眼眶横纹肌肉瘤N-ras癌基因点突变及rasp21、p53蛋白的异常表达
眼眶横纹肌肉瘤N-ras癌基因点突变及rasp21、p53蛋白的异常表达
张虹 宋国祥 张淑敏 畅继武 张维铭 余虹
摘 要 目的 研究眼眶横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS )N-ras癌基因点突变、rasp21、p53蛋白的异常表达，探讨基因突变在眼眶RMS发病中的作用。方法 应用特异性高突变区位不同的突变型寡核苷酸探针及突变型rasp21、p53单克隆抗体，对21例眼眶RMS组织进行DNA 斑点杂交和免疫组织化学分析。结果 4例眼眶RMS细胞中发生N-ras癌基因12密码子第2个碱基突变，5例眼眶RMS组织中发生61密码子第3个碱基突变，其中2例同时有2个密码子碱基突变。免疫组织化学检测，rasp21及p53蛋白阳性表达增强者分别为9例和16例，rasp21、p53蛋白阳性表达增强者其预后较无异常表达者差。结论 眼眶RMS组织中癌基因ras和抑癌基因p53突变，在眼眶RMS发病中起重要作用。
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关键词：横纹肌肉瘤；眼眶；癌基因
眼眶横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是一种多发于儿童的恶性肿瘤。眼眶RMS发病急，发展快，早期即可有血行转移，预后不良。有关RMS的病理组织学分型与预后的关系目前尚未确定[1]。为此，笔者应用特异性高突变区位不同的突变型寡核苷酸探针及突变型rasp21及p53单克隆抗体，对本院1987～1993年经手术或活检的21例眼眶RMS组织标本进行 N-ras癌基因点突变及rasp21、p53 蛋白表达的研究，旨在探讨癌基因突变在眼眶RMS发病中的作用。
材料与方法
一、标本来源
收集本院1987～1993年经病理组织学证实的21例眼眶RMS组织标本，男性18例，女性3例；年龄1～51岁，平均11.4岁。其中胚胎型17例，腺泡型2例，多形性2例。随访时间0.5～2.0年，2年内肿瘤无复发者4例，复发者4例，死亡者5例，失访者8例。正常对照为14例眼外肌手术切取的眼外肌组织标本。
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二、N-ras癌基因点突变
1.肿瘤组织和正常对照组织中DNA的提取：将肿瘤组织蜡块切成厚5μm的切片， 经二甲苯脱蜡，无水乙醇漂洗、沉淀；正常对照组织置于液氮内30 min后研成细粉，以含有蛋白酶K(终浓度0.2 mg/L)的DNA消化缓冲液进行消化，再以等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，无水乙醇沉淀，用紫外分光光度计测定吸光度A260和A280值。
2.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)：(1)引物设计与合成：针对N-ras基因12、13和61密码子，选择适当的碱基片段作为引物(由中国科学院微生物研究所合成)(表1)，经电脑引物设计检查软件分析，去除存在的发卡结构，两引物之间无4个以上碱基对互补序列，无大于4个核苷酸的同源序列。C+G 含量为40%～60%，解链温度(melting temperature,Tm)56～60℃。(2)PCR扩增及结果分析：将引物Ⅰ、Ⅱ、DNA样品与4种dNTP及PCR缓冲液混合后，置97 ℃变性10 min，使双链DNA充分解链，再迅速加入Taq DNA聚合酶2.5 U(华美生物工程公司产品)。按下列程序进行循环：94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min。反应共进行30个循环，终末循环在72 ℃中延伸7 min。 扩增产物用2 % 琼脂糖凝胶电泳分析结果。以pBR322/HaeⅢ为分子量标准物，电压5 V/cm胶长，电泳1 h，入射紫外光下观察特异性扩增带。
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表1 N-ras癌基因引物序列
引物
序列
位置
扩增碱基
片段长度
N-ras12+13
5′-GACTGAGTACAAACT
GGTGG(20mer)
3～22
81
3′-GTCGATTAGGTCTTG
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GTGAA(20mer)
