重要条件致病真菌感染组织免疫组化研究
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中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
重要条件致病真菌感染组织免疫组化研究
狄梅 涂平 李若瑜 王端礼
摘 要 目的 探索在组织中鉴定重要条件致病真菌的组织病理学方法。方法 对实验小鼠白念珠菌感染组织和可疑念珠菌、隐球菌和曲霉感染的临床组织病理标本进行PAS染色和免疫组化染色，并比较了两种方法的敏感性。结果 兔抗白念珠菌多克隆抗体、兔抗新生隐球菌多克隆抗体和鼠抗曲霉单克隆抗体可以分别鉴定组织中的白念珠菌、新生隐球菌和曲霉。免疫组化和PAS染色的敏感性差异无显著性。结论 免疫组化为组织中确定真菌和鉴定真菌种属提供了新的可靠方法，有助于临床诊断，因而具有广阔应用前景。
关键词：念珠菌属；隐球菌属；曲霉菌属；免疫组织化学
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念珠菌、隐球菌和曲霉是常见的条件致病真菌，它们引起的感染呈逐年上升趋势。组织病理学是重要的诊断方法之一，传统的HE染色和PAS染色仅通过形态学鉴定组织中的真菌，因而具有一定局限性，免疫组化染色根据真菌抗原性不同鉴定组织中真菌，提高了真菌鉴定的特异性和病原学诊断水平[1]。
资料和方法
一、标本来源
1.实验小鼠肾脏：Ⅱ级昆明小鼠9只，鼠尾静脉注射白念珠菌2×105cfu/鼠，7d后处死，无菌条件下取肾脏，经3.33mol/L(10%)福尔马林固定，用于组织病理学研究。
2.临床标本：共28份，均属回顾性研究。标本来源：肺9例，脑组织1例，胃粘膜3例，心瓣膜2例，肾动脉1例，鼻咽部5例，声带1例，皮肤5例，尿管型1例。根据组织中真菌形态分为可疑念珠菌感染7例，可疑隐球菌感染9例和可疑曲霉感染12例。
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二、组织病理学检查
1.HE染色和PAS染色：与常规组织病理学方法相同。
2.免疫组化染色：采用过氧化物酶标记链霉亲和素法(LSAB法)，切片常规脱蜡入水；0.3%过氧化氢，室温，30min；10%羊血清，室温，30min；一抗，37℃，30min；二抗，37℃，30min；三抗，37℃，20min；DAB显色；常规脱水、透明、封片。
3.一抗种类：兔抗白念珠菌多克隆抗体(B0794)，Dako公司赠送，对白念珠菌特异；兔抗新生隐球菌多克隆抗体(B3002)，购自Dako公司，对新生隐球菌特异；鼠抗曲霉单克隆抗体(M3564)，购自Dako公司，对烟曲霉和黑曲霉特异。
结果
一、念珠菌感染
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(一)动物实验部分：
1.小鼠播散性白念珠菌感染1周时，肾脏呈轻微病变、淋巴细胞浸润或化脓性改变。HE染色孢子和菌丝淡染，略嗜碱，不易发现，结构不清晰。PAS染色见白念珠菌多位于集合管和肾小盏中。个别见于肾小管、输尿管内。真菌细胞多聚集存在，均表现为菌丝和孢子共存，易见芽管。孢子和菌丝全部染成紫红色，中央略淡。芽生孢子呈椭圆形，壁薄，直径一般3～6μm，可见发芽。菌丝多呈假菌丝，较细，较直，分支少。
2.小鼠肾脏抗白念珠菌抗体免疫组化染色：①7例肾脏组织兔抗白念珠菌多克隆抗体免疫组化染色为阳性(7/9)，孢子和菌丝染成棕褐色，与PAS染色结果一致。②取2只感染小鼠肾脏做连续切片，相邻切片分别做PAS染色和免疫组化染色，各64张切片，两种染色阳性和阴性结果完全一致，阳性49张，阴性15张。阳性率为49/64，经统计学处理(χ2检验，P>0.5)，差异无显著性。
, 百拇医药 (二)临床标本部分：
1.7份临床标本PAS染色见真菌细胞以孢子和菌丝形态共存，易见芽管。孢子和菌丝全部染成紫红色，中央略淡。芽生孢子呈椭圆形，壁薄，可见发芽。菌丝多呈假菌丝，较细，较直，分支少。形态学可疑为念珠菌感染，只有1份培养结果为白念珠菌，可以确诊白念珠菌病。
2.免疫组化染色见孢子和菌丝全部呈棕褐色，细胞形态较清晰，背景为淡棕色，较易判断。7份临床标本有6份染色阳性，对照试验中见兔抗白念珠菌多克隆抗体与新生隐球菌和部分曲霉有弱阳性反应。结合后两者的形态学可排除隐球菌和曲霉感染。因而，进一步诊断为白念珠菌感染。
3.在病理改变为肉芽肿的病例中，多核巨细胞内可见到弥散、细颗粒状阳性染色物质，而结节病组织切片作为对照，多核巨细胞内未见阳性染色。
二、隐球菌感染
