孕激素对人卵巢癌细胞株HO8910细胞增殖及凋亡的影响
孕激素对人卵巢癌细胞株HO8910细胞增殖及凋亡的影响
胡琢瑛 邓晓谷
摘 要 目的 探讨孕激素(P)对人卵巢癌细胞株HO8910细胞体外增殖及凋亡的调控作用。方法 选用人卵巢癌细胞株HO8910进行体外培养，实验组中加入含不同浓度P的培养液,对照组加入等量空白培养液，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖，流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率，光学显微镜和透射电子显微镜进行形态学观察，终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)计数凋亡细胞，流式细胞仪间接免疫荧光技术分析细胞内bcl-2蛋白的表达。结果 P浓度为1×10-7～1×10-5 mol/L时，作用24、48、72 h均明显抑制HO8910细胞的增殖(P均<0.01)，并具有剂量依赖性。P作用后G0/G1期细胞增加，并伴随G0/G1期细胞的增加，出现细胞凋亡峰和凋亡率的升高(P<0.01)；当P浓度为1×10-6、1×10-5 mol/L时，作用72 h后的细胞凋亡率分别为10.38%和35.78%,两者比较，差异有极显著性(P<0.01)。凋亡细胞计数，当P浓度为1×10-5 mol/L时，8孔中7孔(7/8)为凋亡细胞阳性，明显多于对照组(P<0.05)。光学显微镜和透射电子显微镜可观察到细胞凋亡的形态学改变。细胞内bcl-2 蛋白表达检测显示，当P浓度为1×10-6 mol/L时，bcl-2蛋白表达率为61.25%,明显低于对照组的71.07%(P<0.05)；当P浓度增至1×10-5 mol/L时, bcl-2蛋白表达率为9.40%，与对照组和P浓度为1×10-6 mol/L时比较，差异均有极显著性(P<0.01)。结论 P对卵巢癌细胞株HO8910细胞的增殖具有明显抑制作用，呈现剂量-效应关系。P的这种抗癌作用与诱导细胞凋亡有关，抗凋亡基因bcl-2 蛋白表达下降可能是诱发细胞凋亡的机理之一。
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关键词：卵巢肿瘤；孕酮；囊腺癌，浆液；脱噬作用；肿瘤细胞，培养的
细胞凋亡受阻或缺陷是形成肿瘤的机理之一，设法促进细胞凋亡是治疗肿瘤的方向。细胞凋亡和细胞增殖一样，可受到某些生长因子和激素的调节[1]。卵巢癌的激素疗法是否通过诱导细胞凋亡而起作用，目前国内外报道很少。本研究采用多种检测手段，观察孕激素(P)对卵巢癌细胞株HO8910细胞体外增殖及凋亡的影响，以期寻找治疗卵巢癌的有效的辅助措施。
材料与方法
一、材料
卵巢癌细胞株HO8910来源于人卵巢浆液性囊腺癌，由中国科学院上海细胞生物所提供。P和四甲基偶氮唑蓝(MTT)均为美国Sigma公司产品。 细胞凋亡检测试剂盒终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)为德国宝灵曼公司产品。鼠抗人bcl-2 单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。
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二、方法
1.细胞的培养:HO8910细胞培养方法参见文献[2]。
2.细胞增殖的测定：按上述培养方法得到的HO8910单细胞悬液，以每孔6×103个细胞加入96孔培养板中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，第2天待大部分细胞贴壁后4℃培养1 h，以促成细胞同步化生长[2]；换培养液，实验组加入不同浓度的P，每孔20 μl，使其终浓度分别为1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，每一浓度均设8个平行孔，对照组(下同)加入20 μl空白培养液。继续培养24、48及72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(浓度为5 mg/ml)，轻振培养板，放回培养箱内再孵育4 h后，吸尽上清液，每孔中加二甲亚砜200 μl，振荡器上振荡5～10 min， 用酶标光度计在波长为580nm时测定每孔的吸光度(A)值。 每个实验均重复3次。
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3.细胞周期和细胞凋亡率的测定：将浓度为3×104个/ml的HO8910细胞接种于培养瓶中，同步化处理后换培养液，实验组分别加P至终浓度为1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L。继续培养72 h后收集细胞，70%乙醇固定，碘化丙啶染色后置流式细胞仪 (FCM，美国can Becton Dickison公司生产)分析。细胞凋亡率为(凋亡细胞数/总细胞数)×100%，共计数500个细胞。
