揭取Descemet膜方法的技术改进和角膜内皮细胞培养
揭取Descemet膜方法的技术改进和角膜内皮细胞培养
宋忆淑 张瑞雪 邹啸环
关键词：角膜；内皮细胞 在角膜内皮细胞培养中，如取材不当，易丢失和污染角膜内皮细胞。为此，我们对角膜内皮细胞的取材方法予以改进，并进行了角膜内皮细胞培养，取得成功，现介绍如下。
一、材料和方法
1.动物：选择国产大白兔，将其经耳缘静脉注气处死，立即在无菌条件下摘除眼球，置于0.6 U/L庆大霉素溶液中浸泡30 min，然后置于净化工作台上，将眼球移入无菌平皿中，于角巩缘内1 mm处取下全周角膜片，在Hank液中漂洗待用。
2.设备及器械: 解剖显微镜。无菌烧杯, 平皿, 2把眼科显微手术镊子,双面刀片及显微手术用刀柄或小止血钳。
, http://www.100md.com
3.方法: 将角膜片内皮面向上置于无菌平皿中，在解剖显微镜下用刀片自角膜中心偏外处向边缘轻划一下，即可见附有角膜内皮细胞的Descemet膜出现一裂口，且边缘上卷，左手用镊子压住向上卷起的Descemet膜向下剥，或者右手换镊子夹住卷起的Descemet膜并将其撕下。一般数秒钟即可取下完整的带有内皮细胞的Descemet膜(图1,2)。可将带有内皮细胞的 Descemet膜经胰蛋白酶消化，提取纯内皮细胞,种植于24孔组织培养板中,可见生长良好、单层无基质细胞及细菌污染的纯角膜内皮细胞(图3,4)。
二、结果
1.原代细胞培养：原代兔角膜内皮细胞种植24 h后可附着于培养板的底部，48 h后细胞向周围移行并增殖，2～3周内形成大片单层内皮细胞，当其贴壁后即成扁平多角形。新生的内皮细胞向周围移行增殖，细胞生长呈三角形至六角形不等，连接紧密，形成良好的单层。在角膜内皮细胞原代培养中，细胞分裂指数较低，约0.3%～0.4%,其指数增生期出现的时间与种植的细胞多少呈正相关，指数增生期出现的时间在接种后的4或5 d至2～3周,细胞达密集状态的时间约2～4周，如不进行传代培养，细胞生长即进入停止期，并在胞浆内开始出现粗大颗粒及空泡等衰老征象，逐渐出现细胞的死亡和脱落。
, 百拇医药
2.传代细胞培养方法： 原代培养的细胞置于0.25% 胰蛋白酶溶液中消化5 min后，按1∶1、1∶2及1∶3接种传代，传代细胞12 h内即可见明显贴壁，约3～5 d可达密集状态，可继续传代，一般可传4或5代，传3、4代的内皮细胞有稳定的形态结构，成单层多角形，胞体较大，排列欠规则。一般一代细胞可倍增3～6次。
3.角膜内皮细胞培养：在24孔培养板中设置6个孔, 每孔种植3～5个角膜内皮细胞，其增殖速度缓慢，指数增生期出现在2～3周之后, 待成片生长后, 经1∶1反复传代4次, 于培养50 d后内皮细胞可达到密集状态。
4.混合细胞培养：实验中发现, 角膜内皮细胞在纯培养中难以增殖或增殖速度缓慢, 但如果角膜内皮细胞中有基质细胞污染，则角膜内皮细胞的增殖速度可明显加快。
三、讨论
, http://www.100md.com 1.原代细胞培养：我们采用的方法能够充分利用供体材料，获得的细胞纯, 不易被其他细胞污染, 但操作时应注意动作要轻、快, 尽量缩短操作时间，减少细菌污染的机会。揭取角膜Descemet膜后，应在Hank液中漂洗2次，同时注意更换镊子夹持的部位，避免基质细胞的污染。消化液应分装保存，避免使用时反复复温解冻，使消化液的效价降低。在酶化时，避免酶化时间过长，致使细胞破坏死亡。
2.传代角膜内皮细胞培养: 传代时间一般选择细胞接种后的2～3周，此时细胞生长状态良好。传代后的细胞贴壁增殖速度加快, 代谢也明显旺盛,应密切注意营养液的pH值变化, 及时更换培养液,避免细胞中毒死亡。传代的频率或间隔与接种细胞数量、细胞生物性状以及营养液的性质有关。接种的细胞数量大、连续细胞系及培养液中血清含量多时，细胞贴壁、生长的时间快，传代间隔时间短；反之，细胞贴壁、生长时间慢，传代间隔时间长。
3.混合培养的角膜内皮细胞：与基质细胞混合培养的角膜内皮细胞,其增殖速度有明显增加, 这与角膜基质中的成纤维细胞能提供内皮细胞贴附和分化的物理底物(胶原和纤维素等)或分泌一种成纤维细胞因子, 能特别地促进角膜内皮细胞DNA的起始合成和细胞增生。对这种混合培养可经过传代培养，以期解决纯化。
, 百拇医药
总之，我们对少量角膜内皮细胞进行传代培养, 取得了初步成功, 这为利用自体角膜内皮细胞进行培养、移植, 提供了新的研究线索。
图1，2 轻划开Descemdt膜，基边缘上郑剥离×20
图3 角膜内皮细胞原代培养第8天×100
图4 角膜内皮细胞传代培养第4代第50天×100
作者单位：宋忆淑(130062 长春，解放军第二○八医院眼科)
张瑞雪(白求恩医科大学第三临床学院眼科)
