。
图1 PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶结构基因
图2 PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶结构基因
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图3PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶
结构基因(引物4)
由4对引物分别对新生隐球菌野生株和白化突变株进行DNA扩增，检测结果发现，第1～3对引物的扩增带未见明显异常，2%琼脂糖凝胶电泳及3.5%PAGE结果一致(图1,2，第2对引物扩增包含了第1对引物扩增范围)。由第4对引物扩增出的酚氧化酶结构基因扩增带在株与株之间出现了明显的差异(1715bp～2617bp)，产黑野生株如预期结果扩增出约900bp的条带，而白化突变株则出现约450bp的条带，重复8次结果完全一致，条带细亮特异，与Marker对照缺失约450bp(图3)。
三、讨论
新生隐球菌多糖荚膜和黑素的产生在其毒力中的重要性已得到证实。而新生隐球菌黑素的毒力作用主要与它保护酵母细胞抵抗游离氧和氮氧化剂，清除吞噬细胞内产生的抗微生物氧化物有关，它可以保护酵母细胞免受宿主效应细胞产生氧化物的破坏，并抵抗紫外线的抗真菌效应和降低对两性霉素B的敏感性。天然突变株不产生黑素的分子研究为人们诊断和治疗提供可能的靶目标，目前对酚氧化酶结构基因CNLAC1的进一步研究，国内外刚刚起步，本研究将第二军医大学附属长征医院皮肤科真菌病研究室保藏的128株隐球菌，用多巴胺及咖啡酸培养基筛选出不产黑素的突变株，根据Willimson克隆编码酚氧化酶合成的cDNA序列，设计了4对引物，分别用PCR技术对野生产黑素株及不产黑素的变异株进行扩增，发现白化突变株与野生产黑素株酚氧化酶结构基因存在明显差异(1715bp～2617bp)。
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国家自然科学基金资助项目(39870658)
作者单位：廖万清(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
陈江汉(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
温海(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
顾菊林(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
桑红(现在南京军区总医院皮肤科210002)
王学敏(第二军医大学生化教研室指导者)
李林(中国科学院上海生化所指导者)
参考文献
, http://www.100md.com
[1] Chartier FL,Keer JT,Sutcliffe MJ,et al. Construction of a mouse yeast artificial chromosome library in a recombination deficient strain of yeast.Nat Genet,1992,1:132- 138.
[2] Williamson PR. Biochemical and molecular characterization of the diphenol oxidase of Cryptococcus neoformans:identification as a laccase.J Bacteriol,1994,176:656- 664.
[3] Nurudeen TA, Aearn DG. Regulation of melanin production by Cryptococcus neoformans. J Clin Microbial,1979,10:724- 729., 百拇医药