体外培养24小时受精失败卵母细胞单精子显微注射再授精的观察
体外培养24小时受精失败卵母细胞单精子显微注射再授精的观察
李蓉 庄广伦 周灿权 张敏芳
摘 要 目的 探讨采用单精子显微注射(ICSI)技术处理体外培养24 h后常规体外受精(IVF)失败卵母细胞的效果。方法 对1997年6月至1998年10月在我院生殖医学研究中心接受常规IVF治疗的17例非男性因素不育患者，采用常规超排卵方案治疗，经阴道B超介导取卵, 共获卵179个, 体外培养24 h, 所有卵母细胞在常规IVF失败后，采用ICSI再授精。结果 共有130个卵母细胞常规IVF失败后进行ICSI再授精， 25个 (19.2%) 卵母细胞在注射过程中受到损伤死亡, 100个存活卵母细胞正常受精, 受精率为76.9%，共移植18个周期，2例临床妊娠。结论 如暂不考虑ICSI再授精对胚胎染色体的影响，对于体外培养24 h受精失败的患者，ICSI再授精不失为一个有效的补救方法。
, 百拇医药
关键词：卵母细胞；受精, 体外；胚泡移植
1994年以来, 陆续有采用卵母细胞单精子显微注射(ICSI)技术处理体外培养24 h受精失败的卵母细胞, 并取得妊娠成功的报道[1]。我中心采用ICSI技术治疗17例体外培养24 h常规体外受精(IVF)失败、非男性因素不育患者，现将结果报告如下。
资料和方法
一、研究对象
为1997年6月至1998年10月，在本中心接受常规IVF治疗的17例非男性因素不育, 常规IVF取卵后24 h受精失败者。不育患者的不育原因包括输卵管阻塞、盆腔粘连、子宫内膜异位症、排卵障碍。女方平均年龄为(33.3±3.9)岁，男方平均年龄为(35.2±4.7)岁，不育时间为(6.9±3.3)年，常规IVF共取卵179个(10个/例), 体外培养24 h后所有卵母细胞均未受精。
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二、方法
1.控制性超排卵：采用本中心常规IVF-胚胎移植(ET)超排卵方案[2]，注射绒毛膜促性腺激素(hCG)34～36 h后经阴道B超介导取卵，取卵日显微镜下观察所有卵丘、卵母细胞复合物形态无异常。
2.精液处理：精液处理采用Percoll梯度离心，精子浓度调至约20×106个/ml，常规IVF受精在矿物油覆盖的微滴内进行，根据精子的活动度，微滴内精子浓度约为1×105个/ml～3×105个/ml, ICSI再授精采用取卵日处理的精子。
3.卵母细胞的处理：常规IVF受精后16～18 h， 予以去卵丘处理, 检查原核及第二极体以确认受精与否，179个卵母细胞均未受精, 未受精卵予以清洗以去除附着于透明带的精子， 选择核网期(MⅡ期)成熟卵母细胞进行ICSI再授精。
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4. ICSI显微操作：采用英国RI公司的显微操作系统，配以倒置显微镜，在放大200倍下进行显微操作，操作的要点是精子的制动和确保精子进入卵母细胞胞浆。携带精子的显微注射针进入细胞浆后，回吸部分胞浆表明卵膜穿破，然后将精子及被回吸的部分胞浆一起注入卵母细胞胞浆中[3]。有18个周期共130个胞浆松散的未受精MⅡ期成熟卵母细胞(有第一极体)进行ICSI再授精。
5.胚胎移植：显微注射后20～24 h后检查受精情况。正常受精的标准为见到两个独立的或有碎片的极体的同时，有两个清晰的原核。继续培养24～28 h，选择无核碎片<50%的胚胎进行宫腔内移植，无核碎片<20%的剩余胚胎予以冷冻保存。部分受精卵此时处于原核阶段，如总胚胎数<4个，原核阶段的胚胎也予以宫腔内移植。临床妊娠检查：胚胎移植后2周行尿妊娠试验检查；移植后5周行B超检查，有胎心音为临床妊娠。
结果
注射后存活卵母细胞为105个(80.8%)，另外25个卵母细胞在注射过程中受到损伤死亡。100个卵母细胞正常受精，受精率为76.9%。其余存活卵母细胞不受精或发生多精受精。79个(79.0%)正常受精的胚胎发生卵裂，平均每个周期移植胚胎数为3.3个，冷冻保存胚胎数6.0个，临床妊娠2例。