邹啸环(解放军军需大学中心实验室), 百拇医药
宋忆淑 张瑞雪 邹啸环
关键词：角膜；内皮细胞 在角膜内皮细胞培养中，如取材不当，易丢失和污染角膜内皮细胞。为此，我们对角膜内皮细胞的取材方法予以改进，并进行了角膜内皮细胞培养，取得成功，现介绍如下。
一、材料和方法
1.动物：选择国产大白兔，将其经耳缘静脉注气处死，立即在无菌条件下摘除眼球，置于0.6 U/L庆大霉素溶液中浸泡30 min，然后置于净化工作台上，将眼球移入无菌平皿中，于角巩缘内1 mm处取下全周角膜片，在Hank液中漂洗待用。
2.设备及器械: 解剖显微镜。无菌烧杯, 平皿, 2把眼科显微手术镊子,双面刀片及显微手术用刀柄或小止血钳。
, http://www.100md.com
3.方法: 将角膜片内皮面向上置于无菌平皿中，在解剖显微镜下用刀片自角膜中心偏外处向边缘轻划一下，即可见附有角膜内皮细胞的Descemet膜出现一裂口，且边缘上卷，左手用镊子压住向上卷起的Descemet膜向下剥，或者右手换镊子夹住卷起的Descemet膜并将其撕下。一般数秒钟即可取下完整的带有内皮细胞的Descemet膜(图1,2)。可将带有内皮细胞的 Descemet膜经胰蛋白酶消化，提取纯内皮细胞,种植于24孔组织培养板中,可见生长良好、单层无基质细胞及细菌污染的纯角膜内皮细胞(图3,4)。
二、结果
1.原代细胞培养：原代兔角膜内皮细胞种植24 h后可附着于培养板的底部，48 h后细胞向周围移行并增殖，2～3周内形成大片单层内皮细胞，当其贴壁后即成扁平多角形。新生的内皮细胞向周围移行增殖，细胞生长呈三角形至六角形不等，连接紧密，形成良好的单层。在角膜内皮细胞原代培养中，细胞分裂指数较低，约0.3%～0.4%,其指数增生期出现的时间与种植的细胞多少呈正相关，指数增生期出现的时间在接种后的4或5 d至2～3周,细胞达密集状态的时间约2～4周，如不进行传代培养，细胞生长即进入停止期，并在胞浆内开始出现粗大颗粒及空泡等衰老征象，逐渐出现细胞的死亡和脱落。
, 百拇医药
2.传代细胞培养方法： 原代培养的细胞置于0.25% 胰蛋白酶溶液中消化5 min后，按1∶1、1∶2及1∶3接种传代，传代细胞12 h内即可见明显贴壁，约3～5 d可达密集状态，可继续传代，一般可传4或5代，传3、4代的内皮细胞有稳定的形态结构，成单层多角形，胞体较大，排列欠规则。一般一代细胞可倍增3～6次。
3.角膜内皮细胞培养：在24孔培养板中设置6个孔, 每孔种植3～5个角膜内皮细胞，其增殖速度缓慢，指数增生期出现在2～3周之后, 待成片生长后, 经1∶1反复传代4次, 于培养50 d后内皮细胞可达到密集状态。
4.混合细胞培养：实验中发现, 角膜内皮细胞在纯培养中难以增殖或增殖速度缓慢, 但如果角膜内皮细胞中有基质细胞污染，则角膜内皮细胞的增殖速度可明显加快。
三、讨论
, http://www.100md.com 1.原代细胞培养：我们采用的方法能够充分利用供体材料，获得的细胞纯, 不易被其他细胞污染, 但操作时应注意动作要轻、快, 尽量缩短操作时间，减少细菌污染的机会。揭取角膜Descemet膜后，应在Hank液中漂洗2次，同时注意更换镊子夹持的部位，避免基质细胞的污染。消化液应分装保存，避免使用时反复复温解冻，使消化液的效价降低。在酶化时，避免酶化时间过长，致使细胞破坏死亡。
2.传代角膜内皮细胞培养: 传代时间一般选择细胞接种后的2～3周，此时细胞生长状态良好。传代后的细胞贴壁增殖速度加快, 代谢也明显旺盛,应密切注意营养液的pH值变化, 及时更换培养液,避免细胞中毒死亡。传代的频率或间隔与接种细胞数量、细胞生物性状以及营养液的性质有关。接种的细胞数量大、连续细胞系及培养液中血清含量多时，细胞贴壁、生长的时间快，传代间隔时间短；反之，细胞贴壁、生长时间慢，传代间隔时间长。
3.混合培养的角膜内皮细胞：与基质细胞混合培养的角膜内皮细胞,其增殖速度有明显增加, 这与角膜基质中的成纤维细胞能提供内皮细胞贴附和分化的物理底物(胶原和纤维素等)或分泌一种成纤维细胞因子, 能特别地促进角膜内皮细胞DNA的起始合成和细胞增生。对这种混合培养可经过传代培养，以期解决纯化。
, 百拇医药
总之，我们对少量角膜内皮细胞进行传代培养, 取得了初步成功, 这为利用自体角膜内皮细胞进行培养、移植, 提供了新的研究线索。
图1，2 轻划开Descemdt膜，基边缘上郑剥离×20
图3 角膜内皮细胞原代培养第8天×100
图4 角膜内皮细胞传代培养第4代第50天×100
作者单位：宋忆淑(130062 长春，解放军第二○八医院眼科)
张瑞雪(白求恩医科大学第三临床学院眼科)
邹啸环(解放军军需大学中心实验室), 百拇医药