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1.隐球菌感染多为肉芽肿改变，也可见胶质样改变。肉芽肿病变中孢子少，胶质样病变中菌量多。本实验中组织内见大量隐球菌的2例患者均有长期大量口服皮质类固醇史，且病变中淋巴细胞和巨噬细胞少。
2.9份临床标本PAS染色可见组织中大小不一的孢子，圆形、椭圆形，中央染色略淡，2份可见孢子发芽。1份脑组织渗出液中孢子多为圆形，荚膜明显厚于组织中孢子，考虑为隐球菌感染。有3例同时伴发皮肤隐球菌病的患者，经培养证实病原体为新生隐球菌。
3.9份临床标本免疫组化染色均获阳性结果，孢子染成棕褐色，形态同PAS染色，进一步诊断为新生隐球菌感染。
4.肉芽肿损害中可见组织细胞和多核巨细胞吞噬孢子现象，而且部分组织细胞和多核巨细胞胞浆呈阳性染色。结节病中多核巨细胞未见阳性染色。
5.对照试验表明兔抗新生隐球菌多克隆抗体与白念珠菌和曲霉无交叉反应。
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三、曲霉感染
1.12份可疑曲霉感染的临床标本HE染色和PAS染色见真菌成分有类似结构，主要以菌丝存在，菌丝多平行排列，粗细不一，叉状分支，可见膨大的泡状结构，分隔少，5份菌丝纵横交错，可见大量平行菌丝和菌丝断面，形成真菌球。形态学上考虑为曲霉病。
2.免疫组化染色证实7份为阳性，菌丝被染成棕褐色，细胞壁染色明显，进一步证实为曲霉感染。
3.对照实验表明鼠抗曲霉单克隆抗体与白念珠菌、新生隐球菌无交叉反应。
讨论
近年来，条件致病真菌引起的真菌病在增加，条件致病真菌引起的深部真菌病往往被误诊为肿瘤和其它感染，本实验回顾性研究的28例患者除5例伴有皮肤损害的真菌感染外，其余均被误诊，经组织病理学证实为真菌感染。目前组织病理学诊断真菌病还停留在一个较低的水平，5例深部念珠菌感染患者均被诊断为霉菌感染，而12例丝状真菌感染患者也只诊断到霉菌感染水平，只有隐球菌感染获得了较明确的诊断。
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很多真菌在组织中形态相似，且真菌形态受多种因素影响，给形态学确定真菌种类造成困难。免疫组化根据真菌抗原性的不同，可在组织切片中将真菌分类。本实验所用方法是LSAB法，即标记链霉亲和素法。白念珠菌是念珠菌感染中的主要致病菌，本实验所用兔抗白念珠菌多克隆抗体能够特异性检出白念珠菌，此抗体虽然与隐球菌和部分曲霉有弱的交叉反应，但是结合PAS染色的形态改变，如隐球菌主要以孢子存在，极少形成菌丝，而曲霉多以菌丝存在，菌丝粗大，有叉状分支，所以依然可以诊断白念珠菌感染。此抗体和PAS染色检出的敏感性差异无显著性[2,3]。白念珠菌与多种人体组织有交叉免疫，需做多种对照慎重作出诊断。兔抗新生隐球菌多克隆抗体能够特异性检出组织中的新生隐球菌，此抗体与白念珠菌和曲霉均不发生交叉反应，特异性好[4,5]。鼠抗曲霉单克隆抗体可以检出组织中烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉。烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉是曲霉病主要致病菌，阳性结果可以作出曲霉感染的诊断[6-8]。在念珠菌和隐球菌感染体的免疫组化染色中，均看到一种现象，即肉芽肿病变中部分组织细胞和多核巨细胞胞浆内有阳性染色。而非真菌肉芽肿损害中无阳性结果，这与数位国外学者得出的结果一致[5]，提示真菌肉芽肿这种阳性染色模式具有一定特异性。可能与真菌抗原在体内被组织细胞呈递处理有关。肉芽肿中阳性染色是否可以做为特异性染色成为诊断依据还需进一步研究探索。免疫组化为组织中确定真菌和鉴定真菌类别提供了新的可靠方法，有助于条件致病真菌感染的诊断。随着特异性抗体的增多和交叉反应的减少，真菌感染的免疫组化将有较好的应用前景。
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卫生部临床学科重点项目资助课题
作者单位：涂平(100034北京大学第一医院皮肤科)
李若瑜(100034北京大学第一医院皮肤科)
王端礼(100034北京大学第一医院皮肤科)
狄梅(研修生，现在北京安贞医院皮肤科100029)
参考文献
[1]Jensen HE, Schonheyder HC, Hotchi M， et al. Diagnosis of systemic mycoses by specific immunohistochemical tests. APMIS, 1996,104:241- 258.
