培养牛角膜上皮细胞水通道蛋白功能的表达
培养牛角膜上皮细胞水通道蛋白功能的表达
康凤英 Kunyan Kuang Jorge Fischbarg
摘 要 目的 研究培养牛角膜上皮细胞水渗透力(water permeability, Pf)及水通道蛋白(aquaporins,AQPs)的存在。方法 应用激光散射法(laser light scattering system )，测定培养牛角膜上皮细胞自等渗状态快速转为低渗时体积的改变，并计算Pf 值;自该细胞提取mRNA注入爪蟾卵，测定卵细胞Pf值改变。结果 激光散射法测定培养牛角膜上皮细胞Pf值为72 μm/s；注射mRNA的蟾卵，Pf值为76 μm/s。汞制剂对此可产生明显的抑制作用。结论 培养牛角膜上皮细胞含有水渗透性强且可被汞制剂大部分抑制的水通道蛋白。因此，角膜上皮对维持角膜基质的水合和保持角膜的透明性具有重要意义。
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关键词：角膜；上皮；渗透性；水通道蛋白；牛
早期的研究发现，兔角膜上皮层具有较强的水渗透力(water permeability,Pf)[1]。自从水通道蛋白I型(aquaporin-1，AQP1)首次由哺乳类的红细胞克隆以来[2,3]，水通道蛋白的家族得到了迅速的发展，迄今已有5型被发现确认(AQP1-5)。在眼组织内，亦发现了不同类型的水通道蛋白[4]，如角膜内皮、晶状体上皮、虹膜与睫状体以及小梁网内皮和Schlemm管内皮层等[5-8]。对于角膜上皮层是否存在研究甚少，仅见Raina等[9]应用原位杂交组织化学染色法，发现在小鼠的唾液腺上皮和角膜上皮有AQP5存在。但其功能状态如何，尚未进行研究。本研究应用激光散射法[10]测定细胞的Pf 值，并采用自细胞内提取mRNA行蟾卵注射法测定水通道蛋白信息密码的存在，从而进一步探讨和确认哺乳类角膜上皮细胞层水通道蛋白的存在与功能状态，以及角膜上皮对维持角膜基质的水合和保持角膜透明的重要性。
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材料与方法
1.牛角膜上皮细胞的培养：取新鲜牛眼球无菌剖取全角膜，分离后弹力层和内皮层并去除，余角膜置D-PBS漂洗1次，于琼脂凹面板，上皮向上，加入浓度为240 U/L的Dispase II(美国Gibco公司)0.3 ml，置37℃培养40 min，使上皮层松脱。加入含10%胎牛血清、青霉素G(100 000U/L)、链霉素(100 000 U/L)的DMEM完全培养液中止消化，离心收集细胞，加入DMEM培养液重悬，移入25 ml培养瓶中，置CO2培养箱内常规培养。每周换液2次，1周后细胞生长达完全融合。以1∶3方式传代。
2.培养牛角膜上皮细胞Pf测定：Pf值的测算按Fischbarg等[5,10]报告的激光散射法进行。本研究灌注方法采用等渗液和低渗液，水通道阻滞剂应用对氯汞苯磺酸酯(p-chloromercuribenzenesulfonate,pCMBS)，恢复剂应用二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)(美国Sigma公司)。
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3.mRNA的制备：收集培养Ⅰ～Ⅲ代的牛角膜上皮细胞，采用Chomczynski和Sacchi[11]报告的RNAzol提取法提取全RNA。mRNA提纯则采用Badley等[12]报告的方法。促或抗水通道蛋白的引物(AQPs，AQPa)均由美国Oligos公司合成，各自的碱基序列分别为：AQP1s+14～+38(5′-TCAA-GAAGAAGCTCTTCTGGAGGGC-3′)；AQP1a+16～+40(5′-CAGCCCTCCAGAAGAGCTTCTTCTT-3′)；AQP5s+14～+38(5′-TGTGCTCCCTTGCCTTCTTCAAGGC-3′)；AQP5a+16～+40(5′-CCGCCTTTGAAGAAGGC-AAGGGAGA-3′)。
4.蟾卵的制备、注射与Pf值测定：按Echevarria等[5]报告的方法采集处理蟾卵。应用Picospritzer Ⅱ(美国General Valve，Fairfield)显微镜注射系统，每只卵注入液体量均为50 nl。(1)注入无菌去离子水为对照；(2)注入牛角膜上皮mRNA 50 ng；(3)牛角膜上皮mRNA 50 ng与AQP1s 2.5 ng混合注入；(4)牛角膜上皮mRNA 50 ng与AQP1a 2.5 ng混合注入;(5)牛角膜上皮mRNA 50 ng与AQP5s 2.5 ng混合注入;(6)牛角膜上皮mRNA 50 ng与AQP5a 2.5 ng混合注入。注射后4天按以往方法[5]测定：(1)转换灌注液渗透梯度(自180～15 mOsm/L)注水与注入mRNA 的蟾卵的Pf值；(2)卵细胞置于浓度0.3 mmol/L水通道阻滞剂HgCl2作用2 min后的Pf值；(3)卵细胞先经HgCl2抑制再加入水通道恢复剂β巯基乙醇5 mmol/L作用30 min后的Pf值。
