白念珠菌胞壁碱溶性β－葡聚糖的分离、纯化和分析
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中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖的分离、纯化和分析
李岷 陈邵凤 沈永年 吕桂霞 陈伟 郭宁如 吴绍熙
摘 要 目的 分离纯化白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖，并分析其物理化学性质和结构。方法与结果 白念珠菌标准株IDC1d经YEPD培养基28℃、18h培养，收集酵母相细胞，0.75mol/LNaOH液提取，乙醇沉淀，得粗多糖。采用红外光谱、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法、考马斯亮蓝法定性分析粗多糖。粗多糖不含还原糖，但含有蛋白质。粗多糖经SephadexG-200凝胶柱层析纯化。纸层析、凝胶柱层析鉴定所得多糖的纯度，表明其为均一物质。凝胶柱层析测定相对分子质量约为89125.09。多糖经完全酸水解，硅胶薄层层析和气相色谱分析单糖组分，结果表明其为D-葡萄糖聚合成的多糖。红外光谱提示多糖糖苷键为β型。高碘酸氧化和Smith降解结果表明多糖包含1→3和1→6两种连接键，推测前者为主链键型，后者为支链键型。
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关键词：念珠菌，白色；β-葡聚糖
β-葡聚糖是念珠菌胞壁的重要组分，按溶解性可分为碱溶性、酸溶性和不溶性三部分；根据糖链结构的差异，分为β-(1→3)-葡聚糖和β-(1→6)-葡聚糖。以往对白念珠菌不溶性和酸溶性β-葡聚糖结构研究较多，并证实不溶性β-葡聚糖具有免疫活性[1,2]。对碱溶性β-葡聚糖则研究较少。20世纪90年代初，发现真菌胞壁中β-(1→3)-葡聚糖能够激活原用于检测细菌内毒素的鲎变形细胞溶解物中的G因子，基于此原理建立了检测标本中β-(1→3)-葡聚糖来确定有无深部真菌感染的诊断新方法——G试验。有资料表明碱溶性的β-(1→3)-葡聚糖激活G因子能力最强。此后，人们才开始关注碱溶性β-葡聚糖的研究，陆续有了关于其结构和活性的一些报道[3-5]。我们初步建立分离、纯化白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖以及分析其物理化学性质(主要是纯度和分子量)及糖链结构的方法，并按上述方法获得了结构明确的纯化碱溶性β-葡聚糖。
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材料与方法
一、材料
菌株与试剂：白念珠菌(IDC1d株)由中国医学真菌菌种保藏中心提供。主要试剂：SephadexG-200、Dextran标准分子量系列(Pharmacia进口分装)，D-葡萄糖、D-半乳糖(上海试剂二厂)，D-甘露糖(Fluka进口分装)，D-赤藓醇(E.Merck进口分装)，其余试剂均为分析纯试剂。
二、方法
(一)菌种培养：菌种生长于沙堡固体斜面培养基。接种于YEPD液体培养基，28℃恒温摇床160次/min振荡培养18h。60℃，30min灭活，离心收集酵母相细胞，洗涤。
(二)白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖的提取及定性分析：按文献[1]获得粗多糖，并对粗多糖定性分析[6]。
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(三)纯化：采用SephadexG-200凝胶柱层析，按文献[7,8]操作。
(四)纯度鉴定：纸层析的展开剂为90%吡啶，甲苯胺蓝染色。凝胶柱层析方法同(三)。
(五)多糖分子量测定：如文献[8]所述采用凝胶柱层析法。
(六)单糖组分分析：完全酸水解方法见文献[8]。酸水解产物溶于蒸馏水，硅胶G薄层层析，展开剂为乙酸乙酯∶乙酸∶甲醇∶水(12∶3∶3∶2)，显色剂为苯胺-邻苯二甲酸试剂。比较样品与单糖标准品的Rf值，确定多糖的单糖组成种类[6]。
(七)气相色谱分析[6]：上述酸水解产物经糖腈乙酸酯衍生物法处理，行气相色谱分析，比较样品与标准单糖的出峰时间，了解组成的单糖种类。
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(八)糖链结构分析：纯多糖的红外光谱分析，多糖干粉用KBr压片法[6]。
高碘酸氧化：精确称取适量多糖样品溶于0.015mol/LNaIO4液中，棕色瓶4℃放置，间隔时间取样，紫外分光光度计223nm处测定吸光度值。查高碘酸氧化工作曲线，计算其消耗量。消耗至稳定，用已标定浓度的NaOH液测定反应液中甲酸生成量。
Smith降解：高碘酸氧化完全后取反应液，加乙二醇，透析48h，加入硼氢化钠以还原多糖醛，用0.1mol/L乙酸调pH至5.5，透析48h，干燥得多糖醇。经完全酸水解，气相色谱分析。
结果
一、粗多糖的定性分析
1.定性试验检测：粗多糖溶液苯酚-硫酸法呈桔红色反应；蒽酮-硫酸反应呈蓝绿色；3，5-二硝基水杨酸法反应未出现棕红色反应；考马斯亮蓝反应呈蓝色。
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2.粗多糖的红外光谱分析：粗多糖的4个吸收宽峰均位于多糖特征吸收峰范围。上述结果表明，所得粗多糖为一个多糖物质，其中不含有还原糖，但有蛋白质存在。
