子宫内膜异位症患者腹腔液肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的测定及其对人精子活动力和鼠胚胎的影响
子宫内膜异位症患者腹腔液肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的测定及其对人精子活动力和鼠胚胎的影响
刘义 罗丽兰 赵海波
摘 要 目的 了解子宫内膜内异症(内异症)患者腹腔液肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6) 水平的变化及对人精子活动力和鼠胚胎发育的影响。方法 将行诊断性腹腔镜检查的不孕患者25例，根据术后诊断分为内异症组(14例)和对照组(11例，盆腔正常)，利用双抗体夹心法检测其腹腔液和腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的水平。并将两组的腹腔液分别与人精子和鼠2细胞期胚胎进行体外培养，观察其对人精子活动力和鼠2细胞期胚胎发育的影响。结果 内异症组腹腔液和腹腔巨噬细胞培养上清液中 TNF-α[(0.33±0.15)μg/L，(7.19±0.60)μg/L]和IL-6[(0.49±0.68)μg/L，(1.51±0.08) μg/L]水平，较对照组明显升高(P<0.01)。精子与腹腔液孵育4 h后，内异症组精子直线前向运动率和总活动率分别为56.8%和66.2%，明显低于对照组的75.7%和80.8%(P<0.01)。体外培养48 h后，两组小鼠2细胞期胚胎发育成16细胞期胚胎的比例分别为32.5%和47.6%，差异有极显著性(P<0.01)。结论 腹腔液细胞因子水平升高可能是导致内异症患者不孕的原因。
, 百拇医药
关键词：子宫内膜异位症；肿瘤坏死因子；白细胞介素6；巨噬细胞；精子能动性；胎儿发育
子宫内膜异位症(内异症)尤其是轻症患者非机械性障碍引起不孕的机理至今尚未阐明。近年来的研究表明，内异症患者腹腔液中巨噬细胞数量增多，活性增强。通过释放多种活性物质，干扰了生殖过程中的某些环节。本研究以轻度内异症患者为研究对象，观察腹腔液肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平的变化及体外对人精子活动力和小鼠2细胞期胚胎发育的影响，探讨其不孕的原因。
资料与方法
一、研究对象
为1997年7月至1998年7月在我院行诊断性腹腔镜检查的不孕患者25例，根据术后诊断分为两组：内异症组14例，按美国生育协会 ( AFS )修正标准[1]分期，Ⅰ期 9例、Ⅱ期 5例，术前未经任何治疗；对照组 11例，腹腔镜检查为正常盆腔，诊断为不明原因不孕症。两组患者的年龄分别为(29.8±2.5)岁和(27.9±4.0)岁(X±s，下同)，不孕时间为(4.5±2.3)岁和(4.2±2.0)年,腹腔镜检查时的月经天数为第(15.1±4.2) 天和(13.8±2.5) 天，两组间差异均无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
二、方法
1.腹腔液的采集和处理：在腹腔镜直视下通过吸管抽取子宫直肠陷凹和子宫膀胱陷凹腹腔液5 ml，立即置于肝素化无菌离心管中，以2 000 r/min离心10 min，收集上清液置-40℃保存。管底沉淀以4 ml Hanks液重新制成细胞悬液。
2.巨噬细胞的分离、培养和鉴定：将上述细胞悬液按1∶1比例小心加在淋巴细胞分离液的液面上，2 000 r/min离心20 min，小心吸取中间富含淋巴细胞的灰白色层(其中大于 90%的为巨噬细胞)。用Hanks液洗涤 2～3次，计数，计算巨噬细胞的浓度。最后用含 20%小牛血清的RPMI 1640培养液配制成浓度为1×106个/ml的细胞悬液。加入 24孔细胞培养板内，每孔1 ml。置5%二氧化碳、37℃培养箱孵育1 h。每孔加入含10 μg/ml的细菌脂多糖及含10%小牛血清的RPMI 1640培养液1 ml，置5%二氧化碳、37℃培养箱培养24 h，收集上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤后置-40℃待测。
, 百拇医药
3.精子的处理与活动力测定：无菌收集精液检查正常的供精者精液10份，待完全液化后，采用改良双洗涤上游法处理精子。调整精子密度为5×106个/ml。取精子悬液50 μl，分别与100 μl两组腹腔液标本混合，密封后置37℃、5%二氧化碳培养箱内孵育4 h，在倒置显微镜下计数200个精子，分别记录直线前向运动百分率和总活动率。
