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MTT微量稀释法检测头癣分离株对抗真菌药的MIC值
http://www.100md.com 中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
     MTT微量稀释法检测头癣分离株对抗真菌药的MIC值

    于长平 张福仁 赵毅 程焕明

    关键词:MTT微量肉汤稀释法;头癣;特比萘芬;伊曲康唑;MIC

    为探索敏感而可靠的丝状真菌药敏试验方法,我们用MTT微量肉汤稀释法测定了38株皮肤癣菌头癣分离株对特比萘芬和伊曲康唑的MIC值。

    一、材料与方法

    (一)实验材料:

    1.受试菌种:犬小孢子菌(M.canis)17株,须癣毛癣菌(T.mentagrophyte)15株,红色毛癣菌(T.rubrum)4株,紫色毛癣菌(T.violaceum)2株。皆分离自头癣患者,纯化后做小培养,根据菌落和显微镜下特征、玉米粉吐温琼脂试验、尿素酶试验等鉴定菌种,置4℃冰箱保存备用。
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    2.药物:特比萘芬原粉由齐鲁制药厂药物研究所提供,批号98-05-10。伊曲康唑原粉来自西安杨森制药有限公司,生产日期98-09-10。

    3.培养基:沙堡培养基、玉米粉培养基和马铃薯培养基(PDA)按文献配制。新鲜配制RPMI1640培养基(Sigma公司),缓冲液用3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS,34.54g/L,Sigma公司),1NNaOH调pH至7.0,然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

    4.显色剂:MTT(上海伯奥生物科技公司),配成0.5%溶液。

    5.甲溶解液:十二烷基硫酸钠(SDS,AmreCo进口分装),二甲基甲酰胺(DMF,如皋市化学试剂厂),配成200g/LSDS-50%(V/V)DMF的甲溶解液。

    (二)试验方法:

, 百拇医药     1.微量药敏板制备:将2种药物分别溶于100%二甲基亚砜,使质量浓度为0.4mg/mL,再用1640培养基稀释,然后10级倍比稀释,使起始浓度2μg/mL,终末浓度为0.0039μg/mL,对应加入无菌96孔酶标板中,每孔100μL,第11孔加不含药的1640液基100μL,第12孔加不含药液基200μL,第11孔作阳性对照、第12孔作空白对照。置-70℃冰箱备用。

    2.菌液制备:将受试菌株从4℃取出,活化后转种于PDA培养基,26℃培养10d,用含0.05%吐温80的无菌生理盐水1mL注入到PDA斜面上,收集菌悬液,用1640液基调整浓度到(2~4)×104cfu/mL,置4℃备用。

    3.菌液接种:药敏板从-70℃取出融化,将各菌株的菌悬液每孔加100μL,12孔不加,此步骤使菌液浓度稀释为(1~2)×104cfu/mL,药物质量浓度为0.002~1μg/mL。

    4.培养、加显色剂及甲溶解液:接种菌液后药敏板置28℃培养,每天观察生长情况。阳性对照孔生长良好后,各孔加MTT20μL,放28℃温箱4h。然后于各孔加甲溶解液100μL。
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    5.结果判定:分别于加甲溶液后18h、24h、30h,用酶标仪(DG3022A型,华东电子管厂)于550nm处,以空白孔调零测各孔吸光度值,以与生长对照孔相比吸光度值下降90%以上的最低药物浓度孔为MIC终点。

    1周后完全按上述方法和程序重复1次。

    二、结果

    阳性对照孔于培养5d时即生长良好。加入甲溶液后18h、24h和30h所测各孔吸光度值基本一致。4种皮肤癣菌对特比萘芬和伊曲康唑的MIC范围分别为0.002~0.063μg/mL和0.002~1μg/mL,均值分别为0.004μg/mL和0.006μg/mL;2种药物对各菌种的MIC值及均值见表1。

    表1MTT微量稀释法测定38株皮肤癣菌头癣分离株对特比萘芬和伊曲康唑的MIC值μg/mL
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    菌种

    MIC范围

    MIC均值

    犬小孢子菌

    特比萘芬

    0.002~0.016

    0.003

    伊曲康唑

    0.002~1

    0.007

    须癣毛癣菌

    特比萘芬

    0.002~0.063
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    0.005

    伊曲康唑

    0.002~0.063

    0.004

    红色毛癣菌

    特比萘芬

    0.002~0.008

    0.003

    伊曲康唑

    0.002~0.004

    0.003

    紫色毛癣菌
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    特比萘芬

    0.002~0.5

    0.016

    伊曲康唑

    0.002~0.004

    0.003

    三、讨论

    MTT是一种可为活细胞线粒体呼吸还原成有色产物的无色染料,产色的程度与细胞活性成正比,因此可用分光光度计或酶标仪定量测定细胞代谢活性。Jahn等[1]用MTT法进行了白念珠菌和曲霉体外药敏试验。但是过去的MTT法需将作用体系离心,去除上清液,然后加入甲溶解液,步骤较复杂。本试验首次在真菌药敏试验中应用200g/LSDS-50%(V/V)DMF作为MTT还原产物——甲的溶解液,实验发现其溶解力强,不与MTT反应,不需去除上清液,显色稳定。
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    实验中菌液接种浓度为104cfu/mL,在RPMI1640培养基中28℃培养5d皮肤癣菌即生长良好,此条件适合于皮肤癣菌体外药敏试验,与其他报道一致[1-3]。但是MTT法是测定细胞代谢活性受抑制的程度,而不是直接测定细胞数量减少的程度,因此推测培养时间可缩短到小于5d。

    初步研究结果显示,特比萘芬和伊曲康唑对皮肤癣菌头癣分离株有强大的抗菌活性,可用于头癣的治疗。MTT微量稀释法测定皮肤癣菌MIC用药量少,结果定量客观,且重复性好。

    作者单位:于长平(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)

    张福仁(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)

    赵毅(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)

    程焕明(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
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    参考文献

    [1]Jahn B, Martin E, Stueben A,et al. Susceptibility testing of Candida albicans and Aspergillus species by a simple microtiter menadione- augmented 3- (4,5- dimethyl- 2- thiazolyl)- 2,5- diphenyl- 2H- tetrazolium bromide assay, J Clin Microbiol,1995,33:661- 667.

    [2]Espinel Ingroff A, Bartlett M, Bowden R, et al. Multicenter evaluation of proposed standardized procedure for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. J Clin Microbiol, 1997, 35: 139- 143.

    [3]Hazen KC. Fungicidal versus fungistatic activity of terbinafine and itraconazole:an in vitro comparison.J Am Acad Dermatol,1998,38(5 Pt3):S37- S41., http://www.100md.com