4.细胞的形态学观察：(1)光学显微镜观察：将浓度为3×104个/ml的H08910细胞悬液接种于24孔培养板中，每孔1 ml， 孔内已预置盖玻片，待细胞生长至对数生长期，换培养液，实验组分别加入浓度为1×10-6、1×10-5mol/L的P，，培养72 h后取出盖玻片，瑞氏染色10～15 min，光学显微镜下观察。(2)细胞超微结构观察：上述方法培养72 h后收集细胞，固定、包埋、切片、染色，采用Hitachi-600透射电子显微镜(日本日立公司生产)观察。
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5.细胞凋亡的测定：接种细胞于置盖玻片的24孔培养板，实验组P浓度为1×10-6、1×10-5mol/L，各设8个平行孔。培养72 h后，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒说明进行操作，光学显微镜观察凋亡细胞。细胞核呈棕褐色着色者为阳性凋亡细胞，阴性者细胞核呈蓝色。根据阳性凋亡细胞数的多少分为，每低倍镜视野中有阳性凋亡细胞但少于总数1/3者为(+)，1/3～2/3者为(++)，大于2/3者为(+++)，并计算各组凋亡细胞的阳性率。凋亡细胞阳性率为(阳性凋亡细胞孔数/总孔数)×100%。
6.细胞内bcl-2蛋白表达的测定：细胞培养同TUNEL法，收集约1×106个HO8910细胞，多聚甲醛室温固定15 min。加入按1∶50稀释的鼠抗人bcl-2单克隆抗体20 μl，4℃冰浴1 h。每组均设空白对照，即以磷酸盐缓冲液代替一抗。加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体 20 μl，4℃暗处孵育30 min。置FCM检测。
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三、统计学方法
采用SAS统计软件对计量资料进行方差分析，用Student-Newman-Keuls(SNK)法进行两两比较。计数资料用χ2检验和四格表确切概率法。
结果
一、HO8910细胞的增殖情况
MTT比色法检测P对HO8910细胞的增殖作用，结果见表1。浓度为1×10-8 mol/L时，细胞生长受到轻度抑制,但与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。当浓度为1×10-7～1×10-5 mol/L时，对细胞生长有明显的抑制效应，与对照组比较，差异均有极显著性(P<0.01)。在每一时间段，随着浓度的增加，A值呈现明显的下降趋势，显示明显的剂量-效应依赖关系。
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二、细胞凋亡率和细胞周期分布情况
表1 两组H08910细胞不同培养时间的A值(X±s)
组别
时间(h)
24
48
72
对照组
0.303±0.026
0.421±0.082
0.598±0.031
实验组(mol/L)
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1×10-8
0.302±0.012
0.398±0.025△△
0.570±0.016△
1×10-7
0.207±0.017*
0.258±0.037**△△
0.343±0.039*△
1×10-6
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0.204±0.057*
0.161±0.028*△△
0.165±0.024*△
1×10-5
0.169±0.029*
0.060±0.133*△△
0.075±0.013*△
注：与对照组比较，*P<0.01 **P<0.05；组内两两比较， △ P<0.01 △△P<0.05(下同)
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FCM检测HO8910细胞周期分布和细胞凋亡率情况见表2。对照组未发现细胞凋亡，P浓度为1×10-7 mol/L时细胞也无凋亡产生，但与对照组比较，G0/G1期细胞增加，S期细胞减少。随着P浓度的增加可观察到细胞凋亡峰(亚二倍体峰)的出现，并伴随G0/G1期细胞增加而明显增加(P<0.01)。当P浓度为1×10-6、1×10-5 mol/L时，细胞凋亡率分别为10.38%、35.78%(P<0.01)，P对HO8910细胞凋亡的诱导也呈剂量依赖趋势。
表2 两组HO8910细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率情况
组别
细胞周期分布(%)
细胞凋亡率
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(%)
G0/G1
S
G2/M
对照组
61.86
25.78
12.36...
实验组(mol/L)
1×10-7
70.33*
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22.16
7.51**..
