三磷酸腺苷生物发光法在卵巢癌细胞株药物敏感试验中的应用
三磷酸腺苷生物发光法在卵巢癌细胞株药物敏感试验中的应用
楼江燕 彭芝兰 刘珊玲 王和
关键词：三磷酸腺苷；生物发光法；卵巢癌；细胞株；药物敏感试验 1983年,Moyer等提出内源性三磷酸腺苷(ATP)的数量可以反映细胞的活性度。随后Kangas等提出三磷酸腺苷生物发光 (ATP-CVA) 法这一新的药物敏感(药敏)试验方法。ATP-CVA的原理为，内源性ATP是活体细胞最基本的能量来源，细胞死亡时,由于有ATP酶的存在,ATP迅速水解。细胞内的ATP与荧光素-荧光素酶复合物作用产生可测定光，测定所产生的光，从而可获得ATP的数量。通过测定已加入化疗药物的癌细胞中的ATP与对照组进行比较，可评价药物的敏感性。本研究采用ATP-VCA法对卵巢癌细胞株SKOV3进行药敏检测，以探讨ATP-CVA法用于卵巢癌药敏试验的可行性。
一、材料与方法
, http://www.100md.com
1. 研究对象：卵巢癌细胞株SKOV3购于美国Type Culture Collection(ATCC)公司。
2.试剂及仪器：试剂及仪器包括RPMI-1640培养基、胰岛素、胰酶、ATP标准品，胎牛血清、荧光素、荧光素酶。药物有顺氯胺铂 (cDDP)和拓扑特肯(topotecan)。药物浓度的配制按其血浆峰浓度值(PPC)进行计算。另外，还备有二氧化碳培养箱、超纯水器、F2105液闪计数仪、超净工作台及倒置生物显微镜等。
3.实验方法：(1)ATP标准品的检测：用培养基将ATP标准品配制成系列浓度:10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/ml，加入等量的4%三氯醋酸溶液混匀，取100 μl进行测定，每种浓度做3个平行管。(2)ATP生物荧光检测法：将样品100 μl加入闪烁瓶中，加200 μl中和液，调整pH为7.8，加入300 μl含荧光素-荧光素酶的反应混合液，轻轻摇匀，再加入4 ml反应缓冲液，于缓冲液闪计数仪中检测1 min，计算其累计计数值。(3)卵巢癌细胞株SKOV3的培养及检测：将冻存的细胞株解冻复苏后，置于二氧化碳培养箱，于37℃、5%二氧化碳、95%湿度条件下进行培养。待细胞生长旺盛，即用0.25%的胰酶溶液消化，分瓶并扩大培养。将对数生长期的SKOV3用胰酶消化后收集细胞悬液，以2%的台盼蓝染液染色，计算活细胞数，等倍稀释成106、105、104、103、102个细胞/ml，加入等量的4%三氯醋酸提取ATP，取100μl混合液待测，用以分析活细胞数与荧光计数值的关系。收集对数生长期的SKOV3细胞，调整细胞浓度至1×105/ml，按每孔0.5 ml接种于24孔板，再加入0.5ml培养基进行培养。将cDDP和topotecan两种药物按每孔20 μl加入，使其终浓度分别为0.2×、0.5×、1×、2×、5×，每种药物浓度各设3个复孔(药物组)，并设置不用药组(对照组)。对照组和药物组每天均取样，直至第7天结束。在整个细胞培养过程中，不再添加培养基。取样时，首先轻轻吸出上层培养液0.5 ml，加入0.5 ml的4%三氯醋酸，混匀后，原位提取ATP。取混合液100 μl置于-72℃冰箱中，待7 d样品取完后，同时进行检测，观察两组SKOV3细胞生长及其与药物剂量效应的关系。
, 百拇医药
二、结果
在ATP浓度为10-9～10-5mol/ml时，测定计数值与其呈良好的直线相关(直线方程式Y=1.48X+15.03，相关系数为0.996 3)。细胞数在102～106/ml之间时，发光计数值与其呈极好的线性关系(相关系数为0.999 6)。在本实验培养条件下，SKOV3细胞在培养的第2天，细胞开始增殖，计数值明显升高，一直维持稳定的增长直至第5天达最高峰值，第6天即开始下降，细胞的死亡主要是由于细胞生长拥挤和缺乏营养所致。而在药物cDDP(1×PPC，为药敏判定标准)的作用下，细胞在第3天即开始下降直达第7天，二者的差别在第5天时为最大。将cDDP和topotecan按5种浓度加入培养的细胞中，第5天时结束培养进行测定。随着药物浓度的增加，其计数值明显下降。在药物浓度为1×PPC时，顺铂对SKOV3细胞的抑制作用强于拓扑特肯。
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三、讨论
ATP-CVA法采用细胞活性度测定,药物对各个周期细胞的作用均能反映出来。自此方法一提出，美国Miami大学的Sevin BU和Perras JP等对此方法进行了详尽的研究[1，2]。目前，GOG(Gynecologic Oncology Group)也认为，ATP-CVA法是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目，在美国正在进行大规模的前瞻性研究。
