荧光酶免疫法在先天性甲状腺功能低下症筛查中的应用
荧光酶免疫法在先天性甲状腺功能低下症筛查中的应用
李艳霞 马英杰 简永健 马志军 胡锦春 卢丽红
摘 要 目的 探讨荧光酶免疫法(FEIA)在新生儿甲状腺功能低下症筛查中的实用性。方法 对FEIA方法测定滤纸干血片促甲状腺激素(TSH)含量进行方法学检测，同时与酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫放射法(IRMA)相比较，并检测1 794例新生儿TSH正常水平及筛查切值(cut off)。结果 该方法最低检测限为4.14 mIU/L，批内平均变异系数(CV)为0.08 ，批间平均变异系数(CV)为0.11，高、中、低3个浓度的平均重现率为96.4%,实验结果与目前国内筛查使用的ELISA法和IRMA法高度相关( r=0.969 8和0.975 6)。筛查切值建议定为12 mIU/L。结论 FEIA方法适用于新生儿甲状腺功能低下症的疾病筛查，其设备亦可用于筛查苯丙酮尿症。
, 百拇医药
关键词：荧光免疫测定；促甲状腺素；新生儿筛查
新生儿疾病筛查的实验室检测质量要求非常严格，加之被检血样采集使用滤纸干血片法，影响因素多于通常的血清样品，为此试验方法学选择成为开展筛查工作的重要内容[1-3]。在新生儿先天性甲状腺功能低下症(简称甲低)筛查试验中，近年采用荧光酶免疫测定法(FEIA)，其原理是在原ELISA方法的基础上，把底物更换成经酶促反应后可产生荧光的新底物，依据试验反应的荧光信号强度定量被测物含量[3，4]。我们使用芬兰生产的试剂及配套设备进行方法学检测，并与国内筛查使用的酶联免疫吸附法(ELISA) 及免疫放射法(IRMA)相对照;同时，对新生儿血促甲状腺激素(TSH)含量进行实测，并确定筛查甲低可疑病例的切值(cut off)，结果报告如下。
材料和方法
—、材料
, 百拇医药
1.正常血标本：取自北京地区出生后72 h的正常新生儿足跟血，吸于特制的滤纸上，呈直径10 mm血斑，自然干燥后备用，共1 794份。
2.质控品：美国疾病控制中心(CDC)提供的筛查用TSH滤纸干血片质控品。
3.试剂及设备：芬兰Labsystems公司提供FEIA法筛查用TSH 试剂及荧光读数仪等设备。ELISA及IRMA法试剂分别由美国GBI及DPC公司提供。
二、FEIA检测方法
用直径3 mm打孔钳，在滤纸干血片上(包括标准品、质控品、及被测样品)打2个血片，分别置包被板孔中，加入酶标记抗体(1∶100稀释)，900次/min振荡2 h后，弃掉孔中纸片及液体，用1∶10冲洗液冲洗4次，再加入200 μl荧光底物，室温振荡1 h后，加入100 μl终止液，在320 nm/405 nm波长下进行荧光比色，以机载软件处理TSH含量检测结果。
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结果
1.精确性：(1)批内变异系数(CV)：以该试剂盒提供的B、D、F 3个TSH标准品作为TSH低、中、高含量的被测物，批内重复测定16次，其均值+标准差和批内变异系数如下：标准品B为491+35，CV 0.072；标准品D为1 889+180，CV 0.095；标准品F为3 735+273，CV 0.073。批内平均CV为0.080。(2)批间CV：取本试剂盒提供的TSH低值和高值质控品，于不同试验批次内测定8次，统计CV值，低、高质控CV值为0.120和0.092，平均CV为0.110。
2.准确性：取CDC提供的高、中、低3个TSH含量质控品，每浓度重复3次，其重现率见表1。
表1 3种方法检测TSH质控品的重现率
样品
TSH含量
, 百拇医药
次
数
理论值
(mIU/L)
测定值(mIU/L)
重现率(%)
FEIA
ELISA
IRMA
FEIA
ELISA
IRMA
低
, 百拇医药
3
25
25.4
23.9
29.9
101.6
95.9
119.6
中
3
40
38.6
41.2
, http://www.100md.com
42.7
96.5
102.9
106.7
高
3
80
72.9
80.7
83.5
91.1
100.9
104.4
, http://www.100md.com
3.灵敏度：以该试剂盒的A、B 2个TSH标准品分别检测3次，按传统灵敏度检测方法，依吸光度值(A)的X±3s统计最低检测限为4.14 mIU/L。
4.FEIA、ELISA、IRMA方法的相关性：用3种方法检测同一组72份新生儿血标本TSH含量，试验结果做统计学相关性处理，FEIA方法与ELISA和IRMA方法相关系数r分别为0.969 8和0.975 6(P<0.001)。
5.新生儿筛查中TSH切值的选择：对1 794份新生儿血标本中的TSH使用FEIA法进行检测，其频数分布情况见表2。
经统计正常新生儿人群TSH含量呈偏态分布。中位数为2.67 mIU/L，高值端99%可信限为 11.05 mIU/L，建议此方法甲低筛查切值(cut off值)定为12 mIU/L。超出者为可疑甲低患儿，需追踪复查。