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结果
1.激光散射法测定牛角膜上皮细胞Pf 值：培养牛角膜上皮细胞经测定Pf 值平均为(72±6)μm/s(n=16)；经浓度为1 mmol/L的pCMBS作用20 min后，Pf 值下降至(26±2)μm/s，显示细胞膜的水通道受到了明显的抑制；而当去除pCMBS并经浓度为5 mmol/L的DTT作用5 min后，Pf 值又恢复到原水平的80%。以上结果证明，培养牛角膜上皮细胞膜上存有水通道蛋白，其功能大部分可被汞制剂抑制。
2.蟾卵注射法测定牛角膜上皮细胞Pf 值：经测定，注水组蟾卵的Pf值平均为(14±2)μm/s(n=10);而注入自牛角膜上皮细胞提取的mRNA组，Pf值则高达(77±6)μm/s(n=20)，二者比较差异有非常显著性(t=42.47，P<0.01)。当注入mRNA的蟾卵经浓度为0.3 mmol/L的HgCl2作用后，其Pf值的88%被抑制[(21±1)μm/s]；再经β巯基乙醇处理，其Pf值又恢复到(61±8)μm/s。这充分说明，在培养的牛角膜上皮细胞内，有可被汞制剂阻滞的水通道蛋白信息编码存在。
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3.培养牛角膜上皮细胞水通道蛋白的分型:由表1可见,培养牛角膜上皮提取的mRNA与AQP5a引物混合注射组71%的Pf被抑制；而与AQP5s、AQP1a和AQP1s混合注射的各组与单纯注射角膜上皮mRNA的阳性对照组比较，该抑制作用均不明显。由此可见，培养牛角膜上皮细胞存在的水通道蛋白的信息编码属于AQP5。
表1 牛角膜上皮细胞mRNA与不同水通道蛋白
引物混合注射后蟾卵的Pf值
组别
Pf值(±s,μm/s)
AQPs
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14±3.1
mRNA
58±6.9
mRNA+AQP5s
55±3.8
mRNA+AQP5a
24±3.6
mRNA+AQP1s
56±2.8
mRNA+AQP1a
53±1.9
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讨论
角膜上皮为鳞状上皮，其主要功能是形成一层防护层，防止病原菌的侵入。此外，在角膜损伤愈合的过程中，角膜上皮也起着重要作用。目前，有关这方面的研究甚多。但是，以往对角膜上皮如何帮助角膜内皮层调节角膜基质的水化程度以保持角膜的透明性论述不多，对于角膜上皮层在维持角膜基质的水合作用认识不足。最初的研究认为，上皮剥脱后所产生的角膜水肿显示上皮细胞层具有“水泵”功能。生理学的研究发现[4]，哺乳类角膜上皮层具有较高的水渗透性，可允许水和体液以及某些离子穿过达泪液层，从而保持了角膜基质含水量的相对衡定状态。Candia和Zamudio[13]发现，在蛙角膜上皮层，氯离子可以增加水的渗透性，由此推断该上皮存在可被氯离子激活的水通道蛋白。
本研究的激光散射法测定结果表明，培养牛角膜上皮细胞的原生质膜具有相当高的水渗透能力(72 μm/s)，这与以往的研究结果相似。同时发现，上皮细胞的这种水渗透力可被1 mmol/L的pCMBS部分抑制，而这种抑制作用在DTT的作用下消失。自培养牛角膜上皮细胞内提取的mRNA注入蟾卵的研究结果发现，该mRNA可以明显增高蟾卵的水渗透力(Pf=77 μm/s)，0.3 mmol/L的HgCl2可以88%抑制该渗透功能，β巯基乙醇可以消除HgCl2的抑制作用。以上充分证明，牛角膜上皮细胞存在典型的对汞制剂敏感的具有水通道功能的蛋白信息编码。
, 百拇医药
另外，通过蟾卵内混合注入上皮细胞提取的mRNA和促或抗水通道蛋白合成的引物的研究结果表明 ，该上皮细胞所含有的水通道蛋白属AQP5。
综上所述，本研究结果表明，培养的牛角膜上皮细胞内含有具有较高水渗透功能的AQP5。该蛋白在上皮细胞发挥的功能，对维持角膜基质的相对脱水、保持角膜的透明具有重要意义。该研究对重新认识角膜上皮的生理功能，提醒临床医生在手术或用药过程中注意对角膜上皮的保护至关重要。
基金项目:美国NIH基金资助项目(EY06178)
作者单位:康凤英(261042 山东省潍坊医学院眼科研究所)