64～83
N-ras61
5′-GTTATAGATGGTGAA
ACCTG(20mer)
133～152
115
3′-CCGAAGGAGACACAT
AAACG(20mer)
229～248
3.寡核苷酸探针杂交：(1)寡核苷酸探针的设计、合成及标记：N-ras癌基因探针为针对12、13及61密码子突变热点所设计的突变型单链探针(中国科学院微生物研究所合成)，分别探查3个密码子第2、1及3个碱基是否有突变。序列如下：
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N-ras12：5′-GGAGCAG(ACT)TGGTGTTGGGAA-3′
N-ras13：5′-GGAGCAGGT(ATC)GTGTTGGGAA-3′
N-ras61：5′-ACAGCTGGACA(CTG)GAAGAGTA-3′
放射性同位素[γ-32P]ATP放射性活度>1.85×1014 Bq(亚辉生物医学工程公司)，利用T4多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记寡核苷酸探针5′-末端。(2)分子杂交：将肿瘤组织及对照组织行PCR，扩增产物加热煮沸10 min，使其充分变性，再用负压吸引器将PCR产物10 μl滴于尼龙膜上，经预杂交后，按0.2 ml/cm2膜加入杂交液和标记的探针(终浓度0.05 mg/L)，将杂交袋排尽气泡封口后，置68 ℃摇床中杂交18～20 h，取出杂交膜，洗膜后，置 -70 ℃放射自显影24 h，备用。
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三、rasp21、p53蛋白表达
将石蜡包埋的RMS组织块切成厚5μm的切片。正常对照组手术切除的眼外肌组织制作冰冻切片，置丙酮液中固定5 min，4 ℃冰箱保存备用。应用生物素-抗生物素蛋白复合物 (avidin biotin complex，ABC)法染色，观察rasp21和p53蛋白产物的表达。另取p21、p53蛋白阳性表达的肾腺癌病例(天津泌尿外科研究所提供)作为阳性对照，用Tris盐酸缓冲液(TBS) 取代第1抗体作为阴性对照。rasp21及p53单克隆抗体[panras(132),p53(DO-1)](广东中山试剂公司)，抗体稀释度分别为1∶10和1∶20。
结果
一、N-ras基因点突变的检测
[γ-32p]ATP标记的寡核苷酸探针与PCR产物的斑点杂交：N-ras癌基因12位密码子第2个碱基鸟嘌呤核苷酸(G)发生突变者4例(19.1%，图1)，13位密码子未见突变，61位密码子第3 个碱基腺嘌呤核苷酸(A)发生突变者5例(23.8%，图2)，其中2例同时有2个密码子的碱基突变。14例正常眼外肌组织未见基因突变，两组间比较差异有显著性间(P=0.017)。RMS患者癌基因突变率高于正常人。在有基因突变的7例患者中，胚胎型RMS 6例，多形性RMS 1例。
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图1 81bp的PCR 产物与突变型寡核苷酸探针(N-ras12)
进行斑点杂交，基因突变者显示放射斑点(1～3，10为突变阳性病例)
图2 115 bp的PCR产物与突变型寡核苷酸探针(N-ras61)进行斑点杂交，基因突变者显示放射斑点(1～3，5，6为突变阳性病例)
二、rasp21、p53蛋白免疫组织化学检测
21例眼眶RMS中，免疫组织化学检测p21蛋白阳性表达增强者9例(42.9%)，阳性细胞胞核呈蓝色，胞浆或胞膜呈棕黄色(图3)，p21蛋白阳性表达位于胞浆或胞膜；p53蛋白阳性表达增强者16例(76.2%)，表现为细胞核呈棕黄色(图4)。p21及p53蛋白阳性表达同时增强者9例，14例正常眼外肌组织均无rasp21、p53蛋白的阳性表达增强，两组比较差异有非常显著性(P=5.012×10-6)，说明RMS患者p21，p53蛋白阳性表达率高于正常人。
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图3 rasp21蛋白阳性细胞的细胞核呈蓝色，胞浆或胞膜呈棕黄色 免疫组织化学染色×400
图4 P53蛋白阳性细胞的胞核呈蓝色，免疫组织化学染色×400
讨论
一、眼眶RMS N-ras基因点突变