4.鼠胚胎培养：取出生约 8周左右昆明种雌性未交配小白鼠10 只，每只注射孕马血清10 IU(相当于10 IU人绝经期促性腺激素的有效剂量)，48 h后注射绒毛膜促性腺激素(hCG)10～15 U，并分别与1只成年昆明种雄鼠配窝，44～48 h内颈椎脱位处死雌鼠，无菌条件下解剖取出双侧输卵管、卵巢及子宫，于解剖显微镜下冲洗双侧输卵管，吸出2细胞期胚胎置于24孔培养板内，每孔放置7～10个胚胎，分别加入含10%两组腹腔液的Ham′s F10培养液1 ml，37℃、5%二氧化碳条件下培养48 h，每隔12 h观察1次，记录48 h后4细胞、8细胞和16细胞期胚胎的个数。
, 百拇医药
5.TNF-α和IL-6的测定： 采用双抗体夹心法。酶联免疫吸附测试盒由第四军医大学免疫室提供，试剂测定敏感度为0.03 μg/L。
三、统计学方法
结果以X±s表示，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验、U检验。
结果
一、两组患者腹腔巨噬细胞数、腹腔液和巨噬细胞培养上清液TNF-α和IL-6水平比较
内异症组和对照组腹腔巨噬细胞浓度分别为(1.47±0.87)×109/L和(0.67±0.73)×109/L，差异有显著性(P<0.05)。 内异症组患者腹腔液和巨噬细胞培养上清液中TNF-α和IL-6水平均明显高于对照组(P<0.01)。见表1。
, 百拇医药
表1 两组患者腹腔液和巨噬细胞培养上清液TNF-α和
IL-6水平比较(μg/L，X±s)
组别
例
数
腹腔液
巨噬细胞培养上清液
TNF-α
IL-6
TNF-α
IL-6
内异症组
, 百拇医药
14
0.33±0.15
0.49±0.68
7.19±0.60
1.51±0.08
对照组
11
0.14±0.81
0.15±0.60
1.70±0.62
0.46±0.09
二、两组患者腹腔液对精子活动力的影响
, 百拇医药
精子经上游法处理后，精子前向活动率大于80%，总活动率大于90%。与腹腔液孵育4 h后，内异症组的精子直线前向运动率和总活动率较对照组明显降低(P<0.01)。见表2。
三、两组患者腹腔液中鼠胚胎发育情况比较
共取小鼠2细胞期胚胎 198个，其中用于内异症组试验的胚胎114个，对照组84个。小鼠2细胞期胚胎体外培养 48 h后，内异症组发育成16细胞期胚胎的比例为 32.5%，明显低于对照组的47.6%(P<0.01)。两组胚胎总的发育率分别为 77.2%和 91.7%，差异有极显著性(P<0.01)。见表3。表2 两组患者腹腔液对人精子活动力的影响比较(X±s)
组别
总例数
直线前向运动率
, 百拇医药
总活动率
内异症组
14
56.8±2.1*
66.2±3.9*
对照组
11
75.7±3.3
80.8±4.9
注： 与对照组比较，*P<0.01表3 两组鼠胚胎发育情况比较
组别
, http://www.100md.com
总胚
胎数
4细胞期胚胎
8细胞期胚胎
16细胞期胚胎
个数
百分率
(%)
个数
百分率
(%)
个数
百分率
, 百拇医药
(%)
内异症组
114
35
30.7
16
14.0
37
32.5*
对照组
84
12
14.3
, 百拇医药
25
29.8
40
47.6
注:与对照组比较， * P<0.01
讨论
一、内异症患者腹腔液中TNF-α和IL-6水平的变化
TNF-α和IL-6主要是由巨噬细胞等合成和分泌的细胞因子，具有非常广泛的生物学效应，并与人类生殖活动密切相关。许多研究表明，内异症患者腹腔液TNF-α和 IL-6水平升高[2，3]。本研究结果也显示，内异症患者腹腔液TNF-α和IL-6水平明显高于对照组，与上述报道一致。并进一步证实，体外培养的内异症患者腹腔巨噬细胞上清液中 TNF-α和 IL-6的水平较对照组明显升高。表明内异症患者腹腔巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的能力明显增强是其水平升高的原因。这些细胞因子通过介导免疫和炎症反应，导致盆腔局部粘连、纤维化和免疫学异常，促进了内异症的形成和发展。
, 百拇医药
二、内异症患者腹腔液对生殖活动的影响