1×10-6
72.14*
16.84**
11.02
10.38
1×10-5
83.45*△
10.13*
6.42*
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35.78△
三、形态学变化
1.光学显微镜观察：P作用72 h后的HO8910 细胞，经瑞氏染色，光学显微镜下可见HO8910 细胞呈凋亡细胞形态学改变，表现为细胞核染色质致密固缩，聚集于细胞核核膜呈周边化，细胞核碎裂为大小不一的核片段。见图1。
2.透镜电子显微镜观察：对照组极少见到凋亡细胞和凋亡小体。实验组可见较多凋亡细胞，表现为细胞体积变小，细胞浆密度增大、颜色变深，染色质致密固缩聚集于细胞核核膜呈境界分明的块状或新月形小体，细胞核裂解。P浓度为1×10-5 mol/L时，细胞的凋亡小体较多见，小体内有完整的细胞器。见图2。
四、细胞凋亡情况
TUNEL法检测的细胞凋亡结果见表3,对照组阳性凋亡细胞数很少, 凋亡细胞阳性率为8孔中1孔(1/8)，实验组阳性凋亡细胞数明显多于对照组，凋亡细胞阳性表达随剂量增加而增多，其中以P浓度为1×10-5 mol/L时作用最为明显，8孔中7孔(7/8)为凋亡细胞阳性，明显高于对照组(P<0.05)。
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表3 两组HO8910细胞的凋亡情况(孔数)
组别
平行孔
阳性凋亡细胞
阳性孔
(-)
(+)
(++)
(+++)
对照组
8
7
1
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0
0
1
实验组(mol/L)
1×10-6
8
4
1
2
1
4
1×10-5
8
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1
0
2
5
7
五、bcl-2蛋白表达情况
bcl-2蛋白表达采用FCM检测，对照组bcl-2蛋白表达率为71.07%，P浓度为1×10-6 mol/L时，bcl-2蛋白表达率下降至61.25%，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。当P浓度增至1×10-5 mol/L时，bcl-2蛋白表达率明显降低，为9.40%，几乎阻断了bcl-2蛋白的表达，明显低于对照组以及P浓度为1×10-6 mol/L时(P<0.01)。
讨论
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一、P抑制HO8910细胞生长的作用及其机理
有报道认为，P使子宫内膜癌细胞分化趋向成熟，已癌变的子宫内膜沿分泌相变化，有丝分裂数明显减少，阻遏其进一步增生恶变[1,3]，提示P对癌细胞有直接抑制作用。Langdon等[4]研究发现，甲地孕酮能抑制P受体阳性的PE04卵巢癌细胞株移植物生长，但对P受体阴性的HOX60移植物无作用。P抗癌作用的机理尚不十分清楚，目前认为，可能是通过P进入细胞核，直接在细胞核内与受体结合，激活的受体作为转录调节蛋白与称之为激素反应成份(HRE)特异的核DNA片段结合，进而转录合成mRNA，进入细胞浆合成各种特异性蛋白质，从而使卵巢癌细胞生长受到抑制。已证实，HO8910细胞含有雌激素受体和P受体，提示可能为性激素依赖细胞[5]。临床上，通常运用比黄体期P的生理浓度(约50 nmol/L)高10～100倍的P剂量来治疗卵巢癌[6]。本研究采用与临床治疗量血中浓度相近的P浓度,通过体外实验证实，P能够明显抑制卵巢癌细胞株HO8910细胞的生长，其抗增殖效应呈现剂量依赖性。由此可见,P抑制HO8910细胞的生长可能通过P受体发挥作用。
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二、P诱导HO8910细胞凋亡的作用及其机理
目前，关于P诱导卵巢癌细胞凋亡的报道很少。Formby等[7]研究证实，P能够诱导P受体表达阳性的T47-D乳腺癌细胞凋亡从而抑制其生长。国内有学者发现，P治疗后的子宫内膜癌组织中观察到发生凋亡的腺癌细胞[3]。本研究采用FCM、TUNEL 法及形态学观察等多种细胞凋亡检测手段，观察了P在诱导HO8910细胞凋亡方面的作用，以初步探讨其抗癌机理。结果发现，P能够诱导HO8910细胞发生凋亡，且随P剂量升高，细胞凋亡作用增强。HO8910细胞瑞氏染色后光学显微镜下可见细胞凋亡的早期改变；透射电子显微镜下可发现大量凋亡小体。同时还观察到，P改变了细胞周期时相的分布，使G0/G1期细胞增多。利用TUNEL法对凋亡细胞进行定性和半定量测定发现，P作用后出现大量凋亡细胞，实验组凋亡细胞阳性率高于对照组。本实验在对照组中用TUNEL法测出凋亡细胞阳性率为8孔中1孔(1/8),而用FCM未测出细胞凋亡,这可能是因为FCM测定的是出现在G0/G1期的细胞凋亡,不能发现S期的细胞凋亡。