讨论
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新生儿筛查是提高人口素质的重大举措之一，我国已开展了甲低及苯丙酮尿症(PKU)的筛查。甲低筛查的方法有免疫放射法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法及荧光酶免疫法等[1-3]。 90年代初，Tuuminen等[4]报告以3-邻-羟基苯二乙基甲酮酸为底物，经过氧化物酶作用可产生高灵敏度荧光 ，进而在酶标方法基础上，以荧光底物取代了原显色底物，以检测荧光强度作为定量依据。作者认为新底物有更高的灵敏度，使FEIA法迅速发展。该作者又于同年报告了使用该法进行新生儿甲低筛查[5]。 该方法恰好又与使用化学法筛查苯丙酮尿症时需测定荧光强度的手段相同[6]，其设备可完成甲低及苯丙酮尿症两病的筛查。我们进行北京地区新生儿人群TSH水平的测试，其99%可信限为11.05 mIU/L，甲低患儿TSH值将上升，建议该法的甲低筛查切值定为12 mIU/L。以往本室使用美国产品对同一地区人群进行甲低筛查，切值一般定在20 mIU/L左右，这是由于两者标准品含量表示方式不同，Labsystems公司产品的标准品以全血值定标，故较以血清值定标的美国产品实测值要低。另外，我们又见到即使使用同一技术，不同地区报告的新生儿正常TSH水平也有差别，如有报告：使用FEIA法，正常新生儿TSH水平99.9%可信限为8.4 mIU/L[6]，其结果低于本组结果，并且人群TSH水平分布曲线峰值也较本组更为偏低，这可能与人群的地域差异有关。为此，建议在开展筛查工作前，应按已选定的仪器试剂制定本地区筛查用切值，以保障筛查质量。
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表2 1 794例新生儿TSH含量频数分布状况
分组
(mIU/L)
频数
(n)
人群百分率
(%)
分组
(mIU/L)
频数
(n)
人群百分率
(%)
, 百拇医药
0～
268
14.94
12～
3
0.17
1～
356
19.84
13～
1
0.06
2～
, 百拇医药
415
23.13
14～
3
0.17
3～
276
15.38
15～
0
0.00
4～
180
, 百拇医药
10.03
16～
0
0.00
5～
106
5.91
17～
0
0.00
6～
75
4.18
, 百拇医药
18～
0
0.00
7～
50
2.87
19～
0
0.00
8～
24
1.34
20～
, 百拇医药 1
0.06
9～
19
1.06
21～
0
0.00
10～
6
0.33
22～
0
0.00
, http://www.100md.com
11～
10
0.56
23～24
1
0.06
作者单位：李艳霞(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
马英杰(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
简永健(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
马志军(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
胡锦春(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
, 百拇医药
卢丽红(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
参考文献
1，Stephen L. Newborn screening for congenital hypothyroidism: recommended guidelines. Pediatrics，1993, 91： 1203-1208.
2，猪股弘明.ㄆしテこ症. 小内科, 1994, 26:67-71.
3，阎玉芹,张育新,何天煜.新生儿全血TSH检测的意义及其技术.中国地方病学杂志, 1998,17: 389.
4，Tuuminen T, Palomak P, Rakkolainen A, et al. 3-p-(hydroxyphenyl) propionic acid-a sensitire fluonogenic substrate for automatted fluorometric enzyme immunoassay. J Immunoassay, 1991, 12: 29-46.
5，Tuuminen T, Rakkolainen A, Welin MG, et al.Arapid fluorometric enzyme immunoassay for the determination of neonatal TSH from blood spots. Clin Chim Aacta, 1991,202: 167-178.