内异症与不孕的关系至今还不十分清楚。目前，国内外学者在内异症腹腔液对生殖活动的影响方面作了不少研究。特别是对精子活动力和早期胚胎发育的影响屡见报道，但至今尚未得出一致的结论。Curtis等[4]报道，轻至中度内异症患者腹腔液能明显抑制精子的总活动率和运动速度。但Leach等[5]将洗涤后正常的精子与内异症患者腹腔液一起孵育3～6 h后发现，反映精子运动能力的各项指标与对照组均无显著性差异。Taketani等[6]证实，与对照组相比，内异症患者腹腔液能明显抑制小鼠早期胚胎的发育。而Awadalla等[7]未能发现两组之间有显著的差异。产生这种不一致的原因尚不清楚，可能与病例选择及检测方法不同有关。本研究结果显示，将洗涤后精子与腹腔液共同孵育4 h后，内异症组的精子直线前向运动率和总活动率较对照组明显降低(P<0.01)。同时还发现，当小鼠2细胞期胚胎体外与腹腔液共同孵育48 h后，内异症组发育成16细胞期胚胎的比例明显低于对照组(P<0.01)。表明，内异症腹腔液不仅干扰了精子活动力，同时能明显抑制早期胚胎的发育。其原因可能与内异症患者腹腔巨噬细胞数量增多、活性增强及其释放的活性物质如TNF-α、IL-6等增多，导致腹腔液微环境改变有关。有报道TNF-α体外能明显抑制精子的活动力，并对早期胚胎发育有毒性作用[8，9]。是否如此，尚须进一步研究。
, 百拇医药
作者单位：罗丽兰(430030 武汉, 同济医科大学附属同济医院妇产科)
赵海波(430030 武汉, 同济医科大学附属同济医院妇产科)
刘义(430030 武汉, 同济医科大学附属同济医院妇产科)
刘义(同济医科大学附属协和医院妇产科)
参考文献
1，American Fertility Society. Revised American Fertility Society Classfication of endometriosis: 1985. Fertil Steril，1985，43:351-354.
2，Harada T,Yoshioka H,Yoshida S,et al.Increased interleukin-6 levels in peritoneal fluid of infertile patients with active endometriosis. Am J Obstet Gynecol, 1997,176:593-597.
, http://www.100md.com
3，Koyama N, Matsuura K, Okamura H. Cytokines in the peritoneal fluid of patients with endometriosis. Int J Gynecol Obstet, 1993,43:45-50.
4，Curtis P,Lindsay P,Jackson AE, et al. Adverse effects on sperm movement characteristics in women with minimal and mild endometriosis. Br J Obstet Gynecol, 1993,100:165-169.
5，Leach RE, Arneson BW,Ball GD, et al. Absence of antisperm antibodies and factors influencing sperm motility in the cul-de-sac fluid of women with endometriosis. Fertil Steril, 1990,53:351-356.
, 百拇医药
6，Taketani Y, Kuo TM, Miauno M. Comparison of cytokine levels and embryo toxicity in peritoneal fluid in inferitle women with untreated or treated endometriosis. Am J Obstet Gynecol ,1992,167:265-272.
7，Awadalla SG, Friedman CI, Haq AU, et al. Local peritoneal fluid factors: their role in infertility associated with endometriosis. Am J Obstet Gynecol ,1987,157:1207-1214.
8，Eisermann J, Register KB, Strickler RC, et al. The effect of tumor necrosis factor on human sperm motility in vitro. J Androl, 1989,10:270-274.