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细胞凋亡受到基因的调控。bcl-2是一主要的抗凋亡基因， 其编码产物bcl-2蛋白具有促进细胞存活，对抗细胞凋亡的作用。bcl-2蛋白可在多种组织中表达，尤以肿瘤组织中表达较强，广泛位于线粒体膜、内质网膜等细胞器膜上。Saegusa等[8,9]报道，bcl-2蛋白表达同子宫内膜癌的低凋亡指数密切相关，而P能调节bcl-2蛋白表达。Formby等[10]对乳腺癌细胞的体外实验观察到，P浓度为10 μmol/L时作用72 h后，48%的乳腺癌细胞发生凋亡，同时bcl-2 mRNA和蛋白表达率显著下降。Bu等[6]研究发现，P能诱导卵巢癌细胞株AO和3AO发生细胞凋亡，但不引起bcl-2蛋白表达的改变。本实验对bcl-2蛋白定量测定发现，P能明显降低卵巢癌细胞株HO8910的bcl-2蛋白表达率， 这可能是由于所选卵巢癌细胞株组织学类型不同的缘故。bcl-2蛋白的下降可能是P诱发HO8910细胞凋亡的机理之一，P能够解除bcl-2基因对抗细胞凋亡的作用。
图1 光学显微镜所见(孕激素浓度为1×10-5 mol/L，培养72h)：箭头所示细胞膜皱缩，细胞核裂解成大小不一的核片段。瑞氏染色×400图2 透射电子显微镜所见(孕激素浓度为1×10-5 mol/L，培养72h)：箭头所示大量凋亡小体形成，其内可见致密染色质和完整细胞器。透射电子显微镜×8000
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作者单位：胡琢瑛(400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科)
邓晓谷(400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科)
参考文献
1，Saegusa M, Okayasu I. Progesterone therapy for endometrial carcinoma reduces cell proliferation but does not alter apoptosis. Cancer, 1998, 83:111-121.
2，鄂征，主编. 组织培养和分子细胞学技术.第1版. 北京: 北京出版社,1994. 78-85.
3，陈晨，华祖德，金晓龙，等.孕激素治疗子宫内膜癌的形态学观察与治疗机理探讨.中华妇产科杂志，1997，32:415-417.
, http://www.100md.com
4，Langdon SP, Gabra H, Bartlett JM, et al. Functionality of the progesterone receptor in ovarian cancer and its regulation by estrogen. Clin Cancer Res,1998,4:2245-2251.
5，牟舟，许沈华，张弈荫，等.人卵巢癌细胞系HO8910的建立及其生物学特性.中华妇产科杂志,1994,29:162-164.
6，Bu SZ, Yin DL, Ren XH, et al. Progesterone induces apoptosis and up- regulation of p53 expression in human ovarian carcinoma cell lines. Cancer, 1997,79:1944-1950.
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7，Formby B, Wiley TS. Progesterone inhibits growth and induces apoptosis in breast cancer cells: inverse effects on bcl-2 and p53. Ann Clin Lab Sci,1998,28:360-369.
8，Saegusa M, Kamata Y, Isono M, et al. Bcl-2 expression is correlated with a low apoptotic index and associated with progesterone receptor immunoreactivity in endometrial carcinomas. J Pathol,1996,180:275-282.
9，Saegusa M,Okayasu I. Down-regulation of bcl-2 expression is closely related to squamous differentiation and progesterone therapy in endometrial carcinomas. J Pathol,1997,182:429-436.