本研究中ATP标准品(10-9～10-5mol/ml)与发光计数值之间为一线性关系，SKOV3细胞数与发光计数值也呈极好的线性关系，且敏感到可检测出100个细胞的发光计数值，说明ATP含量检测，可作为1个反映活细胞数的重要指标。
在本研究中，用24孔板以5×104细胞数/孔进行培养，培养过程中不再添加培养液，细胞株SKOV3的生长是在培养的第5天达到计数值的峰值；而用药组计数值则逐日下降，二者的最大差别是在第5天，所以，我们选择第5天结束培养、取样并进行检测。在剂量效应关系上，随着药物浓度的增加，计数值逐渐下降。我们认为，以人体正常血浆药物浓度1×PPC浓度为标准判定药敏结果为宜。
, 百拇医药
ATP-CVA法可检测出不同药物，以及同种药物各种不同浓度作用后的差别。此方法敏感，且为定量检测，所需细胞数量小，因此，适宜于进行卵巢癌药敏检测。如何对新鲜卵巢癌组织进行药敏检测，以及该方法与临床疗效的相关性，尚有待深入研究。
楼江燕(610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科)
彭芝兰(610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科)
刘珊玲(610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科)
王和(610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科)
参考文献
1，Sevin BU，Peng ZL， Perras JP， et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol Oncol，1988，31：191-204.
2，Sevin BU，Perras JP. Tumor heterogeneity and in vitro chemosensitivity testing in ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol，1997，176：759-768., 百拇医药
楼江燕 彭芝兰 刘珊玲 王和
关键词：三磷酸腺苷；生物发光法；卵巢癌；细胞株；药物敏感试验 1983年,Moyer等提出内源性三磷酸腺苷(ATP)的数量可以反映细胞的活性度。随后Kangas等提出三磷酸腺苷生物发光 (ATP-CVA) 法这一新的药物敏感(药敏)试验方法。ATP-CVA的原理为，内源性ATP是活体细胞最基本的能量来源，细胞死亡时,由于有ATP酶的存在,ATP迅速水解。细胞内的ATP与荧光素-荧光素酶复合物作用产生可测定光，测定所产生的光，从而可获得ATP的数量。通过测定已加入化疗药物的癌细胞中的ATP与对照组进行比较，可评价药物的敏感性。本研究采用ATP-VCA法对卵巢癌细胞株SKOV3进行药敏检测，以探讨ATP-CVA法用于卵巢癌药敏试验的可行性。
一、材料与方法
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1. 研究对象：卵巢癌细胞株SKOV3购于美国Type Culture Collection(ATCC)公司。
2.试剂及仪器：试剂及仪器包括RPMI-1640培养基、胰岛素、胰酶、ATP标准品，胎牛血清、荧光素、荧光素酶。药物有顺氯胺铂 (cDDP)和拓扑特肯(topotecan)。药物浓度的配制按其血浆峰浓度值(PPC)进行计算。另外，还备有二氧化碳培养箱、超纯水器、F2105液闪计数仪、超净工作台及倒置生物显微镜等。
3.实验方法：(1)ATP标准品的检测：用培养基将ATP标准品配制成系列浓度:10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/ml，加入等量的4%三氯醋酸溶液混匀，取100 μl进行测定，每种浓度做3个平行管。(2)ATP生物荧光检测法：将样品100 μl加入闪烁瓶中，加200 μl中和液，调整pH为7.8，加入300 μl含荧光素-荧光素酶的反应混合液，轻轻摇匀，再加入4 ml反应缓冲液，于缓冲液闪计数仪中检测1 min，计算其累计计数值。(3)卵巢癌细胞株SKOV3的培养及检测：将冻存的细胞株解冻复苏后，置于二氧化碳培养箱，于37℃、5%二氧化碳、95%湿度条件下进行培养。待细胞生长旺盛，即用0.25%的胰酶溶液消化，分瓶并扩大培养。将对数生长期的SKOV3用胰酶消化后收集细胞悬液，以2%的台盼蓝染液染色，计算活细胞数，等倍稀释成106、105、104、103、102个细胞/ml，加入等量的4%三氯醋酸提取ATP，取100μl混合液待测，用以分析活细胞数与荧光计数值的关系。