有关RMS 癌基因蛋白的表达，国外已有文献报道，但结果尚不一致。Stratton等[2]在对21例RMS研究中发现5例ras癌基因突变。Bos等[3]在RMS细胞系研究中也发现ras癌基因突变。Mulligan等[4]对241例肿瘤进行了p53基因分析，发现RMS中p53位点等位基因缺失。而Felix等[5]在6例RMS研究中检测到2例p53基因突变。
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有关ras家族基因点突变的文献报道较多，主要在第12、13和61位密码子，导致其蛋白产物p21基因的结构异常，并与细胞癌变有关。笔者应用突变型特异性寡核苷酸探针及rasp21、p53单克隆抗体，对21例石蜡包埋的眼眶RMS组织和14例正常人眼外肌组织分别探查N-ras癌基因点突变及rasp21、p53蛋白的表达。斑点杂交结果显示，4例眼眶肿瘤组织表现为N-ras基因12密码子第2个碱基鸟嘌呤核苷酸(G)的突变，5例眼眶肿瘤组织表现为61密码子第3个碱基腺嘌呤核苷酸(A)的突变，其中2例同时含有2个密码子的碱基突变，突变率为33.3%，与文献报道相似。7例N-ras 基因点突变的眼眶肿瘤组织中，胚胎型RMS 6例，多形性RMS 1例，腺泡型RMS则未发生突变。胚胎型RMS 发生点突变占大多数，似乎点突变更多发生于胚胎型RMS，这是由于从RMS的病理组织学分型来看，胚胎型RMS占60%[6]，所以其发生N-ras基因点突变的人数自然较其他2型RMS多。文献报道5 例ras基因突变均发生在胚胎型RMS[2]，因此认为可能是由于其他二型RMS 占全部肿瘤的比例比较小的缘故。
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二、眼眶RMS rasp21、p53蛋白表达
本研究应用p21,p53单克隆抗体对21例石蜡包埋的眼眶RMS组织进行免疫组织化学分析，检测眼眶RMS组织中p21,p53基因蛋白的异常表达情况。结果发现，p53蛋白阳性表达16例，p21蛋白阳性表达9例(p53亦同时阳性)，均阴性5例，两种表达一致性检验χ2= 4.84，P<0.05，说明有一致性；两者差异检验，χ2M=5.14，P<0.05，p53蛋白阳性表达率高于p21。显示在检测眼眶RMS时，p53蛋白阳性表达率较p21高。为消除假阳性的可能，同时观察肿瘤外其他成分，未见阳性反应。提示p21、p53蛋白阳性表达增强，说明突变的ras和p53编码的蛋白在眼眶RMS发生、发展过程中起重要作用。尤其是p53蛋白阳性表达作用更为明显。本组结果显示，p21与p53蛋白可同时阳性表达， 证实了肿瘤多基因协同作用的学说。
作者单位：张虹(300211 天津医科大学第二医院眼科)
, 百拇医药
宋国祥(300211 天津医科大学第二医院眼科)
张淑敏(天津泌尿外科研究所)
畅继武(天津泌尿外科研究所)
张维铭(天津医科大学分子生物学实验中心)
余虹(天津医科大学分子生物学实验中心)
参考文献
1.李凤鸣，主编.眼科全书.北京：人民卫生出版社，1996.1164-1165.
2.Stratton MR, Fisher C, Gusterson BA, et al.Detection of point mutations in N-ras and K-ras genes of human embryonal rhabdomyosarcomas using oligonucleotide probes and the polymerase chain reaction.Cancer Res,1989,49:6324-6337.
, 百拇医药
3.Bos JL, Verlaan-de Vries M, Jansen AM,et al.Three different mutations in codon 61 of the human N-ras gene detected by synthetic oligonucleotide hybridization.Nucleic Acids Res,1984,12:9155-9163.
4.Mulligan LM, Matlashewski GJ, Scrable HJ, et al. Machanisms of p53 loss in human sarcomas.Proc Natl Acad Sci U S A,1990,87：5863-5867.
5.Felix CA, Kappel CC, Mitsudomi T, et al. Frequency and diversity of p53 mutations in childhood rhabdomyosarcoma. Cancer Res,1992,52:2243-2247.
