胎鼠宫内缺血、缺氧后脑细胞凋亡及其相关基因的表达
胎鼠宫内缺血、缺氧后脑细胞凋亡及其相关基因的表达
宋薇薇 高红 韩玉昆 尚涛
关键词：大白鼠；宫内缺血；缺氧；脑；细胞凋亡 90年代以来，关于围产期胎儿窒息后脑损伤的本质及损伤开始的确切时间的研究倍受关注。我们以大白鼠为模型，对宫内缺血、缺氧后脑细胞的凋亡及其相关基因B细胞淋巴瘤2(bcl-2)、bcl相关x蛋白(bax)以及转化生长因子β(TGF-β)的表达进行研究，现报道如下。
一、材料与方法
1.动物模型的建立：妊娠21 d Wistar雌性大白鼠，以5%戊巴比妥钠腹腔麻醉后开腹，暴露出供应子宫、卵巢的动、静脉血管，以动脉夹钳夹一侧动、静脉血管，对侧行假手术(对照组)，钳夹30 min后取下动脉夹，关腹，使胎鼠在母鼠体内分别再灌注0、1、4、8、15及24 h，分别选取体重均匀的胎鼠共35只。
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2.方法：(1)满足上述条件后立即剖宫取出胎鼠，断头，无菌条件下取大脑半球组织进行DNA的提取及电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察照相。(2)半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测bcl-2，bax，TGF-β mRNA的表达：提取总RNA后进行cDNA第1链的合成：bax、bcl-2及内参照β-肌动蛋白(β-actin)的引物序列参照文献[1]，TGF-β序列参照文献[2]：分别以上述引物进行PCR扩增后产物电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察，用kodak,1D型凝胶成像系统与β-actin对照，对其扩增产物行半定量分析。
3.统计学处理：所有数据均采用X±s表示，以SPSS统计软件行t检验及方差分析。
二、结果
1.缺血、缺氧及再灌注不同时间胎鼠状况：宫内缺血、缺氧30 min及再灌注4 h内，剖宫产后的胎鼠皮肤红润，肢体运动良好。再灌注8 h以上偶有死亡，至24 h死亡率达61.3%。
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2.DNA电泳：对照组主要表现为大分子量的DNA片段。宫内缺血、缺氧30 min当时，即可以看到DNA阶梯带的数目明显增多，再灌注4 h左右，阶梯带变化不明显，8 h减弱较明显，主要表现为涂抹；至15 h左右，在涂抹的基础上可见阶梯带又明显出现，大约24 h时，主要为片状涂抹。见图1。
1：为Marker(ФX174) 2：为对照组 3：为缺血当时 4：为再灌注1 h 5：为再灌注4 h 6：为再灌注8 h 7：为再灌注15 h 8：为再灌注24 h(下同)
图1 缺血30 min时 DNA电泳分析
3.半定量RT-PCR检测细胞凋亡及其相关基因表达：缺血、缺氧30 min时，bcl-2的表达即显著低于对照组(P<0.05)；再灌注后bcl-2的表达进行性升高，15 h左右显著超过对照组表达的水平，达最高点，方差分析显示，此时与再灌注各时间点bcl-2的表达差异均有极显著性(P<0.01)。缺血、缺氧30 min时，bax表达升高显著(P<0.05)，随再灌注时间的延长进行性升高，4～8 h达高峰(P<0.01)，随后有下降趋势。bcl-2与bax比值表现为逐步降低，4～8 h达最低点。
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TGF-β的表达，在缺血、缺氧当时升高明显(P<0.01)，再灌注后无显著变化，但仍明显高于对照组(P<0.01)；15 h左右降至最低，与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。图2～5。
表1 凋亡相关基因在胎鼠宫内缺血、缺氧30 min及再灌注不同时间的表达(X±s)
类别
例数
对照组
缺血当时
再灌注
1 h
再灌注
4 h
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再灌注
8 h
再灌注
15 h
再灌注
24 h
bcl-2
35
0.263±0.054
0.165±0.074
0.167±0.073
0.176±0.059
, 百拇医药 0.227±0.086
0.474±0.082
0.248±0.038
bax
35
0.194±0.065
0.617±0.168
0.682±0.118
0.184±0.098
1.281±0.157
0.687±0.432
2.311±0.098
, 百拇医药
TGF-β
35
0.072±0.011
0.464±0.022
0.383±0.012
0.380±0.047
0.245±0.017
0.100±0.015