9，Pampfer S,Moulaert B,Vanderheyden I,et al .Effect of tumour necrosis factor alpha on rat blastocyst growth and glucose metabolism . J Reprod Fertil,1994,101:199-206., 百拇医药
刘义 罗丽兰 赵海波
摘 要 目的 了解子宫内膜内异症(内异症)患者腹腔液肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6) 水平的变化及对人精子活动力和鼠胚胎发育的影响。方法 将行诊断性腹腔镜检查的不孕患者25例，根据术后诊断分为内异症组(14例)和对照组(11例，盆腔正常)，利用双抗体夹心法检测其腹腔液和腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的水平。并将两组的腹腔液分别与人精子和鼠2细胞期胚胎进行体外培养，观察其对人精子活动力和鼠2细胞期胚胎发育的影响。结果 内异症组腹腔液和腹腔巨噬细胞培养上清液中 TNF-α[(0.33±0.15)μg/L，(7.19±0.60)μg/L]和IL-6[(0.49±0.68)μg/L，(1.51±0.08) μg/L]水平，较对照组明显升高(P<0.01)。精子与腹腔液孵育4 h后，内异症组精子直线前向运动率和总活动率分别为56.8%和66.2%，明显低于对照组的75.7%和80.8%(P<0.01)。体外培养48 h后，两组小鼠2细胞期胚胎发育成16细胞期胚胎的比例分别为32.5%和47.6%，差异有极显著性(P<0.01)。结论 腹腔液细胞因子水平升高可能是导致内异症患者不孕的原因。
, 百拇医药
关键词：子宫内膜异位症；肿瘤坏死因子；白细胞介素6；巨噬细胞；精子能动性；胎儿发育
子宫内膜异位症(内异症)尤其是轻症患者非机械性障碍引起不孕的机理至今尚未阐明。近年来的研究表明，内异症患者腹腔液中巨噬细胞数量增多，活性增强。通过释放多种活性物质，干扰了生殖过程中的某些环节。本研究以轻度内异症患者为研究对象，观察腹腔液肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平的变化及体外对人精子活动力和小鼠2细胞期胚胎发育的影响，探讨其不孕的原因。
资料与方法
一、研究对象
为1997年7月至1998年7月在我院行诊断性腹腔镜检查的不孕患者25例，根据术后诊断分为两组：内异症组14例，按美国生育协会 ( AFS )修正标准[1]分期，Ⅰ期 9例、Ⅱ期 5例，术前未经任何治疗；对照组 11例，腹腔镜检查为正常盆腔，诊断为不明原因不孕症。两组患者的年龄分别为(29.8±2.5)岁和(27.9±4.0)岁(X±s，下同)，不孕时间为(4.5±2.3)岁和(4.2±2.0)年,腹腔镜检查时的月经天数为第(15.1±4.2) 天和(13.8±2.5) 天，两组间差异均无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
二、方法
1.腹腔液的采集和处理：在腹腔镜直视下通过吸管抽取子宫直肠陷凹和子宫膀胱陷凹腹腔液5 ml，立即置于肝素化无菌离心管中，以2 000 r/min离心10 min，收集上清液置-40℃保存。管底沉淀以4 ml Hanks液重新制成细胞悬液。
2.巨噬细胞的分离、培养和鉴定：将上述细胞悬液按1∶1比例小心加在淋巴细胞分离液的液面上，2 000 r/min离心20 min，小心吸取中间富含淋巴细胞的灰白色层(其中大于 90%的为巨噬细胞)。用Hanks液洗涤 2～3次，计数，计算巨噬细胞的浓度。最后用含 20%小牛血清的RPMI 1640培养液配制成浓度为1×106个/ml的细胞悬液。加入 24孔细胞培养板内，每孔1 ml。置5%二氧化碳、37℃培养箱孵育1 h。每孔加入含10 μg/ml的细菌脂多糖及含10%小牛血清的RPMI 1640培养液1 ml，置5%二氧化碳、37℃培养箱培养24 h，收集上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤后置-40℃待测。
, 百拇医药
3.精子的处理与活动力测定：无菌收集精液检查正常的供精者精液10份，待完全液化后，采用改良双洗涤上游法处理精子。调整精子密度为5×106个/ml。取精子悬液50 μl，分别与100 μl两组腹腔液标本混合，密封后置37℃、5%二氧化碳培养箱内孵育4 h，在倒置显微镜下计数200个精子，分别记录直线前向运动百分率和总活动率。