6.上海第一医学院眼耳鼻喉科医院眼科教研组.眼科学.北京：人民卫生出版社，1977.473-474., 百拇医药
张虹 宋国祥 张淑敏 畅继武 张维铭 余虹
摘 要 目的 研究眼眶横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS )N-ras癌基因点突变、rasp21、p53蛋白的异常表达，探讨基因突变在眼眶RMS发病中的作用。方法 应用特异性高突变区位不同的突变型寡核苷酸探针及突变型rasp21、p53单克隆抗体，对21例眼眶RMS组织进行DNA 斑点杂交和免疫组织化学分析。结果 4例眼眶RMS细胞中发生N-ras癌基因12密码子第2个碱基突变，5例眼眶RMS组织中发生61密码子第3个碱基突变，其中2例同时有2个密码子碱基突变。免疫组织化学检测，rasp21及p53蛋白阳性表达增强者分别为9例和16例，rasp21、p53蛋白阳性表达增强者其预后较无异常表达者差。结论 眼眶RMS组织中癌基因ras和抑癌基因p53突变，在眼眶RMS发病中起重要作用。
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关键词：横纹肌肉瘤；眼眶；癌基因
眼眶横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是一种多发于儿童的恶性肿瘤。眼眶RMS发病急，发展快，早期即可有血行转移，预后不良。有关RMS的病理组织学分型与预后的关系目前尚未确定[1]。为此，笔者应用特异性高突变区位不同的突变型寡核苷酸探针及突变型rasp21及p53单克隆抗体，对本院1987～1993年经手术或活检的21例眼眶RMS组织标本进行 N-ras癌基因点突变及rasp21、p53 蛋白表达的研究，旨在探讨癌基因突变在眼眶RMS发病中的作用。
材料与方法
一、标本来源
收集本院1987～1993年经病理组织学证实的21例眼眶RMS组织标本，男性18例，女性3例；年龄1～51岁，平均11.4岁。其中胚胎型17例，腺泡型2例，多形性2例。随访时间0.5～2.0年，2年内肿瘤无复发者4例，复发者4例，死亡者5例，失访者8例。正常对照为14例眼外肌手术切取的眼外肌组织标本。
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二、N-ras癌基因点突变
1.肿瘤组织和正常对照组织中DNA的提取：将肿瘤组织蜡块切成厚5μm的切片， 经二甲苯脱蜡，无水乙醇漂洗、沉淀；正常对照组织置于液氮内30 min后研成细粉，以含有蛋白酶K(终浓度0.2 mg/L)的DNA消化缓冲液进行消化，再以等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，无水乙醇沉淀，用紫外分光光度计测定吸光度A260和A280值。
2.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)：(1)引物设计与合成：针对N-ras基因12、13和61密码子，选择适当的碱基片段作为引物(由中国科学院微生物研究所合成)(表1)，经电脑引物设计检查软件分析，去除存在的发卡结构，两引物之间无4个以上碱基对互补序列，无大于4个核苷酸的同源序列。C+G 含量为40%～60%，解链温度(melting temperature,Tm)56～60℃。(2)PCR扩增及结果分析：将引物Ⅰ、Ⅱ、DNA样品与4种dNTP及PCR缓冲液混合后，置97 ℃变性10 min，使双链DNA充分解链，再迅速加入Taq DNA聚合酶2.5 U(华美生物工程公司产品)。按下列程序进行循环：94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min。反应共进行30个循环，终末循环在72 ℃中延伸7 min。 扩增产物用2 % 琼脂糖凝胶电泳分析结果。以pBR322/HaeⅢ为分子量标准物，电压5 V/cm胶长，电泳1 h，入射紫外光下观察特异性扩增带。
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表1 N-ras癌基因引物序列
引物
序列
位置
扩增碱基
片段长度
N-ras12+13
5′-GACTGAGTACAAACT
GGTGG(20mer)
3～22
81
3′-GTCGATTAGGTCTTG
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GTGAA(20mer)
64～83
N-ras61
5′-GTTATAGATGGTGAA