Kunyan Kuang(Departments of Physiology and Cellular Biophysics, and Ophthalmology, Columbia University, New York, USA)
, 百拇医药
Jorge Fischbarg(Departments of Physiology and Cellular Biophysics, and Ophthalmology, Columbia University, New York, USA)
参考文献
1，Mishima S ,Hedbys BO .The permeability of the corneal epithelium and endothelium to water.Exp Eye Res,1967,6:10-32.
2，Preston GM,Agre P. Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons:member of an ancient channel family.Proc Natl Acad Sci USA,1991, 88:11110-11114.
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3，Preston GM,Carroll TP,Guggino WB,et al.Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein.Science,1992,256(5055):385-387.
4，Fischbarg J. A rapidly emerging field:water channel proteins in the eye .Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36:758-763.
5，Echevarria M,Kuang K,Iserovich P, et al.Cultured bovine corneal endothelial cells express CHIP28 water channels.Am J Physiol, 1993,265(Cells Physiol 34):C1349-C1355.
, 百拇医药
6，Nielsen S,Smith BL,Christensen EI,et al.Distribution of the aquaporin CHIP in secretory and resorptive epithelia and capillary endothelia.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:7275-7279.
7，Stamer WD,Snyder RW,Smith BL,et al.Localization of aquaporin CHIP in the human eye:implications in the pathogenesis of glaucoma and other disorders of ocular fluid balance.Invest Ophthalmol Vis Sci,1994,35:3867-3872.
8，Stamer WD, Seftor REB, Snyder RW , et al.Cultured human trabecular meshwork cells express aquaporin-1 water channels.Curr Eye Res,1995,14:1095-1100.
, http://www.100md.com
9，Raina S,Preston GM,Guggino WB,et al.Molecular cloning and characterization of an aquaporin cDNA from salivary,lacrimal, and respiratory tissues.J Biol Chem, 1995,270:1908-1912.
10，Fischbarg J, Li J,Kuang K,et al.Determination of volume and water permeability of plated cells from measurements of light scattering .Am J Physiol, 1993,265(Cells Physiol 34):C1412-C1423.
11，Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156-159.