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妊娠的2例均为原发不育(输卵管阻塞)，男方精液常规检查均正常。1例(年龄29岁，男方年龄36岁，不育2年)共取卵7个，取卵后24 h常规IVF未受精，6个成熟卵母细胞行ICSI再授精，并发生正常受精及卵裂，因不符合冷冻胚胎的要求，故6个胚胎均于取卵周期移植，2周后尿妊娠试验阳性，5周后B超检查示胎心搏动。另1例(年龄30岁，男方年龄35岁，不育6年)共取卵22个，取卵后24 h常规IVF未受精，MⅡ期卵母细胞16个，ICSI再授精后13个卵母细胞正常受精，10个卵裂，取卵周期移植胚胎4个，冷冻保存胚胎6个，取卵周期妊娠失败后移植冷冻胚胎，B超检查示有胎心搏动。
讨论
一、 ICSI再授精是常规IVF未受精的补救方法
非男性因素不育患者常规IVF失败的原因有：(1)取卵日大部分卵母细胞不成熟, 经体外培养后释放第一极体, 但随体外培养时间的延长卵膜和透明带变韧, 导致常规IVF失败。 ICSI技术能较好的解决这部分卵母细胞的受精。(2)精卵结合障碍。其原因之一是精子与卵母细胞透明带结合后不能发生顶体反应[4]；也有学者认为是体外培养环境使透明带表面结构发生改变，因而影响精子与透明带的结合能力，ICSI技术直接将精子注射到卵母细胞浆内，使这部分卵母细胞受精。(3)卵母细胞与精子的发育不同步。这与卵母细胞不完全成熟有关，从而使精原核的形成落后于卵原核，卵母细胞胞质的不完全成熟也影响了受精卵的进一步卵裂。ICSI技术不能提高这部分卵细胞的受精率。
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常规IVF未受精率约为10%～25%，大部分为不明原因不育。本研究说明采用ICSI技术再授精，可挽救部分由于卵母细胞不成熟或精卵结合障碍所致的常规IVF不受精的不育患者。
二、 ICSI再授精的临床意义
ICSI再授精仍是一个有争议的方法，尽管受精率和卵裂率都较高，但妊娠率较低。其原因可能为：(1)不成熟卵母细胞体外培养成熟过程中， 细胞核成熟排出第一极体， 但细胞浆未成熟， 尚未合成维持胚胎进一步发育的有关成分。 因此， 即使卵母细胞受精并发育至4～8细胞期， 仍无法进一步发育， 从而导致妊娠失败。(2)胚胎的发育与子宫内膜的发育不同步。(3)发生染色体退化的卵母细胞虽具有受精和卵裂的潜能，但形成的胚胎不能着床。而且体外培养24 h后，极体位置发生改变，显微注射时有可能损伤纺锤体，导致胚胎染色体异常。基于上述3点，ICSI的临床应用价值有待进一步探讨。但ICSI可作为不育患者选择下一周期受精方法的参考，对研究受精过程也有一定的参考价值。
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作者单位：李蓉(510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科)
庄广伦(510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科)
周灿权(510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科)
张敏芳(510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科)
参考文献
1，Lundin K, Sjogren A, Hamberger L, et al. Reinsemination of one-day-old oocytes by use of intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril，1996，66:118-121.
2，庄广伦，周灿权，张绣俊，等.体外受精-胚胎移植34例报告.生殖医学杂志，1992，1：24-26.
3，李蓉，庄广伦，张敏芳.卵母细胞单精子显微注射治疗男性不育及不明原因不育.中华妇产科杂志，1997，32：211-213.