二、多糖的纯化
1.SephadexG-200柱层析：收集液经苯酚-硫酸法鉴定，在8～30管呈桔红色，即为多糖阳性反应，而同时紫外分光光度计280nm处测定吸光度值则均很低。结果表明经柱层析分离后，主糖峰已去除了蛋白质。所得洗脱曲线为一单峰，峰形对称。
2.纯多糖的纯度鉴定：经染色漂洗后层析纸上仅出现1个斑点，呈海蓝色，Rf=0.41。经Sephadex凝胶柱层析，洗脱曲线上仅有1个洗脱峰。
三、分子量测定
蓝色葡聚糖上样测定外水体积(Vo)，标准葡聚糖(10万、7万、4.6万)测定洗脱体积(Ve)。以Ve/Vo为Y，logM为X求得直线回归方程：r=0.9989，Y=12.13-2.147X，据回归方程，可求得样品logM=4.95，M=89125.09。
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四、碱溶性β-葡聚糖的单糖组成分析
1.薄层层析：结果显示，样品层析后仅有1个斑点，其Rf值与D-葡萄糖的Rf值相同。
2.气相色谱分析：样品在气相色谱图上只显示1个峰，与标准品对照，其出峰时间与D-葡萄糖相同。上述2种测试方法结果均表明所纯化的样品为一种单独由D-葡萄糖聚合而成的多聚糖。
五、糖链结构
1.多糖糖苷键键型分析：纯多糖的红外光谱分析表明，其有1吸收峰，恰处于β端基差向异构的C-H变角振动特征吸收峰范围内(891±7cm-1)。
2.多糖糖苷键连接方式：纯多糖高碘酸氧化反应到144h，高碘酸消耗量达最大值，A223为0.521，据工作曲线，可计算出平均每摩尔己糖残基消耗0.587mol高碘酸，同时生成0.277mol甲酸，高碘酸消耗量近于甲酸消耗量2倍。高碘酸氧化产物经Smith降解后的气相色谱与标准品图谱对照，结果表明有较多的葡萄糖以及甘油被检出。提示该多糖具有1→3位键合及1→6位键合的糖苷键键型，并推测1→3位键合是该多糖的主链键型，而1→6位键合是多糖的支链键型。
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讨论
为进一步研究不同念珠菌种胞壁碱溶性β-葡聚糖的含量是否存在差异及其可能的分类学意义，并为研究碱溶性β-葡聚糖与念珠菌致病力的关系和其在机体抗念珠菌感染免疫反应中所起的作用。我们初步进行了本文所述的研究工作。
在多糖的提取过程中，应用稀碱液(3%NaOH溶液)70℃提取白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖，可防止100℃碱液提取造成的β-消除反应，影响糖链的完整。为了获得多糖的纯品，应用SephadexG-200凝胶柱层析对粗多糖纯化和除蛋白质一步完成，即简化实验步骤，又减少除蛋白质的化学试剂对多糖性质的影响，并且减少操作过程中多糖的损耗。
通过高碘酸氧化和Smith降解等方法可初步确定多糖样品的糖苷键连接方式。根据高碘酸氧化原则：以1→2或1→4位键合的糖基氧化后平均每个糖基仅消耗1分子高碘酸，并且有甲酸释放；以1→3位键合的糖基不被氧化；以1→6位键合的糖基消耗2分子高碘酸，释放1分子甲酸。实验结果表明多糖样品消耗2分子高碘酸，释放1分子甲酸。依照上述原则，提示样品具有1→6位键合的糖基，由于平均每摩尔己糖残基中只有0.277～0.293mol的1→6位键合己糖残基，推测1→6位键合非主链键型，而是支链键型。Smith降解产生的特征终产物是由多糖的糖苷键键型所决定，凡含有1→2位或1→6位键型的多糖，甘油为其特征终产物；1→4位为赤藓醇；1→3位键型为葡萄糖。样品结果表明有较多的葡萄糖以及少量甘油被检出，提示该多糖具有1→3位键合及1→6位键合的糖苷键键型，推测1→3位键合是该多糖的主链键型，而1→6位键合是多糖的支链键型。
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作者单位：李岷(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
陈邵凤(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
沈永年(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
吕桂霞(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
陈伟(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
郭宁如(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
吴绍熙(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
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参考文献
[1]Gopal PK, Sullivan PA,Shepherd MG. Analysis of wall glucans from yeast, hyphal and germ- tube forming cells of Candida albicans. J Gen Microbiol, 1984,130:3295- 3310.