12，Badley JE, Bishop GA, St John T,et al. A Simple,rapid method for the purification of poly A+ RNA.Biotechniques,1988,6:114-116.
13，Candia OA, Zamudio AC. Chloride-activated water permeability in the frog corneal epithelium. J Membr Biol,1995,143:259-266., 百拇医药
康凤英 Kunyan Kuang Jorge Fischbarg
摘 要 目的 研究培养牛角膜上皮细胞水渗透力(water permeability, Pf)及水通道蛋白(aquaporins,AQPs)的存在。方法 应用激光散射法(laser light scattering system )，测定培养牛角膜上皮细胞自等渗状态快速转为低渗时体积的改变，并计算Pf 值;自该细胞提取mRNA注入爪蟾卵，测定卵细胞Pf值改变。结果 激光散射法测定培养牛角膜上皮细胞Pf值为72 μm/s；注射mRNA的蟾卵，Pf值为76 μm/s。汞制剂对此可产生明显的抑制作用。结论 培养牛角膜上皮细胞含有水渗透性强且可被汞制剂大部分抑制的水通道蛋白。因此，角膜上皮对维持角膜基质的水合和保持角膜的透明性具有重要意义。
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关键词：角膜；上皮；渗透性；水通道蛋白；牛
早期的研究发现，兔角膜上皮层具有较强的水渗透力(water permeability,Pf)[1]。自从水通道蛋白I型(aquaporin-1，AQP1)首次由哺乳类的红细胞克隆以来[2,3]，水通道蛋白的家族得到了迅速的发展，迄今已有5型被发现确认(AQP1-5)。在眼组织内，亦发现了不同类型的水通道蛋白[4]，如角膜内皮、晶状体上皮、虹膜与睫状体以及小梁网内皮和Schlemm管内皮层等[5-8]。对于角膜上皮层是否存在研究甚少，仅见Raina等[9]应用原位杂交组织化学染色法，发现在小鼠的唾液腺上皮和角膜上皮有AQP5存在。但其功能状态如何，尚未进行研究。本研究应用激光散射法[10]测定细胞的Pf 值，并采用自细胞内提取mRNA行蟾卵注射法测定水通道蛋白信息密码的存在，从而进一步探讨和确认哺乳类角膜上皮细胞层水通道蛋白的存在与功能状态，以及角膜上皮对维持角膜基质的水合和保持角膜透明的重要性。
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材料与方法
1.牛角膜上皮细胞的培养：取新鲜牛眼球无菌剖取全角膜，分离后弹力层和内皮层并去除，余角膜置D-PBS漂洗1次，于琼脂凹面板，上皮向上，加入浓度为240 U/L的Dispase II(美国Gibco公司)0.3 ml，置37℃培养40 min，使上皮层松脱。加入含10%胎牛血清、青霉素G(100 000U/L)、链霉素(100 000 U/L)的DMEM完全培养液中止消化，离心收集细胞，加入DMEM培养液重悬，移入25 ml培养瓶中，置CO2培养箱内常规培养。每周换液2次，1周后细胞生长达完全融合。以1∶3方式传代。
2.培养牛角膜上皮细胞Pf测定：Pf值的测算按Fischbarg等[5,10]报告的激光散射法进行。本研究灌注方法采用等渗液和低渗液，水通道阻滞剂应用对氯汞苯磺酸酯(p-chloromercuribenzenesulfonate,pCMBS)，恢复剂应用二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)(美国Sigma公司)。
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3.mRNA的制备：收集培养Ⅰ～Ⅲ代的牛角膜上皮细胞，采用Chomczynski和Sacchi[11]报告的RNAzol提取法提取全RNA。mRNA提纯则采用Badley等[12]报告的方法。促或抗水通道蛋白的引物(AQPs，AQPa)均由美国Oligos公司合成，各自的碱基序列分别为：AQP1s+14～+38(5′-TCAA-GAAGAAGCTCTTCTGGAGGGC-3′)；AQP1a+16～+40(5′-CAGCCCTCCAGAAGAGCTTCTTCTT-3′)；AQP5s+14～+38(5′-TGTGCTCCCTTGCCTTCTTCAAGGC-3′)；AQP5a+16～+40(5′-CCGCCTTTGAAGAAGGC-AAGGGAGA-3′)。