6，Greasimova NS.Phenylketonuria screening in moscow using a micro plate fluorometric method. Screening ,1992, 1: 27-35., 百拇医药
李艳霞 马英杰 简永健 马志军 胡锦春 卢丽红
摘 要 目的 探讨荧光酶免疫法(FEIA)在新生儿甲状腺功能低下症筛查中的实用性。方法 对FEIA方法测定滤纸干血片促甲状腺激素(TSH)含量进行方法学检测，同时与酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫放射法(IRMA)相比较，并检测1 794例新生儿TSH正常水平及筛查切值(cut off)。结果 该方法最低检测限为4.14 mIU/L，批内平均变异系数(CV)为0.08 ，批间平均变异系数(CV)为0.11，高、中、低3个浓度的平均重现率为96.4%,实验结果与目前国内筛查使用的ELISA法和IRMA法高度相关( r=0.969 8和0.975 6)。筛查切值建议定为12 mIU/L。结论 FEIA方法适用于新生儿甲状腺功能低下症的疾病筛查，其设备亦可用于筛查苯丙酮尿症。
, 百拇医药
关键词：荧光免疫测定；促甲状腺素；新生儿筛查
新生儿疾病筛查的实验室检测质量要求非常严格，加之被检血样采集使用滤纸干血片法，影响因素多于通常的血清样品，为此试验方法学选择成为开展筛查工作的重要内容[1-3]。在新生儿先天性甲状腺功能低下症(简称甲低)筛查试验中，近年采用荧光酶免疫测定法(FEIA)，其原理是在原ELISA方法的基础上，把底物更换成经酶促反应后可产生荧光的新底物，依据试验反应的荧光信号强度定量被测物含量[3，4]。我们使用芬兰生产的试剂及配套设备进行方法学检测，并与国内筛查使用的酶联免疫吸附法(ELISA) 及免疫放射法(IRMA)相对照;同时，对新生儿血促甲状腺激素(TSH)含量进行实测，并确定筛查甲低可疑病例的切值(cut off)，结果报告如下。
材料和方法
—、材料
, 百拇医药
1.正常血标本：取自北京地区出生后72 h的正常新生儿足跟血，吸于特制的滤纸上，呈直径10 mm血斑，自然干燥后备用，共1 794份。
2.质控品：美国疾病控制中心(CDC)提供的筛查用TSH滤纸干血片质控品。
3.试剂及设备：芬兰Labsystems公司提供FEIA法筛查用TSH 试剂及荧光读数仪等设备。ELISA及IRMA法试剂分别由美国GBI及DPC公司提供。
二、FEIA检测方法
用直径3 mm打孔钳，在滤纸干血片上(包括标准品、质控品、及被测样品)打2个血片，分别置包被板孔中，加入酶标记抗体(1∶100稀释)，900次/min振荡2 h后，弃掉孔中纸片及液体，用1∶10冲洗液冲洗4次，再加入200 μl荧光底物，室温振荡1 h后，加入100 μl终止液，在320 nm/405 nm波长下进行荧光比色，以机载软件处理TSH含量检测结果。
, http://www.100md.com
结果
1.精确性：(1)批内变异系数(CV)：以该试剂盒提供的B、D、F 3个TSH标准品作为TSH低、中、高含量的被测物，批内重复测定16次，其均值+标准差和批内变异系数如下：标准品B为491+35，CV 0.072；标准品D为1 889+180，CV 0.095；标准品F为3 735+273，CV 0.073。批内平均CV为0.080。(2)批间CV：取本试剂盒提供的TSH低值和高值质控品，于不同试验批次内测定8次，统计CV值，低、高质控CV值为0.120和0.092，平均CV为0.110。
2.准确性：取CDC提供的高、中、低3个TSH含量质控品，每浓度重复3次，其重现率见表1。
表1 3种方法检测TSH质控品的重现率
样品
TSH含量
, 百拇医药
次
数
理论值
(mIU/L)
测定值(mIU/L)
重现率(%)
FEIA
ELISA
IRMA
FEIA
ELISA
IRMA
低
, 百拇医药
3
25
25.4
23.9
29.9
101.6
95.9
119.6
中
3
40
38.6
41.2
, http://www.100md.com
42.7
96.5
102.9
106.7
高
3
80
72.9
80.7
83.5
91.1
100.9
104.4
, http://www.100md.com
3.灵敏度：以该试剂盒的A、B 2个TSH标准品分别检测3次，按传统灵敏度检测方法，依吸光度值(A)的X±3s统计最低检测限为4.14 mIU/L。
4.FEIA、ELISA、IRMA方法的相关性：用3种方法检测同一组72份新生儿血标本TSH含量，试验结果做统计学相关性处理，FEIA方法与ELISA和IRMA方法相关系数r分别为0.969 8和0.975 6(P<0.001)。
5.新生儿筛查中TSH切值的选择：对1 794份新生儿血标本中的TSH使用FEIA法进行检测，其频数分布情况见表2。
经统计正常新生儿人群TSH含量呈偏态分布。中位数为2.67 mIU/L，高值端99%可信限为 11.05 mIU/L，建议此方法甲低筛查切值(cut off值)定为12 mIU/L。超出者为可疑甲低患儿，需追踪复查。
讨论
, http://www.100md.com