4.鼠胚胎培养：取出生约 8周左右昆明种雌性未交配小白鼠10 只，每只注射孕马血清10 IU(相当于10 IU人绝经期促性腺激素的有效剂量)，48 h后注射绒毛膜促性腺激素(hCG)10～15 U，并分别与1只成年昆明种雄鼠配窝，44～48 h内颈椎脱位处死雌鼠，无菌条件下解剖取出双侧输卵管、卵巢及子宫，于解剖显微镜下冲洗双侧输卵管，吸出2细胞期胚胎置于24孔培养板内，每孔放置7～10个胚胎，分别加入含10%两组腹腔液的Ham′s F10培养液1 ml，37℃、5%二氧化碳条件下培养48 h，每隔12 h观察1次，记录48 h后4细胞、8细胞和16细胞期胚胎的个数。
, 百拇医药
5.TNF-α和IL-6的测定： 采用双抗体夹心法。酶联免疫吸附测试盒由第四军医大学免疫室提供，试剂测定敏感度为0.03 μg/L。
三、统计学方法
结果以X±s表示，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验、U检验。
结果
一、两组患者腹腔巨噬细胞数、腹腔液和巨噬细胞培养上清液TNF-α和IL-6水平比较
内异症组和对照组腹腔巨噬细胞浓度分别为(1.47±0.87)×109/L和(0.67±0.73)×109/L，差异有显著性(P<0.05)。 内异症组患者腹腔液和巨噬细胞培养上清液中TNF-α和IL-6水平均明显高于对照组(P<0.01)。见表1。
, 百拇医药
表1 两组患者腹腔液和巨噬细胞培养上清液TNF-α和
IL-6水平比较(μg/L，X±s)
组别
例
数
腹腔液
巨噬细胞培养上清液
TNF-α
IL-6
TNF-α
IL-6
内异症组
, 百拇医药
14
0.33±0.15
0.49±0.68
7.19±0.60
1.51±0.08
对照组
11
0.14±0.81
0.15±0.60
1.70±0.62
0.46±0.09
二、两组患者腹腔液对精子活动力的影响
, 百拇医药
精子经上游法处理后，精子前向活动率大于80%，总活动率大于90%。与腹腔液孵育4 h后，内异症组的精子直线前向运动率和总活动率较对照组明显降低(P<0.01)。见表2。
三、两组患者腹腔液中鼠胚胎发育情况比较
共取小鼠2细胞期胚胎 198个，其中用于内异症组试验的胚胎114个，对照组84个。小鼠2细胞期胚胎体外培养 48 h后，内异症组发育成16细胞期胚胎的比例为 32.5%，明显低于对照组的47.6%(P<0.01)。两组胚胎总的发育率分别为 77.2%和 91.7%，差异有极显著性(P<0.01)。见表3。表2 两组患者腹腔液对人精子活动力的影响比较(X±s)
组别
总例数
直线前向运动率
, 百拇医药
总活动率
内异症组
14
56.8±2.1*
66.2±3.9*
对照组
11
75.7±3.3
80.8±4.9
注： 与对照组比较，*P<0.01表3 两组鼠胚胎发育情况比较
组别
, http://www.100md.com
总胚
胎数
4细胞期胚胎
8细胞期胚胎
16细胞期胚胎
个数
百分率
(%)
个数
百分率
(%)
个数
百分率
, 百拇医药
(%)
内异症组
114
35
30.7
16
14.0
37
32.5*
对照组
84
12
14.3
, 百拇医药
25
29.8
40
47.6
注:与对照组比较， * P<0.01
讨论
一、内异症患者腹腔液中TNF-α和IL-6水平的变化
TNF-α和IL-6主要是由巨噬细胞等合成和分泌的细胞因子，具有非常广泛的生物学效应，并与人类生殖活动密切相关。许多研究表明，内异症患者腹腔液TNF-α和 IL-6水平升高[2，3]。本研究结果也显示，内异症患者腹腔液TNF-α和IL-6水平明显高于对照组，与上述报道一致。并进一步证实，体外培养的内异症患者腹腔巨噬细胞上清液中 TNF-α和 IL-6的水平较对照组明显升高。表明内异症患者腹腔巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的能力明显增强是其水平升高的原因。这些细胞因子通过介导免疫和炎症反应，导致盆腔局部粘连、纤维化和免疫学异常，促进了内异症的形成和发展。
, 百拇医药
二、内异症患者腹腔液对生殖活动的影响