10，Formby B, Wiley TS. Bcl-2, survivin and variant CD44 v7-v10 are downregulated and p53 is upregulated in breast cancer cells by progesterone:inhibition of cell growth and induction of apoptosis. Mol Cell Biochem,1999,202:53-61., http://www.100md.com
胡琢瑛 邓晓谷
摘 要 目的 探讨孕激素(P)对人卵巢癌细胞株HO8910细胞体外增殖及凋亡的调控作用。方法 选用人卵巢癌细胞株HO8910进行体外培养，实验组中加入含不同浓度P的培养液,对照组加入等量空白培养液，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖，流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率，光学显微镜和透射电子显微镜进行形态学观察，终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)计数凋亡细胞，流式细胞仪间接免疫荧光技术分析细胞内bcl-2蛋白的表达。结果 P浓度为1×10-7～1×10-5 mol/L时，作用24、48、72 h均明显抑制HO8910细胞的增殖(P均<0.01)，并具有剂量依赖性。P作用后G0/G1期细胞增加，并伴随G0/G1期细胞的增加，出现细胞凋亡峰和凋亡率的升高(P<0.01)；当P浓度为1×10-6、1×10-5 mol/L时，作用72 h后的细胞凋亡率分别为10.38%和35.78%,两者比较，差异有极显著性(P<0.01)。凋亡细胞计数，当P浓度为1×10-5 mol/L时，8孔中7孔(7/8)为凋亡细胞阳性，明显多于对照组(P<0.05)。光学显微镜和透射电子显微镜可观察到细胞凋亡的形态学改变。细胞内bcl-2 蛋白表达检测显示，当P浓度为1×10-6 mol/L时，bcl-2蛋白表达率为61.25%,明显低于对照组的71.07%(P<0.05)；当P浓度增至1×10-5 mol/L时, bcl-2蛋白表达率为9.40%，与对照组和P浓度为1×10-6 mol/L时比较，差异均有极显著性(P<0.01)。结论 P对卵巢癌细胞株HO8910细胞的增殖具有明显抑制作用，呈现剂量-效应关系。P的这种抗癌作用与诱导细胞凋亡有关，抗凋亡基因bcl-2 蛋白表达下降可能是诱发细胞凋亡的机理之一。
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关键词：卵巢肿瘤；孕酮；囊腺癌，浆液；脱噬作用；肿瘤细胞，培养的
细胞凋亡受阻或缺陷是形成肿瘤的机理之一，设法促进细胞凋亡是治疗肿瘤的方向。细胞凋亡和细胞增殖一样，可受到某些生长因子和激素的调节[1]。卵巢癌的激素疗法是否通过诱导细胞凋亡而起作用，目前国内外报道很少。本研究采用多种检测手段，观察孕激素(P)对卵巢癌细胞株HO8910细胞体外增殖及凋亡的影响，以期寻找治疗卵巢癌的有效的辅助措施。
材料与方法
一、材料
卵巢癌细胞株HO8910来源于人卵巢浆液性囊腺癌，由中国科学院上海细胞生物所提供。P和四甲基偶氮唑蓝(MTT)均为美国Sigma公司产品。 细胞凋亡检测试剂盒终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)为德国宝灵曼公司产品。鼠抗人bcl-2 单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。
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二、方法
1.细胞的培养:HO8910细胞培养方法参见文献[2]。
2.细胞增殖的测定：按上述培养方法得到的HO8910单细胞悬液，以每孔6×103个细胞加入96孔培养板中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，第2天待大部分细胞贴壁后4℃培养1 h，以促成细胞同步化生长[2]；换培养液，实验组加入不同浓度的P，每孔20 μl，使其终浓度分别为1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，每一浓度均设8个平行孔，对照组(下同)加入20 μl空白培养液。继续培养24、48及72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(浓度为5 mg/ml)，轻振培养板，放回培养箱内再孵育4 h后，吸尽上清液，每孔中加二甲亚砜200 μl，振荡器上振荡5～10 min， 用酶标光度计在波长为580nm时测定每孔的吸光度(A)值。 每个实验均重复3次。
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3.细胞周期和细胞凋亡率的测定：将浓度为3×104个/ml的HO8910细胞接种于培养瓶中，同步化处理后换培养液，实验组分别加P至终浓度为1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L。继续培养72 h后收集细胞，70%乙醇固定，碘化丙啶染色后置流式细胞仪 (FCM，美国can Becton Dickison公司生产)分析。细胞凋亡率为(凋亡细胞数/总细胞数)×100%，共计数500个细胞。