4，Liu DY, Baker HW. Disorder acrosome reaction of spermatozoa bound to the zona pellucida: a newly discovered sperm defect causing infertility with reduced sperm-zona pellucida penetration and reduced fertilization in vitro. Hum Reprod，1994，9:1694-1670., 百拇医药
李蓉 庄广伦 周灿权 张敏芳
摘 要 目的 探讨采用单精子显微注射(ICSI)技术处理体外培养24 h后常规体外受精(IVF)失败卵母细胞的效果。方法 对1997年6月至1998年10月在我院生殖医学研究中心接受常规IVF治疗的17例非男性因素不育患者，采用常规超排卵方案治疗，经阴道B超介导取卵, 共获卵179个, 体外培养24 h, 所有卵母细胞在常规IVF失败后，采用ICSI再授精。结果 共有130个卵母细胞常规IVF失败后进行ICSI再授精， 25个 (19.2%) 卵母细胞在注射过程中受到损伤死亡, 100个存活卵母细胞正常受精, 受精率为76.9%，共移植18个周期，2例临床妊娠。结论 如暂不考虑ICSI再授精对胚胎染色体的影响，对于体外培养24 h受精失败的患者，ICSI再授精不失为一个有效的补救方法。
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关键词：卵母细胞；受精, 体外；胚泡移植
1994年以来, 陆续有采用卵母细胞单精子显微注射(ICSI)技术处理体外培养24 h受精失败的卵母细胞, 并取得妊娠成功的报道[1]。我中心采用ICSI技术治疗17例体外培养24 h常规体外受精(IVF)失败、非男性因素不育患者，现将结果报告如下。
资料和方法
一、研究对象
为1997年6月至1998年10月，在本中心接受常规IVF治疗的17例非男性因素不育, 常规IVF取卵后24 h受精失败者。不育患者的不育原因包括输卵管阻塞、盆腔粘连、子宫内膜异位症、排卵障碍。女方平均年龄为(33.3±3.9)岁，男方平均年龄为(35.2±4.7)岁，不育时间为(6.9±3.3)年，常规IVF共取卵179个(10个/例), 体外培养24 h后所有卵母细胞均未受精。
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二、方法
1.控制性超排卵：采用本中心常规IVF-胚胎移植(ET)超排卵方案[2]，注射绒毛膜促性腺激素(hCG)34～36 h后经阴道B超介导取卵，取卵日显微镜下观察所有卵丘、卵母细胞复合物形态无异常。
2.精液处理：精液处理采用Percoll梯度离心，精子浓度调至约20×106个/ml，常规IVF受精在矿物油覆盖的微滴内进行，根据精子的活动度，微滴内精子浓度约为1×105个/ml～3×105个/ml, ICSI再授精采用取卵日处理的精子。
3.卵母细胞的处理：常规IVF受精后16～18 h， 予以去卵丘处理, 检查原核及第二极体以确认受精与否，179个卵母细胞均未受精, 未受精卵予以清洗以去除附着于透明带的精子， 选择核网期(MⅡ期)成熟卵母细胞进行ICSI再授精。
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4. ICSI显微操作：采用英国RI公司的显微操作系统，配以倒置显微镜，在放大200倍下进行显微操作，操作的要点是精子的制动和确保精子进入卵母细胞胞浆。携带精子的显微注射针进入细胞浆后，回吸部分胞浆表明卵膜穿破，然后将精子及被回吸的部分胞浆一起注入卵母细胞胞浆中[3]。有18个周期共130个胞浆松散的未受精MⅡ期成熟卵母细胞(有第一极体)进行ICSI再授精。
5.胚胎移植：显微注射后20～24 h后检查受精情况。正常受精的标准为见到两个独立的或有碎片的极体的同时，有两个清晰的原核。继续培养24～28 h，选择无核碎片<50%的胚胎进行宫腔内移植，无核碎片<20%的剩余胚胎予以冷冻保存。部分受精卵此时处于原核阶段，如总胚胎数<4个，原核阶段的胚胎也予以宫腔内移植。临床妊娠检查：胚胎移植后2周行尿妊娠试验检查；移植后5周行B超检查，有胎心音为临床妊娠。
结果
注射后存活卵母细胞为105个(80.8%)，另外25个卵母细胞在注射过程中受到损伤死亡。100个卵母细胞正常受精，受精率为76.9%。其余存活卵母细胞不受精或发生多精受精。79个(79.0%)正常受精的胚胎发生卵裂，平均每个周期移植胚胎数为3.3个，冷冻保存胚胎数6.0个，临床妊娠2例。