内异症与不孕的关系至今还不十分清楚。目前，国内外学者在内异症腹腔液对生殖活动的影响方面作了不少研究。特别是对精子活动力和早期胚胎发育的影响屡见报道，但至今尚未得出一致的结论。Curtis等[4]报道，轻至中度内异症患者腹腔液能明显抑制精子的总活动率和运动速度。但Leach等[5]将洗涤后正常的精子与内异症患者腹腔液一起孵育3～6 h后发现，反映精子运动能力的各项指标与对照组均无显著性差异。Taketani等[6]证实，与对照组相比，内异症患者腹腔液能明显抑制小鼠早期胚胎的发育。而Awadalla等[7]未能发现两组之间有显著的差异。产生这种不一致的原因尚不清楚，可能与病例选择及检测方法不同有关。本研究结果显示，将洗涤后精子与腹腔液共同孵育4 h后，内异症组的精子直线前向运动率和总活动率较对照组明显降低(P<0.01)。同时还发现，当小鼠2细胞期胚胎体外与腹腔液共同孵育48 h后，内异症组发育成16细胞期胚胎的比例明显低于对照组(P<0.01)。表明，内异症腹腔液不仅干扰了精子活动力，同时能明显抑制早期胚胎的发育。其原因可能与内异症患者腹腔巨噬细胞数量增多、活性增强及其释放的活性物质如TNF-α、IL-6等增多，导致腹腔液微环境改变有关。有报道TNF-α体外能明显抑制精子的活动力，并对早期胚胎发育有毒性作用[8，9]。是否如此，尚须进一步研究。
, 百拇医药
作者单位：罗丽兰(430030 武汉, 同济医科大学附属同济医院妇产科)
赵海波(430030 武汉, 同济医科大学附属同济医院妇产科)
刘义(430030 武汉, 同济医科大学附属同济医院妇产科)
刘义(同济医科大学附属协和医院妇产科)
参考文献
1，American Fertility Society. Revised American Fertility Society Classfication of endometriosis: 1985. Fertil Steril，1985，43:351-354.
2，Harada T,Yoshioka H,Yoshida S,et al.Increased interleukin-6 levels in peritoneal fluid of infertile patients with active endometriosis. Am J Obstet Gynecol, 1997,176:593-597.
, http://www.100md.com
3，Koyama N, Matsuura K, Okamura H. Cytokines in the peritoneal fluid of patients with endometriosis. Int J Gynecol Obstet, 1993,43:45-50.
4，Curtis P,Lindsay P,Jackson AE, et al. Adverse effects on sperm movement characteristics in women with minimal and mild endometriosis. Br J Obstet Gynecol, 1993,100:165-169.
5，Leach RE, Arneson BW,Ball GD, et al. Absence of antisperm antibodies and factors influencing sperm motility in the cul-de-sac fluid of women with endometriosis. Fertil Steril, 1990,53:351-356.
, 百拇医药
6，Taketani Y, Kuo TM, Miauno M. Comparison of cytokine levels and embryo toxicity in peritoneal fluid in inferitle women with untreated or treated endometriosis. Am J Obstet Gynecol ,1992,167:265-272.
7，Awadalla SG, Friedman CI, Haq AU, et al. Local peritoneal fluid factors: their role in infertility associated with endometriosis. Am J Obstet Gynecol ,1987,157:1207-1214.
8，Eisermann J, Register KB, Strickler RC, et al. The effect of tumor necrosis factor on human sperm motility in vitro. J Androl, 1989,10:270-274.
9，Pampfer S,Moulaert B,Vanderheyden I,et al .Effect of tumour necrosis factor alpha on rat blastocyst growth and glucose metabolism . J Reprod Fertil,1994,101:199-206., 百拇医药