, 百拇医药
[2] Rocha DC, Duarte MI, Pagliari C, et al. Immunohistochemistry diagnosis of fungal infections. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo, 1998,53:184- 188.
[3]Williams DW, Jonesa HS, Allison RT, et al. Immunocytochemical detection of Candid albicans in formalin fixed, paraffin embedded material. J Clin Pathol, 1998,51:857- 859.
[4]唐书谦,叶庆佾,钟白玉,等.隐球菌免疫组化染色观察.中华皮肤科杂志,1994,27:307.
[5]Lee SC, Casadevall A， Dickson DW. Immunohistochemical localization of capsular polysaccharide antigen in the central nervous system cells in cryptococcal meningo- encephalitis. Am J Pathol, 1996,148:1267- 1274.
, http://www.100md.com
[6]Jensen HE， Salonen J, Ekfors TO. The use of immunohistochemistry to improve sensitivity and specificity in the diagnosis of systemic mycoses in patients with haematological malignancies. J Pathol, 1997,181:100- 105.
[7]Kaufman L, Standard PG, Jalbert M, et al. Immunohistologic identification of Aspergillus spp. and other hyaline fungi by using polyclonal fluorescent antibodies. J Clin Microbiol, 1997,35:2206- 2209.
[8]Fenelon LE, Hamilton AJ, Figueroa JI, et al. Production of specific monoclonal antibodies to Aspergillus species and their use in immunohistochemical identification of aspergillosis. J Clin Microbiol, 1999,37:1221- 1223.
[9]Reed JA, Hemann BA, Alexander JL, et al. Immuno- mycology: rapid and specific immunocytochemical identifition of fungi in formalin- fixed, paraffin- embedded material. J Histochem Cytochem, 1993,41:1217- 1221., 百拇医药
狄梅 涂平 李若瑜 王端礼
摘 要 目的 探索在组织中鉴定重要条件致病真菌的组织病理学方法。方法 对实验小鼠白念珠菌感染组织和可疑念珠菌、隐球菌和曲霉感染的临床组织病理标本进行PAS染色和免疫组化染色，并比较了两种方法的敏感性。结果 兔抗白念珠菌多克隆抗体、兔抗新生隐球菌多克隆抗体和鼠抗曲霉单克隆抗体可以分别鉴定组织中的白念珠菌、新生隐球菌和曲霉。免疫组化和PAS染色的敏感性差异无显著性。结论 免疫组化为组织中确定真菌和鉴定真菌种属提供了新的可靠方法，有助于临床诊断，因而具有广阔应用前景。
关键词：念珠菌属；隐球菌属；曲霉菌属；免疫组织化学
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念珠菌、隐球菌和曲霉是常见的条件致病真菌，它们引起的感染呈逐年上升趋势。组织病理学是重要的诊断方法之一，传统的HE染色和PAS染色仅通过形态学鉴定组织中的真菌，因而具有一定局限性，免疫组化染色根据真菌抗原性不同鉴定组织中真菌，提高了真菌鉴定的特异性和病原学诊断水平[1]。
资料和方法
一、标本来源
1.实验小鼠肾脏：Ⅱ级昆明小鼠9只，鼠尾静脉注射白念珠菌2×105cfu/鼠，7d后处死，无菌条件下取肾脏，经3.33mol/L(10%)福尔马林固定，用于组织病理学研究。
2.临床标本：共28份，均属回顾性研究。标本来源：肺9例，脑组织1例，胃粘膜3例，心瓣膜2例，肾动脉1例，鼻咽部5例，声带1例，皮肤5例，尿管型1例。根据组织中真菌形态分为可疑念珠菌感染7例，可疑隐球菌感染9例和可疑曲霉感染12例。
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二、组织病理学检查
1.HE染色和PAS染色：与常规组织病理学方法相同。