ACCTG(20mer)
133～152
115
3′-CCGAAGGAGACACAT
AAACG(20mer)
229～248
3.寡核苷酸探针杂交：(1)寡核苷酸探针的设计、合成及标记：N-ras癌基因探针为针对12、13及61密码子突变热点所设计的突变型单链探针(中国科学院微生物研究所合成)，分别探查3个密码子第2、1及3个碱基是否有突变。序列如下：
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N-ras12：5′-GGAGCAG(ACT)TGGTGTTGGGAA-3′
N-ras13：5′-GGAGCAGGT(ATC)GTGTTGGGAA-3′
N-ras61：5′-ACAGCTGGACA(CTG)GAAGAGTA-3′
放射性同位素[γ-32P]ATP放射性活度>1.85×1014 Bq(亚辉生物医学工程公司)，利用T4多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记寡核苷酸探针5′-末端。(2)分子杂交：将肿瘤组织及对照组织行PCR，扩增产物加热煮沸10 min，使其充分变性，再用负压吸引器将PCR产物10 μl滴于尼龙膜上，经预杂交后，按0.2 ml/cm2膜加入杂交液和标记的探针(终浓度0.05 mg/L)，将杂交袋排尽气泡封口后，置68 ℃摇床中杂交18～20 h，取出杂交膜，洗膜后，置 -70 ℃放射自显影24 h，备用。
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三、rasp21、p53蛋白表达
将石蜡包埋的RMS组织块切成厚5μm的切片。正常对照组手术切除的眼外肌组织制作冰冻切片，置丙酮液中固定5 min，4 ℃冰箱保存备用。应用生物素-抗生物素蛋白复合物 (avidin biotin complex，ABC)法染色，观察rasp21和p53蛋白产物的表达。另取p21、p53蛋白阳性表达的肾腺癌病例(天津泌尿外科研究所提供)作为阳性对照，用Tris盐酸缓冲液(TBS) 取代第1抗体作为阴性对照。rasp21及p53单克隆抗体[panras(132),p53(DO-1)](广东中山试剂公司)，抗体稀释度分别为1∶10和1∶20。
结果
一、N-ras基因点突变的检测
[γ-32p]ATP标记的寡核苷酸探针与PCR产物的斑点杂交：N-ras癌基因12位密码子第2个碱基鸟嘌呤核苷酸(G)发生突变者4例(19.1%，图1)，13位密码子未见突变，61位密码子第3 个碱基腺嘌呤核苷酸(A)发生突变者5例(23.8%，图2)，其中2例同时有2个密码子的碱基突变。14例正常眼外肌组织未见基因突变，两组间比较差异有显著性间(P=0.017)。RMS患者癌基因突变率高于正常人。在有基因突变的7例患者中，胚胎型RMS 6例，多形性RMS 1例。
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图1 81bp的PCR 产物与突变型寡核苷酸探针(N-ras12)
进行斑点杂交，基因突变者显示放射斑点(1～3，10为突变阳性病例)
图2 115 bp的PCR产物与突变型寡核苷酸探针(N-ras61)进行斑点杂交，基因突变者显示放射斑点(1～3，5，6为突变阳性病例)
二、rasp21、p53蛋白免疫组织化学检测
21例眼眶RMS中，免疫组织化学检测p21蛋白阳性表达增强者9例(42.9%)，阳性细胞胞核呈蓝色，胞浆或胞膜呈棕黄色(图3)，p21蛋白阳性表达位于胞浆或胞膜；p53蛋白阳性表达增强者16例(76.2%)，表现为细胞核呈棕黄色(图4)。p21及p53蛋白阳性表达同时增强者9例，14例正常眼外肌组织均无rasp21、p53蛋白的阳性表达增强，两组比较差异有非常显著性(P=5.012×10-6)，说明RMS患者p21，p53蛋白阳性表达率高于正常人。
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图3 rasp21蛋白阳性细胞的细胞核呈蓝色，胞浆或胞膜呈棕黄色 免疫组织化学染色×400
图4 P53蛋白阳性细胞的胞核呈蓝色，免疫组织化学染色×400
讨论
一、眼眶RMS N-ras基因点突变
有关RMS 癌基因蛋白的表达，国外已有文献报道，但结果尚不一致。Stratton等[2]在对21例RMS研究中发现5例ras癌基因突变。Bos等[3]在RMS细胞系研究中也发现ras癌基因突变。Mulligan等[4]对241例肿瘤进行了p53基因分析，发现RMS中p53位点等位基因缺失。而Felix等[5]在6例RMS研究中检测到2例p53基因突变。