新生儿筛查是提高人口素质的重大举措之一，我国已开展了甲低及苯丙酮尿症(PKU)的筛查。甲低筛查的方法有免疫放射法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法及荧光酶免疫法等[1-3]。 90年代初，Tuuminen等[4]报告以3-邻-羟基苯二乙基甲酮酸为底物，经过氧化物酶作用可产生高灵敏度荧光 ，进而在酶标方法基础上，以荧光底物取代了原显色底物，以检测荧光强度作为定量依据。作者认为新底物有更高的灵敏度，使FEIA法迅速发展。该作者又于同年报告了使用该法进行新生儿甲低筛查[5]。 该方法恰好又与使用化学法筛查苯丙酮尿症时需测定荧光强度的手段相同[6]，其设备可完成甲低及苯丙酮尿症两病的筛查。我们进行北京地区新生儿人群TSH水平的测试，其99%可信限为11.05 mIU/L，甲低患儿TSH值将上升，建议该法的甲低筛查切值定为12 mIU/L。以往本室使用美国产品对同一地区人群进行甲低筛查，切值一般定在20 mIU/L左右，这是由于两者标准品含量表示方式不同，Labsystems公司产品的标准品以全血值定标，故较以血清值定标的美国产品实测值要低。另外，我们又见到即使使用同一技术，不同地区报告的新生儿正常TSH水平也有差别，如有报告：使用FEIA法，正常新生儿TSH水平99.9%可信限为8.4 mIU/L[6]，其结果低于本组结果，并且人群TSH水平分布曲线峰值也较本组更为偏低，这可能与人群的地域差异有关。为此，建议在开展筛查工作前，应按已选定的仪器试剂制定本地区筛查用切值，以保障筛查质量。
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表2 1 794例新生儿TSH含量频数分布状况
分组
(mIU/L)
频数
(n)
人群百分率
(%)
分组
(mIU/L)
频数
(n)
人群百分率
(%)
, 百拇医药
0～
268
14.94
12～
3
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1
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415
23.13
14～
3
0.17
3～
276
15.38
15～
0
0.00
4～
180
, 百拇医药
10.03
16～
0
0.00
5～
106
5.91
17～
0
0.00
6～
75
4.18
, 百拇医药
18～
0
0.00
7～
50
2.87
19～
0
0.00
8～
24
1.34
20～
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0.06
9～
19
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21～
0
0.00
10～
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22～
0
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11～
10
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23～24
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作者单位：李艳霞(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
马英杰(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
简永健(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
马志军(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
胡锦春(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
, 百拇医药
卢丽红(100045 北京市新生儿疾病筛查中心)
参考文献
1，Stephen L. Newborn screening for congenital hypothyroidism: recommended guidelines. Pediatrics，1993, 91： 1203-1208.
2，猪股弘明.ㄆしテこ症. 小内科, 1994, 26:67-71.
3，阎玉芹,张育新,何天煜.新生儿全血TSH检测的意义及其技术.中国地方病学杂志, 1998,17: 389.
4，Tuuminen T, Palomak P, Rakkolainen A, et al. 3-p-(hydroxyphenyl) propionic acid-a sensitire fluonogenic substrate for automatted fluorometric enzyme immunoassay. J Immunoassay, 1991, 12: 29-46.
5，Tuuminen T, Rakkolainen A, Welin MG, et al.Arapid fluorometric enzyme immunoassay for the determination of neonatal TSH from blood spots. Clin Chim Aacta, 1991,202: 167-178.
6，Greasimova NS.Phenylketonuria screening in moscow using a micro plate fluorometric method. Screening ,1992, 1: 27-35., 百拇医药