2.免疫组化染色：采用过氧化物酶标记链霉亲和素法(LSAB法)，切片常规脱蜡入水；0.3%过氧化氢，室温，30min；10%羊血清，室温，30min；一抗，37℃，30min；二抗，37℃，30min；三抗，37℃，20min；DAB显色；常规脱水、透明、封片。
3.一抗种类：兔抗白念珠菌多克隆抗体(B0794)，Dako公司赠送，对白念珠菌特异；兔抗新生隐球菌多克隆抗体(B3002)，购自Dako公司，对新生隐球菌特异；鼠抗曲霉单克隆抗体(M3564)，购自Dako公司，对烟曲霉和黑曲霉特异。
结果
一、念珠菌感染
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(一)动物实验部分：
1.小鼠播散性白念珠菌感染1周时，肾脏呈轻微病变、淋巴细胞浸润或化脓性改变。HE染色孢子和菌丝淡染，略嗜碱，不易发现，结构不清晰。PAS染色见白念珠菌多位于集合管和肾小盏中。个别见于肾小管、输尿管内。真菌细胞多聚集存在，均表现为菌丝和孢子共存，易见芽管。孢子和菌丝全部染成紫红色，中央略淡。芽生孢子呈椭圆形，壁薄，直径一般3～6μm，可见发芽。菌丝多呈假菌丝，较细，较直，分支少。
2.小鼠肾脏抗白念珠菌抗体免疫组化染色：①7例肾脏组织兔抗白念珠菌多克隆抗体免疫组化染色为阳性(7/9)，孢子和菌丝染成棕褐色，与PAS染色结果一致。②取2只感染小鼠肾脏做连续切片，相邻切片分别做PAS染色和免疫组化染色，各64张切片，两种染色阳性和阴性结果完全一致，阳性49张，阴性15张。阳性率为49/64，经统计学处理(χ2检验，P>0.5)，差异无显著性。
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1.7份临床标本PAS染色见真菌细胞以孢子和菌丝形态共存，易见芽管。孢子和菌丝全部染成紫红色，中央略淡。芽生孢子呈椭圆形，壁薄，可见发芽。菌丝多呈假菌丝，较细，较直，分支少。形态学可疑为念珠菌感染，只有1份培养结果为白念珠菌，可以确诊白念珠菌病。
2.免疫组化染色见孢子和菌丝全部呈棕褐色，细胞形态较清晰，背景为淡棕色，较易判断。7份临床标本有6份染色阳性，对照试验中见兔抗白念珠菌多克隆抗体与新生隐球菌和部分曲霉有弱阳性反应。结合后两者的形态学可排除隐球菌和曲霉感染。因而，进一步诊断为白念珠菌感染。
3.在病理改变为肉芽肿的病例中，多核巨细胞内可见到弥散、细颗粒状阳性染色物质，而结节病组织切片作为对照，多核巨细胞内未见阳性染色。
二、隐球菌感染
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1.隐球菌感染多为肉芽肿改变，也可见胶质样改变。肉芽肿病变中孢子少，胶质样病变中菌量多。本实验中组织内见大量隐球菌的2例患者均有长期大量口服皮质类固醇史，且病变中淋巴细胞和巨噬细胞少。
2.9份临床标本PAS染色可见组织中大小不一的孢子，圆形、椭圆形，中央染色略淡，2份可见孢子发芽。1份脑组织渗出液中孢子多为圆形，荚膜明显厚于组织中孢子，考虑为隐球菌感染。有3例同时伴发皮肤隐球菌病的患者，经培养证实病原体为新生隐球菌。
3.9份临床标本免疫组化染色均获阳性结果，孢子染成棕褐色，形态同PAS染色，进一步诊断为新生隐球菌感染。
4.肉芽肿损害中可见组织细胞和多核巨细胞吞噬孢子现象，而且部分组织细胞和多核巨细胞胞浆呈阳性染色。结节病中多核巨细胞未见阳性染色。
5.对照试验表明兔抗新生隐球菌多克隆抗体与白念珠菌和曲霉无交叉反应。
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三、曲霉感染
1.12份可疑曲霉感染的临床标本HE染色和PAS染色见真菌成分有类似结构，主要以菌丝存在，菌丝多平行排列，粗细不一，叉状分支，可见膨大的泡状结构，分隔少，5份菌丝纵横交错，可见大量平行菌丝和菌丝断面，形成真菌球。形态学上考虑为曲霉病。
2.免疫组化染色证实7份为阳性，菌丝被染成棕褐色，细胞壁染色明显，进一步证实为曲霉感染。
3.对照实验表明鼠抗曲霉单克隆抗体与白念珠菌、新生隐球菌无交叉反应。
讨论
近年来，条件致病真菌引起的真菌病在增加，条件致病真菌引起的深部真菌病往往被误诊为肿瘤和其它感染，本实验回顾性研究的28例患者除5例伴有皮肤损害的真菌感染外，其余均被误诊，经组织病理学证实为真菌感染。目前组织病理学诊断真菌病还停留在一个较低的水平，5例深部念珠菌感染患者均被诊断为霉菌感染，而12例丝状真菌感染患者也只诊断到霉菌感染水平，只有隐球菌感染获得了较明确的诊断。
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很多真菌在组织中形态相似，且真菌形态受多种因素影响，给形态学确定真菌种类造成困难。免疫组化根据真菌抗原性的不同，可在组织切片中将真菌分类。本实验所用方法是LSAB法，即标记链霉亲和素法。白念珠菌是念珠菌感染中的主要致病菌，本实验所用兔抗白念珠菌多克隆抗体能够特异性检出白念珠菌，此抗体虽然与隐球菌和部分曲霉有弱的交叉反应，但是结合PAS染色的形态改变，如隐球菌主要以孢子存在，极少形成菌丝，而曲霉多以菌丝存在，菌丝粗大，有叉状分支，所以依然可以诊断白念珠菌感染。此抗体和PAS染色检出的敏感性差异无显著性[2,3]。白念珠菌与多种人体组织有交叉免疫，需做多种对照慎重作出诊断。