4.细胞的形态学观察：(1)光学显微镜观察：将浓度为3×104个/ml的H08910细胞悬液接种于24孔培养板中，每孔1 ml， 孔内已预置盖玻片，待细胞生长至对数生长期，换培养液，实验组分别加入浓度为1×10-6、1×10-5mol/L的P，，培养72 h后取出盖玻片，瑞氏染色10～15 min，光学显微镜下观察。(2)细胞超微结构观察：上述方法培养72 h后收集细胞，固定、包埋、切片、染色，采用Hitachi-600透射电子显微镜(日本日立公司生产)观察。
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5.细胞凋亡的测定：接种细胞于置盖玻片的24孔培养板，实验组P浓度为1×10-6、1×10-5mol/L，各设8个平行孔。培养72 h后，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒说明进行操作，光学显微镜观察凋亡细胞。细胞核呈棕褐色着色者为阳性凋亡细胞，阴性者细胞核呈蓝色。根据阳性凋亡细胞数的多少分为，每低倍镜视野中有阳性凋亡细胞但少于总数1/3者为(+)，1/3～2/3者为(++)，大于2/3者为(+++)，并计算各组凋亡细胞的阳性率。凋亡细胞阳性率为(阳性凋亡细胞孔数/总孔数)×100%。
6.细胞内bcl-2蛋白表达的测定：细胞培养同TUNEL法，收集约1×106个HO8910细胞，多聚甲醛室温固定15 min。加入按1∶50稀释的鼠抗人bcl-2单克隆抗体20 μl，4℃冰浴1 h。每组均设空白对照，即以磷酸盐缓冲液代替一抗。加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体 20 μl，4℃暗处孵育30 min。置FCM检测。
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三、统计学方法
采用SAS统计软件对计量资料进行方差分析，用Student-Newman-Keuls(SNK)法进行两两比较。计数资料用χ2检验和四格表确切概率法。
结果
一、HO8910细胞的增殖情况
MTT比色法检测P对HO8910细胞的增殖作用，结果见表1。浓度为1×10-8 mol/L时，细胞生长受到轻度抑制,但与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。当浓度为1×10-7～1×10-5 mol/L时，对细胞生长有明显的抑制效应，与对照组比较，差异均有极显著性(P<0.01)。在每一时间段，随着浓度的增加，A值呈现明显的下降趋势，显示明显的剂量-效应依赖关系。
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二、细胞凋亡率和细胞周期分布情况
表1 两组H08910细胞不同培养时间的A值(X±s)
组别
时间(h)
24
48
72
对照组
0.303±0.026
0.421±0.082
0.598±0.031
实验组(mol/L)
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0.302±0.012
0.398±0.025△△
0.570±0.016△
1×10-7
0.207±0.017*
0.258±0.037**△△
0.343±0.039*△
1×10-6
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0.204±0.057*
0.161±0.028*△△
0.165±0.024*△
1×10-5
0.169±0.029*
0.060±0.133*△△
0.075±0.013*△
注：与对照组比较，*P<0.01 **P<0.05；组内两两比较， △ P<0.01 △△P<0.05(下同)
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FCM检测HO8910细胞周期分布和细胞凋亡率情况见表2。对照组未发现细胞凋亡，P浓度为1×10-7 mol/L时细胞也无凋亡产生，但与对照组比较，G0/G1期细胞增加，S期细胞减少。随着P浓度的增加可观察到细胞凋亡峰(亚二倍体峰)的出现，并伴随G0/G1期细胞增加而明显增加(P<0.01)。当P浓度为1×10-6、1×10-5 mol/L时，细胞凋亡率分别为10.38%、35.78%(P<0.01)，P对HO8910细胞凋亡的诱导也呈剂量依赖趋势。
表2 两组HO8910细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率情况
组别
细胞周期分布(%)
细胞凋亡率
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(%)
G0/G1
S
G2/M
对照组
61.86
25.78
12.36...
实验组(mol/L)
1×10-7
70.33*
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22.16
7.51**..