0.282±0.044
, 百拇医药
图2 缺血30 min时β-actin(内参照)电泳分析
图3 缺血30 min时bcl-2 mRNA电泳分析
图4 缺血30 min时bax mRNA电泳分析
图5 缺血30 min时TGF-β mRNA电泳分析
, 百拇医药
三、讨论
1.宫内缺血、缺氧后脑细胞死亡情况：神经组织结构的多样性决定了其死亡形式的多样性。Choi[3]发现，在死亡初期，神经元在一定的信号作用下发生凋亡，在这一过程中，如果这些信号很强，则正在凋亡的细胞可能转而出现坏死的病理特征，这也就是所谓的凋亡继发坏死。DNA电泳是一种相对较特异的诊断方法，可以此作为凋亡的依据；而细胞坏死时电泳呈涂抹状。
我们的研究发现，在对照组DNA电泳中可以看到梯形带，这是因为凋亡及其调节基因在正常中枢神经系统的发育过程中，也起重要作用。较长时间(30 min)宫内缺血、缺氧时，凋亡已经显著发生。再灌注4 h内，凋亡无明显变化，但在上述梯形带之间有涂抹，说明细胞坏死在此时也相伴随，但以凋亡为主，这与Katsuyuki等[4]在视网膜神经细胞中的研究结果一致。大约15 h左右，在细胞坏死的基础上，又出现凋亡；24 h左右主要是坏死，说明此时细胞坏死已开始占优势。因此，可以认为，在严重的宫内缺血、缺氧及再灌注的24 h内，脑细胞的死亡开始以凋亡为主，伴随坏死，又继发坏死。
, 百拇医药
2.脑细胞凋亡相关基因的表达：凋亡是一种基因调节的程序性细胞死亡，因而目前对凋亡的研究已经超越形态学观察的范畴，探讨何种基因通过何种途径诱发凋亡是当前的研 究热点，也是进一步探索治疗的依据。许多研究表明，bcl-2 是细胞凋亡途径中的一个重要调节因子，对凋亡的抑制起重要作用。bax是bcl-2的同源基因，是与bcl-2结合产生效应的同源分子，其能与bcl-2形成异源二聚体分子，促进细胞的程序性死亡。两者的比值是决定凋亡与否的重要依据。TGF是近年来研究较热的细胞因子之一，其参与了多种细胞功能。乔文等[5]对胃腺癌细胞系的研究证实，TGF-β对胃癌细胞的凋亡诱导作用可能与其影响bcl-2表达有关。但宫内缺血、缺氧后上述基因变化的研究尚未见报道。
我们的研究发现，严重的宫内缺血、缺氧及再灌注早期，细胞凋亡也起重要作用。在这一过程中，bcl-2, bax及TGF-β均发生了明显的变化；在宫内缺血、缺氧当时，抑制细胞凋亡的bcl-2显著降低，促进细胞凋亡的bax及TGF-β即开始显著升高，而此时DNA电泳出现明显的阶梯带，无疑证实了上述基因参与了凋亡的发生；再灌注后3者均发生动态变化，参与凋亡及坏死的过程。另外，上述基因在24 h后继续变化，可能参与迟发性脑损伤过程，值得我们进一步研究。
, 百拇医药
本研究探讨了宫内缺血、缺氧及再灌注的过程中脑细胞的变化，证实重度缺血、缺氧后，在许多凋亡相关基因的调节下，凋亡可以在宫内发生，为新生儿缺氧、缺血性脑损伤的早期治疗提供了有价值的理论基础，并为应用基因治疗提供了依据。
宋薇薇(110003 沈阳，中国医科大学附属第二临床学院妇产科)
高红(卫生部小儿先天畸形重点实验室)
韩玉昆(新生儿科)
尚涛(110003 沈阳，中国医科大学附属第二临床学院妇产科)
参考文献
1，Fumiko KN, Toshiyuki Y, Yoshiko K, et al. Down-regulation of c-myc and bcl-2 gene expression in PU. 1 induced apoptosis in murine erythroleukemia cells. Int J Cancer, 1998, 76: 523-530.
, http://www.100md.com
2，Rajvir D, Celeste L, Peter C, et al. Differential gene expression of transforming growth factors alpha and beta, epidermal growth factor, keratinocyte growth factor, and their receptors in fetal and adult human prostatic tissues and cancer cell lines. Urology, 1996, 48: 963-970.
3，Choi DW. Ischemia-induced neuronal apoptosis. Curr Opin Neurobiol, 1996, 6: 667-672.
4，Katsuyuki K, Satoshi K, Takayuki K, et al. Apoptotic DNA fragmentation and upregulation of Bax induced by transient ischemia of the rat retina. Brain Research, 1999, 815: 11-20.