兔抗新生隐球菌多克隆抗体能够特异性检出组织中的新生隐球菌，此抗体与白念珠菌和曲霉均不发生交叉反应，特异性好[4,5]。鼠抗曲霉单克隆抗体可以检出组织中烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉。烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉是曲霉病主要致病菌，阳性结果可以作出曲霉感染的诊断[6-8]。在念珠菌和隐球菌感染体的免疫组化染色中，均看到一种现象，即肉芽肿病变中部分组织细胞和多核巨细胞胞浆内有阳性染色。而非真菌肉芽肿损害中无阳性结果，这与数位国外学者得出的结果一致[5]，提示真菌肉芽肿这种阳性染色模式具有一定特异性。可能与真菌抗原在体内被组织细胞呈递处理有关。肉芽肿中阳性染色是否可以做为特异性染色成为诊断依据还需进一步研究探索。免疫组化为组织中确定真菌和鉴定真菌类别提供了新的可靠方法，有助于条件致病真菌感染的诊断。随着特异性抗体的增多和交叉反应的减少，真菌感染的免疫组化将有较好的应用前景。
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卫生部临床学科重点项目资助课题
作者单位：涂平(100034北京大学第一医院皮肤科)
李若瑜(100034北京大学第一医院皮肤科)
王端礼(100034北京大学第一医院皮肤科)
狄梅(研修生，现在北京安贞医院皮肤科100029)
参考文献
[1]Jensen HE, Schonheyder HC, Hotchi M， et al. Diagnosis of systemic mycoses by specific immunohistochemical tests. APMIS, 1996,104:241- 258.
, 百拇医药
[2] Rocha DC, Duarte MI, Pagliari C, et al. Immunohistochemistry diagnosis of fungal infections. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo, 1998,53:184- 188.
[3]Williams DW, Jonesa HS, Allison RT, et al. Immunocytochemical detection of Candid albicans in formalin fixed, paraffin embedded material. J Clin Pathol, 1998,51:857- 859.
[4]唐书谦,叶庆佾,钟白玉,等.隐球菌免疫组化染色观察.中华皮肤科杂志,1994,27:307.
[5]Lee SC, Casadevall A， Dickson DW. Immunohistochemical localization of capsular polysaccharide antigen in the central nervous system cells in cryptococcal meningo- encephalitis. Am J Pathol, 1996,148:1267- 1274.
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[6]Jensen HE， Salonen J, Ekfors TO. The use of immunohistochemistry to improve sensitivity and specificity in the diagnosis of systemic mycoses in patients with haematological malignancies. J Pathol, 1997,181:100- 105.
[7]Kaufman L, Standard PG, Jalbert M, et al. Immunohistologic identification of Aspergillus spp. and other hyaline fungi by using polyclonal fluorescent antibodies. J Clin Microbiol, 1997,35:2206- 2209.
[8]Fenelon LE, Hamilton AJ, Figueroa JI, et al. Production of specific monoclonal antibodies to Aspergillus species and their use in immunohistochemical identification of aspergillosis. J Clin Microbiol, 1999,37:1221- 1223.
[9]Reed JA, Hemann BA, Alexander JL, et al. Immuno- mycology: rapid and specific immunocytochemical identifition of fungi in formalin- fixed, paraffin- embedded material. J Histochem Cytochem, 1993,41:1217- 1221., 百拇医药