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妊娠的2例均为原发不育(输卵管阻塞)，男方精液常规检查均正常。1例(年龄29岁，男方年龄36岁，不育2年)共取卵7个，取卵后24 h常规IVF未受精，6个成熟卵母细胞行ICSI再授精，并发生正常受精及卵裂，因不符合冷冻胚胎的要求，故6个胚胎均于取卵周期移植，2周后尿妊娠试验阳性，5周后B超检查示胎心搏动。另1例(年龄30岁，男方年龄35岁，不育6年)共取卵22个，取卵后24 h常规IVF未受精，MⅡ期卵母细胞16个，ICSI再授精后13个卵母细胞正常受精，10个卵裂，取卵周期移植胚胎4个，冷冻保存胚胎6个，取卵周期妊娠失败后移植冷冻胚胎，B超检查示有胎心搏动。
讨论
一、 ICSI再授精是常规IVF未受精的补救方法
非男性因素不育患者常规IVF失败的原因有：(1)取卵日大部分卵母细胞不成熟, 经体外培养后释放第一极体, 但随体外培养时间的延长卵膜和透明带变韧, 导致常规IVF失败。 ICSI技术能较好的解决这部分卵母细胞的受精。(2)精卵结合障碍。其原因之一是精子与卵母细胞透明带结合后不能发生顶体反应[4]；也有学者认为是体外培养环境使透明带表面结构发生改变，因而影响精子与透明带的结合能力，ICSI技术直接将精子注射到卵母细胞浆内，使这部分卵母细胞受精。(3)卵母细胞与精子的发育不同步。这与卵母细胞不完全成熟有关，从而使精原核的形成落后于卵原核，卵母细胞胞质的不完全成熟也影响了受精卵的进一步卵裂。ICSI技术不能提高这部分卵细胞的受精率。
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常规IVF未受精率约为10%～25%，大部分为不明原因不育。本研究说明采用ICSI技术再授精，可挽救部分由于卵母细胞不成熟或精卵结合障碍所致的常规IVF不受精的不育患者。
二、 ICSI再授精的临床意义
ICSI再授精仍是一个有争议的方法，尽管受精率和卵裂率都较高，但妊娠率较低。其原因可能为：(1)不成熟卵母细胞体外培养成熟过程中， 细胞核成熟排出第一极体， 但细胞浆未成熟， 尚未合成维持胚胎进一步发育的有关成分。 因此， 即使卵母细胞受精并发育至4～8细胞期， 仍无法进一步发育， 从而导致妊娠失败。(2)胚胎的发育与子宫内膜的发育不同步。(3)发生染色体退化的卵母细胞虽具有受精和卵裂的潜能，但形成的胚胎不能着床。而且体外培养24 h后，极体位置发生改变，显微注射时有可能损伤纺锤体，导致胚胎染色体异常。基于上述3点，ICSI的临床应用价值有待进一步探讨。但ICSI可作为不育患者选择下一周期受精方法的参考，对研究受精过程也有一定的参考价值。
, 百拇医药
作者单位：李蓉(510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科)
庄广伦(510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科)
周灿权(510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科)
张敏芳(510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科)
参考文献
1，Lundin K, Sjogren A, Hamberger L, et al. Reinsemination of one-day-old oocytes by use of intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril，1996，66:118-121.
2，庄广伦，周灿权，张绣俊，等.体外受精-胚胎移植34例报告.生殖医学杂志，1992，1：24-26.
3，李蓉，庄广伦，张敏芳.卵母细胞单精子显微注射治疗男性不育及不明原因不育.中华妇产科杂志，1997，32：211-213.
4，Liu DY, Baker HW. Disorder acrosome reaction of spermatozoa bound to the zona pellucida: a newly discovered sperm defect causing infertility with reduced sperm-zona pellucida penetration and reduced fertilization in vitro. Hum Reprod，1994，9:1694-1670., 百拇医药