收集对数生长期的SKOV3细胞，调整细胞浓度至1×105/ml，按每孔0.5 ml接种于24孔板，再加入0.5ml培养基进行培养。将cDDP和topotecan两种药物按每孔20 μl加入，使其终浓度分别为0.2×、0.5×、1×、2×、5×，每种药物浓度各设3个复孔(药物组)，并设置不用药组(对照组)。对照组和药物组每天均取样，直至第7天结束。在整个细胞培养过程中，不再添加培养基。取样时，首先轻轻吸出上层培养液0.5 ml，加入0.5 ml的4%三氯醋酸，混匀后，原位提取ATP。取混合液100 μl置于-72℃冰箱中，待7 d样品取完后，同时进行检测，观察两组SKOV3细胞生长及其与药物剂量效应的关系。
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二、结果
在ATP浓度为10-9～10-5mol/ml时，测定计数值与其呈良好的直线相关(直线方程式Y=1.48X+15.03，相关系数为0.996 3)。细胞数在102～106/ml之间时，发光计数值与其呈极好的线性关系(相关系数为0.999 6)。在本实验培养条件下，SKOV3细胞在培养的第2天，细胞开始增殖，计数值明显升高，一直维持稳定的增长直至第5天达最高峰值，第6天即开始下降，细胞的死亡主要是由于细胞生长拥挤和缺乏营养所致。而在药物cDDP(1×PPC，为药敏判定标准)的作用下，细胞在第3天即开始下降直达第7天，二者的差别在第5天时为最大。将cDDP和topotecan按5种浓度加入培养的细胞中，第5天时结束培养进行测定。随着药物浓度的增加，其计数值明显下降。在药物浓度为1×PPC时，顺铂对SKOV3细胞的抑制作用强于拓扑特肯。
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三、讨论
ATP-CVA法采用细胞活性度测定,药物对各个周期细胞的作用均能反映出来。自此方法一提出，美国Miami大学的Sevin BU和Perras JP等对此方法进行了详尽的研究[1，2]。目前，GOG(Gynecologic Oncology Group)也认为，ATP-CVA法是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目，在美国正在进行大规模的前瞻性研究。
本研究中ATP标准品(10-9～10-5mol/ml)与发光计数值之间为一线性关系，SKOV3细胞数与发光计数值也呈极好的线性关系，且敏感到可检测出100个细胞的发光计数值，说明ATP含量检测，可作为1个反映活细胞数的重要指标。
在本研究中，用24孔板以5×104细胞数/孔进行培养，培养过程中不再添加培养液，细胞株SKOV3的生长是在培养的第5天达到计数值的峰值；而用药组计数值则逐日下降，二者的最大差别是在第5天，所以，我们选择第5天结束培养、取样并进行检测。在剂量效应关系上，随着药物浓度的增加，计数值逐渐下降。我们认为，以人体正常血浆药物浓度1×PPC浓度为标准判定药敏结果为宜。
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ATP-CVA法可检测出不同药物，以及同种药物各种不同浓度作用后的差别。此方法敏感，且为定量检测，所需细胞数量小，因此，适宜于进行卵巢癌药敏检测。如何对新鲜卵巢癌组织进行药敏检测，以及该方法与临床疗效的相关性，尚有待深入研究。
楼江燕(610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科)
彭芝兰(610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科)
刘珊玲(610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科)
王和(610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科)
参考文献
1，Sevin BU，Peng ZL， Perras JP， et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol Oncol，1988，31：191-204.
2，Sevin BU，Perras JP. Tumor heterogeneity and in vitro chemosensitivity testing in ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol，1997，176：759-768., 百拇医药