4.蟾卵的制备、注射与Pf值测定：按Echevarria等[5]报告的方法采集处理蟾卵。应用Picospritzer Ⅱ(美国General Valve，Fairfield)显微镜注射系统，每只卵注入液体量均为50 nl。(1)注入无菌去离子水为对照；(2)注入牛角膜上皮mRNA 50 ng；(3)牛角膜上皮mRNA 50 ng与AQP1s 2.5 ng混合注入；(4)牛角膜上皮mRNA 50 ng与AQP1a 2.5 ng混合注入;(5)牛角膜上皮mRNA 50 ng与AQP5s 2.5 ng混合注入;(6)牛角膜上皮mRNA 50 ng与AQP5a 2.5 ng混合注入。注射后4天按以往方法[5]测定：(1)转换灌注液渗透梯度(自180～15 mOsm/L)注水与注入mRNA 的蟾卵的Pf值；(2)卵细胞置于浓度0.3 mmol/L水通道阻滞剂HgCl2作用2 min后的Pf值；(3)卵细胞先经HgCl2抑制再加入水通道恢复剂β巯基乙醇5 mmol/L作用30 min后的Pf值。
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结果
1.激光散射法测定牛角膜上皮细胞Pf 值：培养牛角膜上皮细胞经测定Pf 值平均为(72±6)μm/s(n=16)；经浓度为1 mmol/L的pCMBS作用20 min后，Pf 值下降至(26±2)μm/s，显示细胞膜的水通道受到了明显的抑制；而当去除pCMBS并经浓度为5 mmol/L的DTT作用5 min后，Pf 值又恢复到原水平的80%。以上结果证明，培养牛角膜上皮细胞膜上存有水通道蛋白，其功能大部分可被汞制剂抑制。
2.蟾卵注射法测定牛角膜上皮细胞Pf 值：经测定，注水组蟾卵的Pf值平均为(14±2)μm/s(n=10);而注入自牛角膜上皮细胞提取的mRNA组，Pf值则高达(77±6)μm/s(n=20)，二者比较差异有非常显著性(t=42.47，P<0.01)。当注入mRNA的蟾卵经浓度为0.3 mmol/L的HgCl2作用后，其Pf值的88%被抑制[(21±1)μm/s]；再经β巯基乙醇处理，其Pf值又恢复到(61±8)μm/s。这充分说明，在培养的牛角膜上皮细胞内，有可被汞制剂阻滞的水通道蛋白信息编码存在。
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3.培养牛角膜上皮细胞水通道蛋白的分型:由表1可见,培养牛角膜上皮提取的mRNA与AQP5a引物混合注射组71%的Pf被抑制；而与AQP5s、AQP1a和AQP1s混合注射的各组与单纯注射角膜上皮mRNA的阳性对照组比较，该抑制作用均不明显。由此可见，培养牛角膜上皮细胞存在的水通道蛋白的信息编码属于AQP5。
表1 牛角膜上皮细胞mRNA与不同水通道蛋白
引物混合注射后蟾卵的Pf值
组别
Pf值(±s,μm/s)
AQPs
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14±3.1
mRNA
58±6.9
mRNA+AQP5s
55±3.8
mRNA+AQP5a
24±3.6
mRNA+AQP1s
56±2.8
mRNA+AQP1a
53±1.9
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讨论
角膜上皮为鳞状上皮，其主要功能是形成一层防护层，防止病原菌的侵入。此外，在角膜损伤愈合的过程中，角膜上皮也起着重要作用。目前，有关这方面的研究甚多。但是，以往对角膜上皮如何帮助角膜内皮层调节角膜基质的水化程度以保持角膜的透明性论述不多，对于角膜上皮层在维持角膜基质的水合作用认识不足。最初的研究认为，上皮剥脱后所产生的角膜水肿显示上皮细胞层具有“水泵”功能。生理学的研究发现[4]，哺乳类角膜上皮层具有较高的水渗透性，可允许水和体液以及某些离子穿过达泪液层，从而保持了角膜基质含水量的相对衡定状态。Candia和Zamudio[13]发现，在蛙角膜上皮层，氯离子可以增加水的渗透性，由此推断该上皮存在可被氯离子激活的水通道蛋白。
本研究的激光散射法测定结果表明，培养牛角膜上皮细胞的原生质膜具有相当高的水渗透能力(72 μm/s)，这与以往的研究结果相似。同时发现，上皮细胞的这种水渗透力可被1 mmol/L的pCMBS部分抑制，而这种抑制作用在DTT的作用下消失。自培养牛角膜上皮细胞内提取的mRNA注入蟾卵的研究结果发现，该mRNA可以明显增高蟾卵的水渗透力(Pf=77 μm/s)，0.3 mmol/L的HgCl2可以88%抑制该渗透功能，β巯基乙醇可以消除HgCl2的抑制作用。以上充分证明，牛角膜上皮细胞存在典型的对汞制剂敏感的具有水通道功能的蛋白信息编码。
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另外，通过蟾卵内混合注入上皮细胞提取的mRNA和促或抗水通道蛋白合成的引物的研究结果表明 ，该上皮细胞所含有的水通道蛋白属AQP5。
综上所述，本研究结果表明，培养的牛角膜上皮细胞内含有具有较高水渗透功能的AQP5。该蛋白在上皮细胞发挥的功能，对维持角膜基质的相对脱水、保持角膜的透明具有重要意义。该研究对重新认识角膜上皮的生理功能，提醒临床医生在手术或用药过程中注意对角膜上皮的保护至关重要。
基金项目:美国NIH基金资助项目(EY06178)
作者单位:康凤英(261042 山东省潍坊医学院眼科研究所)