5，乔文，胡家露，王剑波. 对胃癌细胞SGC-7901 bcl-2表达的影响. 第四军医大学学报， 1998，19：539-540., 百拇医药
宋薇薇 高红 韩玉昆 尚涛
关键词：大白鼠；宫内缺血；缺氧；脑；细胞凋亡 90年代以来，关于围产期胎儿窒息后脑损伤的本质及损伤开始的确切时间的研究倍受关注。我们以大白鼠为模型，对宫内缺血、缺氧后脑细胞的凋亡及其相关基因B细胞淋巴瘤2(bcl-2)、bcl相关x蛋白(bax)以及转化生长因子β(TGF-β)的表达进行研究，现报道如下。
一、材料与方法
1.动物模型的建立：妊娠21 d Wistar雌性大白鼠，以5%戊巴比妥钠腹腔麻醉后开腹，暴露出供应子宫、卵巢的动、静脉血管，以动脉夹钳夹一侧动、静脉血管，对侧行假手术(对照组)，钳夹30 min后取下动脉夹，关腹，使胎鼠在母鼠体内分别再灌注0、1、4、8、15及24 h，分别选取体重均匀的胎鼠共35只。
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2.方法：(1)满足上述条件后立即剖宫取出胎鼠，断头，无菌条件下取大脑半球组织进行DNA的提取及电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察照相。(2)半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测bcl-2，bax，TGF-β mRNA的表达：提取总RNA后进行cDNA第1链的合成：bax、bcl-2及内参照β-肌动蛋白(β-actin)的引物序列参照文献[1]，TGF-β序列参照文献[2]：分别以上述引物进行PCR扩增后产物电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察，用kodak,1D型凝胶成像系统与β-actin对照，对其扩增产物行半定量分析。
3.统计学处理：所有数据均采用X±s表示，以SPSS统计软件行t检验及方差分析。
二、结果
1.缺血、缺氧及再灌注不同时间胎鼠状况：宫内缺血、缺氧30 min及再灌注4 h内，剖宫产后的胎鼠皮肤红润，肢体运动良好。再灌注8 h以上偶有死亡，至24 h死亡率达61.3%。
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2.DNA电泳：对照组主要表现为大分子量的DNA片段。宫内缺血、缺氧30 min当时，即可以看到DNA阶梯带的数目明显增多，再灌注4 h左右，阶梯带变化不明显，8 h减弱较明显，主要表现为涂抹；至15 h左右，在涂抹的基础上可见阶梯带又明显出现，大约24 h时，主要为片状涂抹。见图1。
1：为Marker(ФX174) 2：为对照组 3：为缺血当时 4：为再灌注1 h 5：为再灌注4 h 6：为再灌注8 h 7：为再灌注15 h 8：为再灌注24 h(下同)
图1 缺血30 min时 DNA电泳分析
3.半定量RT-PCR检测细胞凋亡及其相关基因表达：缺血、缺氧30 min时，bcl-2的表达即显著低于对照组(P<0.05)；再灌注后bcl-2的表达进行性升高，15 h左右显著超过对照组表达的水平，达最高点，方差分析显示，此时与再灌注各时间点bcl-2的表达差异均有极显著性(P<0.01)。缺血、缺氧30 min时，bax表达升高显著(P<0.05)，随再灌注时间的延长进行性升高，4～8 h达高峰(P<0.01)，随后有下降趋势。bcl-2与bax比值表现为逐步降低，4～8 h达最低点。
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TGF-β的表达，在缺血、缺氧当时升高明显(P<0.01)，再灌注后无显著变化，但仍明显高于对照组(P<0.01)；15 h左右降至最低，与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。图2～5。
表1 凋亡相关基因在胎鼠宫内缺血、缺氧30 min及再灌注不同时间的表达(X±s)
类别
例数
对照组
缺血当时
再灌注
1 h
再灌注
4 h
, http://www.100md.com
再灌注
8 h
再灌注
15 h
再灌注
24 h
bcl-2
35
0.263±0.054
0.165±0.074
0.167±0.073
0.176±0.059
, 百拇医药 0.227±0.086
0.474±0.082
0.248±0.038
bax
35
0.194±0.065
0.617±0.168
0.682±0.118
0.184±0.098
1.281±0.157
0.687±0.432
2.311±0.098
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TGF-β
35
0.072±0.011
0.464±0.022
0.383±0.012
0.380±0.047
0.245±0.017
0.100±0.015
0.282±0.044
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图2 缺血30 min时β-actin(内参照)电泳分析
图3 缺血30 min时bcl-2 mRNA电泳分析