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有关ras家族基因点突变的文献报道较多，主要在第12、13和61位密码子，导致其蛋白产物p21基因的结构异常，并与细胞癌变有关。笔者应用突变型特异性寡核苷酸探针及rasp21、p53单克隆抗体，对21例石蜡包埋的眼眶RMS组织和14例正常人眼外肌组织分别探查N-ras癌基因点突变及rasp21、p53蛋白的表达。斑点杂交结果显示，4例眼眶肿瘤组织表现为N-ras基因12密码子第2个碱基鸟嘌呤核苷酸(G)的突变，5例眼眶肿瘤组织表现为61密码子第3个碱基腺嘌呤核苷酸(A)的突变，其中2例同时含有2个密码子的碱基突变，突变率为33.3%，与文献报道相似。7例N-ras 基因点突变的眼眶肿瘤组织中，胚胎型RMS 6例，多形性RMS 1例，腺泡型RMS则未发生突变。胚胎型RMS 发生点突变占大多数，似乎点突变更多发生于胚胎型RMS，这是由于从RMS的病理组织学分型来看，胚胎型RMS占60%[6]，所以其发生N-ras基因点突变的人数自然较其他2型RMS多。文献报道5 例ras基因突变均发生在胚胎型RMS[2]，因此认为可能是由于其他二型RMS 占全部肿瘤的比例比较小的缘故。
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二、眼眶RMS rasp21、p53蛋白表达
本研究应用p21,p53单克隆抗体对21例石蜡包埋的眼眶RMS组织进行免疫组织化学分析，检测眼眶RMS组织中p21,p53基因蛋白的异常表达情况。结果发现，p53蛋白阳性表达16例，p21蛋白阳性表达9例(p53亦同时阳性)，均阴性5例，两种表达一致性检验χ2= 4.84，P<0.05，说明有一致性；两者差异检验，χ2M=5.14，P<0.05，p53蛋白阳性表达率高于p21。显示在检测眼眶RMS时，p53蛋白阳性表达率较p21高。为消除假阳性的可能，同时观察肿瘤外其他成分，未见阳性反应。提示p21、p53蛋白阳性表达增强，说明突变的ras和p53编码的蛋白在眼眶RMS发生、发展过程中起重要作用。尤其是p53蛋白阳性表达作用更为明显。本组结果显示，p21与p53蛋白可同时阳性表达， 证实了肿瘤多基因协同作用的学说。
作者单位：张虹(300211 天津医科大学第二医院眼科)
, 百拇医药
宋国祥(300211 天津医科大学第二医院眼科)
张淑敏(天津泌尿外科研究所)
畅继武(天津泌尿外科研究所)
张维铭(天津医科大学分子生物学实验中心)
余虹(天津医科大学分子生物学实验中心)
参考文献
1.李凤鸣，主编.眼科全书.北京：人民卫生出版社，1996.1164-1165.
2.Stratton MR, Fisher C, Gusterson BA, et al.Detection of point mutations in N-ras and K-ras genes of human embryonal rhabdomyosarcomas using oligonucleotide probes and the polymerase chain reaction.Cancer Res,1989,49:6324-6337.
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3.Bos JL, Verlaan-de Vries M, Jansen AM,et al.Three different mutations in codon 61 of the human N-ras gene detected by synthetic oligonucleotide hybridization.Nucleic Acids Res,1984,12:9155-9163.
4.Mulligan LM, Matlashewski GJ, Scrable HJ, et al. Machanisms of p53 loss in human sarcomas.Proc Natl Acad Sci U S A,1990,87：5863-5867.
5.Felix CA, Kappel CC, Mitsudomi T, et al. Frequency and diversity of p53 mutations in childhood rhabdomyosarcoma. Cancer Res,1992,52:2243-2247.
6.上海第一医学院眼耳鼻喉科医院眼科教研组.眼科学.北京：人民卫生出版社，1977.473-474., 百拇医药