Kunyan Kuang(Departments of Physiology and Cellular Biophysics, and Ophthalmology, Columbia University, New York, USA)
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Jorge Fischbarg(Departments of Physiology and Cellular Biophysics, and Ophthalmology, Columbia University, New York, USA)
参考文献
1，Mishima S ,Hedbys BO .The permeability of the corneal epithelium and endothelium to water.Exp Eye Res,1967,6:10-32.
2，Preston GM,Agre P. Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons:member of an ancient channel family.Proc Natl Acad Sci USA,1991, 88:11110-11114.
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3，Preston GM,Carroll TP,Guggino WB,et al.Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein.Science,1992,256(5055):385-387.
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5，Echevarria M,Kuang K,Iserovich P, et al.Cultured bovine corneal endothelial cells express CHIP28 water channels.Am J Physiol, 1993,265(Cells Physiol 34):C1349-C1355.
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6，Nielsen S,Smith BL,Christensen EI,et al.Distribution of the aquaporin CHIP in secretory and resorptive epithelia and capillary endothelia.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:7275-7279.
7，Stamer WD,Snyder RW,Smith BL,et al.Localization of aquaporin CHIP in the human eye:implications in the pathogenesis of glaucoma and other disorders of ocular fluid balance.Invest Ophthalmol Vis Sci,1994,35:3867-3872.
8，Stamer WD, Seftor REB, Snyder RW , et al.Cultured human trabecular meshwork cells express aquaporin-1 water channels.Curr Eye Res,1995,14:1095-1100.
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10，Fischbarg J, Li J,Kuang K,et al.Determination of volume and water permeability of plated cells from measurements of light scattering .Am J Physiol, 1993,265(Cells Physiol 34):C1412-C1423.
11，Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156-159.
12，Badley JE, Bishop GA, St John T,et al. A Simple,rapid method for the purification of poly A+ RNA.Biotechniques,1988,6:114-116.
13，Candia OA, Zamudio AC. Chloride-activated water permeability in the frog corneal epithelium. J Membr Biol,1995,143:259-266., 百拇医药