1×10-6
72.14*
16.84**
11.02
10.38
1×10-5
83.45*△
10.13*
6.42*
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35.78△
三、形态学变化
1.光学显微镜观察：P作用72 h后的HO8910 细胞，经瑞氏染色，光学显微镜下可见HO8910 细胞呈凋亡细胞形态学改变，表现为细胞核染色质致密固缩，聚集于细胞核核膜呈周边化，细胞核碎裂为大小不一的核片段。见图1。
2.透镜电子显微镜观察：对照组极少见到凋亡细胞和凋亡小体。实验组可见较多凋亡细胞，表现为细胞体积变小，细胞浆密度增大、颜色变深，染色质致密固缩聚集于细胞核核膜呈境界分明的块状或新月形小体，细胞核裂解。P浓度为1×10-5 mol/L时，细胞的凋亡小体较多见，小体内有完整的细胞器。见图2。
四、细胞凋亡情况
TUNEL法检测的细胞凋亡结果见表3,对照组阳性凋亡细胞数很少, 凋亡细胞阳性率为8孔中1孔(1/8)，实验组阳性凋亡细胞数明显多于对照组，凋亡细胞阳性表达随剂量增加而增多，其中以P浓度为1×10-5 mol/L时作用最为明显，8孔中7孔(7/8)为凋亡细胞阳性，明显高于对照组(P<0.05)。
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表3 两组HO8910细胞的凋亡情况(孔数)
组别
平行孔
阳性凋亡细胞
阳性孔
(-)
(+)
(++)
(+++)
对照组
8
7
1
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0
0
1
实验组(mol/L)
1×10-6
8
4
1
2
1
4
1×10-5
8
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1
0
2
5
7
五、bcl-2蛋白表达情况
bcl-2蛋白表达采用FCM检测，对照组bcl-2蛋白表达率为71.07%，P浓度为1×10-6 mol/L时，bcl-2蛋白表达率下降至61.25%，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。当P浓度增至1×10-5 mol/L时，bcl-2蛋白表达率明显降低，为9.40%，几乎阻断了bcl-2蛋白的表达，明显低于对照组以及P浓度为1×10-6 mol/L时(P<0.01)。
讨论
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一、P抑制HO8910细胞生长的作用及其机理
有报道认为，P使子宫内膜癌细胞分化趋向成熟，已癌变的子宫内膜沿分泌相变化，有丝分裂数明显减少，阻遏其进一步增生恶变[1,3]，提示P对癌细胞有直接抑制作用。Langdon等[4]研究发现，甲地孕酮能抑制P受体阳性的PE04卵巢癌细胞株移植物生长，但对P受体阴性的HOX60移植物无作用。P抗癌作用的机理尚不十分清楚，目前认为，可能是通过P进入细胞核，直接在细胞核内与受体结合，激活的受体作为转录调节蛋白与称之为激素反应成份(HRE)特异的核DNA片段结合，进而转录合成mRNA，进入细胞浆合成各种特异性蛋白质，从而使卵巢癌细胞生长受到抑制。已证实，HO8910细胞含有雌激素受体和P受体，提示可能为性激素依赖细胞[5]。临床上，通常运用比黄体期P的生理浓度(约50 nmol/L)高10～100倍的P剂量来治疗卵巢癌[6]。本研究采用与临床治疗量血中浓度相近的P浓度,通过体外实验证实，P能够明显抑制卵巢癌细胞株HO8910细胞的生长，其抗增殖效应呈现剂量依赖性。由此可见,P抑制HO8910细胞的生长可能通过P受体发挥作用。
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二、P诱导HO8910细胞凋亡的作用及其机理
目前，关于P诱导卵巢癌细胞凋亡的报道很少。Formby等[7]研究证实，P能够诱导P受体表达阳性的T47-D乳腺癌细胞凋亡从而抑制其生长。国内有学者发现，P治疗后的子宫内膜癌组织中观察到发生凋亡的腺癌细胞[3]。本研究采用FCM、TUNEL 法及形态学观察等多种细胞凋亡检测手段，观察了P在诱导HO8910细胞凋亡方面的作用，以初步探讨其抗癌机理。结果发现，P能够诱导HO8910细胞发生凋亡，且随P剂量升高，细胞凋亡作用增强。HO8910细胞瑞氏染色后光学显微镜下可见细胞凋亡的早期改变；透射电子显微镜下可发现大量凋亡小体。同时还观察到，P改变了细胞周期时相的分布，使G0/G1期细胞增多。利用TUNEL法对凋亡细胞进行定性和半定量测定发现，P作用后出现大量凋亡细胞，实验组凋亡细胞阳性率高于对照组。本实验在对照组中用TUNEL法测出凋亡细胞阳性率为8孔中1孔(1/8),而用FCM未测出细胞凋亡,这可能是因为FCM测定的是出现在G0/G1期的细胞凋亡,不能发现S期的细胞凋亡。