[2]Abel G, Czop JK. Stimulation of human monocyte β- glucans receptors by glucan particles induces production of TNF- α and IL- 1β. Int J Immunopharmacol, 1991,14:1363- 1373.
[3]Obyashi T, Yoshida M, Mori T, et al. Plasma (1,3)- β- D- glucan, mesurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes. Lancet, 1995,345:17- 20.
, http://www.100md.com
[4]Tamura H, Roth RI, Grunfeld C, et al. Soluble (1,3)- β- D- glucans puried fronm Candida albicans: biologic effects and distribution in blood and organs in rabbits. J Lab Clin Med, 1996,128:103- 114.
[5]Saito H, Yoshida Y, Uehara N. Relationship between conformation and biological response for (1,3)-β- D- glucans in the activation of coagulation factor G from limulus amebocyte lysate and host- mediated antitumor activity. Demonstration of single- helix conformation as a stimulant. Carbohydr Res, 1991,217:181- 190.
[6]张惟杰主编.糖复合物生化研究.第1版.杭州：浙江大学出版社,1994.13-209.
[7]杨晓彤，糜可，杨庆尧,等.香菇菌丝体多糖LeBD1-1的分离纯化和分析.微生物学报,1997,37:119-123.
[8]曾培让，吴祖道，王汝聪.金针菇Flammulinavelutipes(Curt.exFr.)Sing.子实体多糖PA3DE的分离、纯化和分析.生物化学与生物物理学,1989,21:152-156., 百拇医药
李岷 陈邵凤 沈永年 吕桂霞 陈伟 郭宁如 吴绍熙
摘 要 目的 分离纯化白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖，并分析其物理化学性质和结构。方法与结果 白念珠菌标准株IDC1d经YEPD培养基28℃、18h培养，收集酵母相细胞，0.75mol/LNaOH液提取，乙醇沉淀，得粗多糖。采用红外光谱、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法、考马斯亮蓝法定性分析粗多糖。粗多糖不含还原糖，但含有蛋白质。粗多糖经SephadexG-200凝胶柱层析纯化。纸层析、凝胶柱层析鉴定所得多糖的纯度，表明其为均一物质。凝胶柱层析测定相对分子质量约为89125.09。多糖经完全酸水解，硅胶薄层层析和气相色谱分析单糖组分，结果表明其为D-葡萄糖聚合成的多糖。红外光谱提示多糖糖苷键为β型。高碘酸氧化和Smith降解结果表明多糖包含1→3和1→6两种连接键，推测前者为主链键型，后者为支链键型。
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关键词：念珠菌，白色；β-葡聚糖
β-葡聚糖是念珠菌胞壁的重要组分，按溶解性可分为碱溶性、酸溶性和不溶性三部分；根据糖链结构的差异，分为β-(1→3)-葡聚糖和β-(1→6)-葡聚糖。以往对白念珠菌不溶性和酸溶性β-葡聚糖结构研究较多，并证实不溶性β-葡聚糖具有免疫活性[1,2]。对碱溶性β-葡聚糖则研究较少。20世纪90年代初，发现真菌胞壁中β-(1→3)-葡聚糖能够激活原用于检测细菌内毒素的鲎变形细胞溶解物中的G因子，基于此原理建立了检测标本中β-(1→3)-葡聚糖来确定有无深部真菌感染的诊断新方法——G试验。有资料表明碱溶性的β-(1→3)-葡聚糖激活G因子能力最强。此后，人们才开始关注碱溶性β-葡聚糖的研究，陆续有了关于其结构和活性的一些报道[3-5]。我们初步建立分离、纯化白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖以及分析其物理化学性质(主要是纯度和分子量)及糖链结构的方法，并按上述方法获得了结构明确的纯化碱溶性β-葡聚糖。
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材料与方法
一、材料
菌株与试剂：白念珠菌(IDC1d株)由中国医学真菌菌种保藏中心提供。主要试剂：SephadexG-200、Dextran标准分子量系列(Pharmacia进口分装)，D-葡萄糖、D-半乳糖(上海试剂二厂)，D-甘露糖(Fluka进口分装)，D-赤藓醇(E.Merck进口分装)，其余试剂均为分析纯试剂。