图4 缺血30 min时bax mRNA电泳分析
图5 缺血30 min时TGF-β mRNA电泳分析
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三、讨论
1.宫内缺血、缺氧后脑细胞死亡情况：神经组织结构的多样性决定了其死亡形式的多样性。Choi[3]发现，在死亡初期，神经元在一定的信号作用下发生凋亡，在这一过程中，如果这些信号很强，则正在凋亡的细胞可能转而出现坏死的病理特征，这也就是所谓的凋亡继发坏死。DNA电泳是一种相对较特异的诊断方法，可以此作为凋亡的依据；而细胞坏死时电泳呈涂抹状。
我们的研究发现，在对照组DNA电泳中可以看到梯形带，这是因为凋亡及其调节基因在正常中枢神经系统的发育过程中，也起重要作用。较长时间(30 min)宫内缺血、缺氧时，凋亡已经显著发生。再灌注4 h内，凋亡无明显变化，但在上述梯形带之间有涂抹，说明细胞坏死在此时也相伴随，但以凋亡为主，这与Katsuyuki等[4]在视网膜神经细胞中的研究结果一致。大约15 h左右，在细胞坏死的基础上，又出现凋亡；24 h左右主要是坏死，说明此时细胞坏死已开始占优势。因此，可以认为，在严重的宫内缺血、缺氧及再灌注的24 h内，脑细胞的死亡开始以凋亡为主，伴随坏死，又继发坏死。
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2.脑细胞凋亡相关基因的表达：凋亡是一种基因调节的程序性细胞死亡，因而目前对凋亡的研究已经超越形态学观察的范畴，探讨何种基因通过何种途径诱发凋亡是当前的研 究热点，也是进一步探索治疗的依据。许多研究表明，bcl-2 是细胞凋亡途径中的一个重要调节因子，对凋亡的抑制起重要作用。bax是bcl-2的同源基因，是与bcl-2结合产生效应的同源分子，其能与bcl-2形成异源二聚体分子，促进细胞的程序性死亡。两者的比值是决定凋亡与否的重要依据。TGF是近年来研究较热的细胞因子之一，其参与了多种细胞功能。乔文等[5]对胃腺癌细胞系的研究证实，TGF-β对胃癌细胞的凋亡诱导作用可能与其影响bcl-2表达有关。但宫内缺血、缺氧后上述基因变化的研究尚未见报道。
我们的研究发现，严重的宫内缺血、缺氧及再灌注早期，细胞凋亡也起重要作用。在这一过程中，bcl-2, bax及TGF-β均发生了明显的变化；在宫内缺血、缺氧当时，抑制细胞凋亡的bcl-2显著降低，促进细胞凋亡的bax及TGF-β即开始显著升高，而此时DNA电泳出现明显的阶梯带，无疑证实了上述基因参与了凋亡的发生；再灌注后3者均发生动态变化，参与凋亡及坏死的过程。另外，上述基因在24 h后继续变化，可能参与迟发性脑损伤过程，值得我们进一步研究。
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本研究探讨了宫内缺血、缺氧及再灌注的过程中脑细胞的变化，证实重度缺血、缺氧后，在许多凋亡相关基因的调节下，凋亡可以在宫内发生，为新生儿缺氧、缺血性脑损伤的早期治疗提供了有价值的理论基础，并为应用基因治疗提供了依据。
宋薇薇(110003 沈阳，中国医科大学附属第二临床学院妇产科)
高红(卫生部小儿先天畸形重点实验室)
韩玉昆(新生儿科)
尚涛(110003 沈阳，中国医科大学附属第二临床学院妇产科)
参考文献
1，Fumiko KN, Toshiyuki Y, Yoshiko K, et al. Down-regulation of c-myc and bcl-2 gene expression in PU. 1 induced apoptosis in murine erythroleukemia cells. Int J Cancer, 1998, 76: 523-530.
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2，Rajvir D, Celeste L, Peter C, et al. Differential gene expression of transforming growth factors alpha and beta, epidermal growth factor, keratinocyte growth factor, and their receptors in fetal and adult human prostatic tissues and cancer cell lines. Urology, 1996, 48: 963-970.
3，Choi DW. Ischemia-induced neuronal apoptosis. Curr Opin Neurobiol, 1996, 6: 667-672.
4，Katsuyuki K, Satoshi K, Takayuki K, et al. Apoptotic DNA fragmentation and upregulation of Bax induced by transient ischemia of the rat retina. Brain Research, 1999, 815: 11-20.
5，乔文，胡家露，王剑波. 对胃癌细胞SGC-7901 bcl-2表达的影响. 第四军医大学学报， 1998，19：539-540., 百拇医药