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细胞凋亡受到基因的调控。bcl-2是一主要的抗凋亡基因， 其编码产物bcl-2蛋白具有促进细胞存活，对抗细胞凋亡的作用。bcl-2蛋白可在多种组织中表达，尤以肿瘤组织中表达较强，广泛位于线粒体膜、内质网膜等细胞器膜上。Saegusa等[8,9]报道，bcl-2蛋白表达同子宫内膜癌的低凋亡指数密切相关，而P能调节bcl-2蛋白表达。Formby等[10]对乳腺癌细胞的体外实验观察到，P浓度为10 μmol/L时作用72 h后，48%的乳腺癌细胞发生凋亡，同时bcl-2 mRNA和蛋白表达率显著下降。Bu等[6]研究发现，P能诱导卵巢癌细胞株AO和3AO发生细胞凋亡，但不引起bcl-2蛋白表达的改变。本实验对bcl-2蛋白定量测定发现，P能明显降低卵巢癌细胞株HO8910的bcl-2蛋白表达率， 这可能是由于所选卵巢癌细胞株组织学类型不同的缘故。bcl-2蛋白的下降可能是P诱发HO8910细胞凋亡的机理之一，P能够解除bcl-2基因对抗细胞凋亡的作用。
图1 光学显微镜所见(孕激素浓度为1×10-5 mol/L，培养72h)：箭头所示细胞膜皱缩，细胞核裂解成大小不一的核片段。瑞氏染色×400图2 透射电子显微镜所见(孕激素浓度为1×10-5 mol/L，培养72h)：箭头所示大量凋亡小体形成，其内可见致密染色质和完整细胞器。透射电子显微镜×8000
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作者单位：胡琢瑛(400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科)
邓晓谷(400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科)
参考文献
1，Saegusa M, Okayasu I. Progesterone therapy for endometrial carcinoma reduces cell proliferation but does not alter apoptosis. Cancer, 1998, 83:111-121.
2，鄂征，主编. 组织培养和分子细胞学技术.第1版. 北京: 北京出版社,1994. 78-85.
3，陈晨，华祖德，金晓龙，等.孕激素治疗子宫内膜癌的形态学观察与治疗机理探讨.中华妇产科杂志，1997，32:415-417.
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4，Langdon SP, Gabra H, Bartlett JM, et al. Functionality of the progesterone receptor in ovarian cancer and its regulation by estrogen. Clin Cancer Res,1998,4:2245-2251.
5，牟舟，许沈华，张弈荫，等.人卵巢癌细胞系HO8910的建立及其生物学特性.中华妇产科杂志,1994,29:162-164.
6，Bu SZ, Yin DL, Ren XH, et al. Progesterone induces apoptosis and up- regulation of p53 expression in human ovarian carcinoma cell lines. Cancer, 1997,79:1944-1950.
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7，Formby B, Wiley TS. Progesterone inhibits growth and induces apoptosis in breast cancer cells: inverse effects on bcl-2 and p53. Ann Clin Lab Sci,1998,28:360-369.
8，Saegusa M, Kamata Y, Isono M, et al. Bcl-2 expression is correlated with a low apoptotic index and associated with progesterone receptor immunoreactivity in endometrial carcinomas. J Pathol,1996,180:275-282.
9，Saegusa M,Okayasu I. Down-regulation of bcl-2 expression is closely related to squamous differentiation and progesterone therapy in endometrial carcinomas. J Pathol,1997,182:429-436.
10，Formby B, Wiley TS. Bcl-2, survivin and variant CD44 v7-v10 are downregulated and p53 is upregulated in breast cancer cells by progesterone:inhibition of cell growth and induction of apoptosis. Mol Cell Biochem,1999,202:53-61., http://www.100md.com