二、方法
(一)菌种培养：菌种生长于沙堡固体斜面培养基。接种于YEPD液体培养基，28℃恒温摇床160次/min振荡培养18h。60℃，30min灭活，离心收集酵母相细胞，洗涤。
(二)白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖的提取及定性分析：按文献[1]获得粗多糖，并对粗多糖定性分析[6]。
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(三)纯化：采用SephadexG-200凝胶柱层析，按文献[7,8]操作。
(四)纯度鉴定：纸层析的展开剂为90%吡啶，甲苯胺蓝染色。凝胶柱层析方法同(三)。
(五)多糖分子量测定：如文献[8]所述采用凝胶柱层析法。
(六)单糖组分分析：完全酸水解方法见文献[8]。酸水解产物溶于蒸馏水，硅胶G薄层层析，展开剂为乙酸乙酯∶乙酸∶甲醇∶水(12∶3∶3∶2)，显色剂为苯胺-邻苯二甲酸试剂。比较样品与单糖标准品的Rf值，确定多糖的单糖组成种类[6]。
(七)气相色谱分析[6]：上述酸水解产物经糖腈乙酸酯衍生物法处理，行气相色谱分析，比较样品与标准单糖的出峰时间，了解组成的单糖种类。
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(八)糖链结构分析：纯多糖的红外光谱分析，多糖干粉用KBr压片法[6]。
高碘酸氧化：精确称取适量多糖样品溶于0.015mol/LNaIO4液中，棕色瓶4℃放置，间隔时间取样，紫外分光光度计223nm处测定吸光度值。查高碘酸氧化工作曲线，计算其消耗量。消耗至稳定，用已标定浓度的NaOH液测定反应液中甲酸生成量。
Smith降解：高碘酸氧化完全后取反应液，加乙二醇，透析48h，加入硼氢化钠以还原多糖醛，用0.1mol/L乙酸调pH至5.5，透析48h，干燥得多糖醇。经完全酸水解，气相色谱分析。
结果
一、粗多糖的定性分析
1.定性试验检测：粗多糖溶液苯酚-硫酸法呈桔红色反应；蒽酮-硫酸反应呈蓝绿色；3，5-二硝基水杨酸法反应未出现棕红色反应；考马斯亮蓝反应呈蓝色。
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2.粗多糖的红外光谱分析：粗多糖的4个吸收宽峰均位于多糖特征吸收峰范围。上述结果表明，所得粗多糖为一个多糖物质，其中不含有还原糖，但有蛋白质存在。
二、多糖的纯化
1.SephadexG-200柱层析：收集液经苯酚-硫酸法鉴定，在8～30管呈桔红色，即为多糖阳性反应，而同时紫外分光光度计280nm处测定吸光度值则均很低。结果表明经柱层析分离后，主糖峰已去除了蛋白质。所得洗脱曲线为一单峰，峰形对称。
2.纯多糖的纯度鉴定：经染色漂洗后层析纸上仅出现1个斑点，呈海蓝色，Rf=0.41。经Sephadex凝胶柱层析，洗脱曲线上仅有1个洗脱峰。
三、分子量测定
蓝色葡聚糖上样测定外水体积(Vo)，标准葡聚糖(10万、7万、4.6万)测定洗脱体积(Ve)。以Ve/Vo为Y，logM为X求得直线回归方程：r=0.9989，Y=12.13-2.147X，据回归方程，可求得样品logM=4.95，M=89125.09。
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四、碱溶性β-葡聚糖的单糖组成分析
1.薄层层析：结果显示，样品层析后仅有1个斑点，其Rf值与D-葡萄糖的Rf值相同。
2.气相色谱分析：样品在气相色谱图上只显示1个峰，与标准品对照，其出峰时间与D-葡萄糖相同。上述2种测试方法结果均表明所纯化的样品为一种单独由D-葡萄糖聚合而成的多聚糖。
五、糖链结构
1.多糖糖苷键键型分析：纯多糖的红外光谱分析表明，其有1吸收峰，恰处于β端基差向异构的C-H变角振动特征吸收峰范围内(891±7cm-1)。
2.多糖糖苷键连接方式：纯多糖高碘酸氧化反应到144h，高碘酸消耗量达最大值，A223为0.521，据工作曲线，可计算出平均每摩尔己糖残基消耗0.587mol高碘酸，同时生成0.277mol甲酸，高碘酸消耗量近于甲酸消耗量2倍。高碘酸氧化产物经Smith降解后的气相色谱与标准品图谱对照，结果表明有较多的葡萄糖以及甘油被检出。提示该多糖具有1→3位键合及1→6位键合的糖苷键键型，并推测1→3位键合是该多糖的主链键型，而1→6位键合是多糖的支链键型。
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讨论
为进一步研究不同念珠菌种胞壁碱溶性β-葡聚糖的含量是否存在差异及其可能的分类学意义，并为研究碱溶性β-葡聚糖与念珠菌致病力的关系和其在机体抗念珠菌感染免疫反应中所起的作用。我们初步进行了本文所述的研究工作。
在多糖的提取过程中，应用稀碱液(3%NaOH溶液)70℃提取白念珠菌胞壁碱溶性β-葡聚糖，可防止100℃碱液提取造成的β-消除反应，影响糖链的完整。为了获得多糖的纯品，应用SephadexG-200凝胶柱层析对粗多糖纯化和除蛋白质一步完成，即简化实验步骤，又减少除蛋白质的化学试剂对多糖性质的影响，并且减少操作过程中多糖的损耗。
通过高碘酸氧化和Smith降解等方法可初步确定多糖样品的糖苷键连接方式。根据高碘酸氧化原则：以1→2或1→4位键合的糖基氧化后平均每个糖基仅消耗1分子高碘酸，并且有甲酸释放；以1→3位键合的糖基不被氧化；以1→6位键合的糖基消耗2分子高碘酸，释放1分子甲酸。实验结果表明多糖样品消耗2分子高碘酸，释放1分子甲酸。依照上述原则，提示样品具有1→6位键合的糖基，由于平均每摩尔己糖残基中只有0.277～0.293mol的1→6位键合己糖残基，推测1→6位键合非主链键型，而是支链键型。Smith降解产生的特征终产物是由多糖的糖苷键键型所决定，凡含有1→2位或1→6位键型的多糖，甘油为其特征终产物；1→4位为赤藓醇；1→3位键型为葡萄糖。样品结果表明有较多的葡萄糖以及少量甘油被检出，提示该多糖具有1→3位键合及1→6位键合的糖苷键键型，推测1→3位键合是该多糖的主链键型，而1→6位键合是多糖的支链键型。
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作者单位：李岷(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
陈邵凤(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
沈永年(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
吕桂霞(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
陈伟(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
郭宁如(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
吴绍熙(210042南京，中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所)
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[1]Gopal PK, Sullivan PA,Shepherd MG. Analysis of wall glucans from yeast, hyphal and germ- tube forming cells of Candida albicans. J Gen Microbiol, 1984,130:3295- 3310.
[2]Abel G, Czop JK. Stimulation of human monocyte β- glucans receptors by glucan particles induces production of TNF- α and IL- 1β. Int J Immunopharmacol, 1991,14:1363- 1373.
[3]Obyashi T, Yoshida M, Mori T, et al. Plasma (1,3)- β- D- glucan, mesurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes. Lancet, 1995,345:17- 20.
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[4]Tamura H, Roth RI, Grunfeld C, et al. Soluble (1,3)- β- D- glucans puried fronm Candida albicans: biologic effects and distribution in blood and organs in rabbits. J Lab Clin Med, 1996,128:103- 114.
[5]Saito H, Yoshida Y, Uehara N. Relationship between conformation and biological response for (1,3)-β- D- glucans in the activation of coagulation factor G from limulus amebocyte lysate and host- mediated antitumor activity. Demonstration of single- helix conformation as a stimulant. Carbohydr Res, 1991,217:181- 190.
[6]张惟杰主编.糖复合物生化研究.第1版.杭州：浙江大学出版社,1994.13-209.
[7]杨晓彤，糜可，杨庆尧,等.香菇菌丝体多糖LeBD1-1的分离纯化和分析.微生物学报,1997,37:119-123.
[8]曾培让，吴祖道，王汝聪.金针菇Flammulinavelutipes(Curt.exFr.)Sing.子实体多糖PA3DE的分离、纯化和分析.生物化学与生物物理学,1989,21:152-156., 百拇医药