轴突细胞骨架对非中断性轴索损伤的反应及在亚低温治疗后的早期改变
轴突细胞骨架对非中断性轴索损伤的反应及在亚低温治疗后的早期改变
孙晓川
摘 要 目的 观察轴索损伤早期轴突细胞骨架超微结构的改变和早期亚低温处理后细胞骨架的改变，为亚低温治疗弥漫性轴索损伤(DAI)寻找实验依据。 方法 实验组豚鼠右侧视神经受牵拉致伤。伤后常温实验组动物体温维持在36.0～37.5℃，低温实验组动物体温降至32.0～32.5℃，两组于伤后 2 h和 4 h各处死一半动物。电镜下观察轴突细胞骨架的变化，并用电脑图像分析系统进行定量分析。 结果 常温实验组伤后 2 h，大、中、小轴突组平均微管总数均显著减少( P<0.001)，平均微管间距显著增大 (P<0.05 或 P<0.01)，大、中轴突组平均神经丝总数也显著减少(P<0.01)。伤后 4 h，中、小轴突组平均神经丝总数显著增多(P<0.05)，平均神经丝间距显著缩小( P<0.05)。亚低温实验组的各直径轴突内的微管总数及间距，神经丝总数及间距与对照组相比，无明显改变(P>0.05)。 结论 轴突损伤早期轴突细胞骨架有显著的结构改变，早期亚低温处理，能明显改善细胞骨架的异常。
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关键词：轴突；细胞骨架；亚低温；弥漫性轴索损伤
弥漫性轴索损伤 (diffuse axonal injury ,DAI)是颅脑损伤后出现无血肿性持续昏迷、严重神经功能障碍和植物生存的最常见原因。越来越多的临床研究发现，伤后予以适度的低温能改善脑外伤病人的行为能力。笔者利用DAI动物模型，对轴索损伤早期轴突细胞骨架的病理反应，以及亚低温疗法对细胞骨架超微结构改变的影响进行了动态观察及定量分析，试图从亚细胞水平对亚低温治疗的早期效果进行评价。
材料与方法
1. 实验动物：雄性成年豚鼠15只，体重700～800 g，分成3个组：对照组(3只)、常温实验组(6只)、低温实验组(6只)。
2. 麻醉方法：肌注氯胺酮 (50 mg/kg)和甲苯噻嗪(3 mg/kg)，右眼球用质量浓度为10 g/L的利多卡因局部浸润麻醉。
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3. 致伤方式：利用特制的装置制作豚鼠视神经牵位伤模型。步骤如下： (1)在右眼角膜外1 mm环形切开球结膜，将右眼球轻微牵出。将宽约2 mm的小棉带置入球后并用丝线结扎固定。对照组完成此步骤后立即移去小棉带。(2)实验组动物被置于立体定位架上。调节头部支撑架，使视神经管轴向与牵拉方向一致。(3)将固定在右眼球后的小棉带用丝线连接到牵拉装置上，并对右眼球先施予30～40 g牵拉力，使右视神经被拉直。(4)启动开关，牵拉装置在19～22 ms内对右眼视神经施以150～180 g牵拉力。在此张力范围内，视神经及其供应血管均不会被拉断。
4. 亚低温实验：所有动物伤后或假手术后立即插入肛表并连接于监测仪连续监测体温。对照组和常温实验组动物用可控式电热毯包裹，体温维持于36.0～37.5℃。低温实验组动物被置入特制降温装置中，再外包电热毯，二者配合使用，维持体温在32～32.5℃之间。
5. 标本处理：实验组分别于伤后2，4 h用质量浓度为25 g/L的戊二醛作心脏灌注，并各处死3只豚鼠，对照组用相同方式于假手术后4 h处死。取出右眼视神经(长12～20 mm)，将其等分为3段，以利固定包埋，横切出若干超薄切片，枸橼酸铅染色，用透射电镜观察。
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6. 观察指标及资料收集：轴突细胞骨架由微管(microtubule,MT)和神经丝 (neurofilament,NF)组成，二者平行于轴突纵轴，在横切面上能清楚显示其数量及空间分布，以轴突横切面上微管总数(number of MT, NMT)、微管间距(spacing between MTs,SMT)、神经丝总数(number of NF,NNF)和神经丝间距(spacing between NFs,SNF)为观察指标。早期的研究发现，NMT和NNF与轴突粗细有关[1]。本研究中按轴突直径分组进行统计。随机从每只动物选择一张超薄切片，电镜下从该切片左上角开始，从左至右，再由上而下，每隔2个方格观察1个方格视野，使每一切片有10个方格受到检查。从每一方格视野中随机选择大、中、小轴突节间段(internode,IN)各1个,用52 000放大倍数拍照,这样从每一动物的切片上共获得电镜照片30张,负片被输入电脑图像分析系统，测出直径后，轴突被分为小轴突组(0.50～1.00 μm)、中轴突组(1.01～1.50 μm)和大轴突组(1.51～2.00 μm)3个组，每组各有10个轴突。电脑分析系统将测量并计算出对照组、常温实验组和低温实验组的不同直径轴突组平均NMT及平均SMT，平均NNF及平均SNF。
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7. 统计分析：数据以X±s表示，用方差分析进行NMT和NNF的组间比较，用t检验进行SMT和SNF的组间比较。
结果
1. 对照组轴突：轴突IN由板层状紧密排列的髓鞘包裹，轴膜紧贴髓鞘内面，不同大小的轴突交错排列。轴突内可见呈空心环状结构的MT和实心圆点NF，MT直径大于NF(图1)。NMT和NNF均随轴突直径增大而逐渐增多，尤以NF增加更为显著，使中、大轴突内NF数量超过MT。不同直径轴突间SMT、SNF差异无统计学意义(表1，2 )。
2. 常温实验组轴突细胞骨架的变化：伤后2 h，大、中、小轴突组MT均减少，甚至消失(图 2)。三组平均NMT均显著低于相应对照组(P<0.001)。残留的MT稀疏分布于轴浆内，使MT间距增大，三组平均SMT明显大于相应对照组(P<0.05或P<0.01)。伤后4 h，则仅有大轴突组平均NMT仍显著低于对照组(P<0.01)，其平均SMT也相应地明显大于对照组(P<0.05)(表1)。
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神经丝的变化则较为复杂。伤后2 h，小轴突组平均NNF无明显变化，大、中轴突组平均NNF明显低于相应对照组(P<0.01)；但3组平均SNF与相应对照组间无明显差别。伤后4 h，与相应对照组比较，中、小轴突组平均NNF明显增加(P<0.05)，同时两组平均SNF则明显缩小(P<0.05)，使NF发生密聚现象(compaction)(图3)，大轴突组平均NNF和平均SNF无明显变化(表2)。
3. 亚低温对轴突细胞骨架的影响：伤后2 h和4 h，大、中、小轴突组平均NMT和平均SMT与相应对照组相比，差异无统计学意义(表1、图 4)。同样，伤后2 h和4 h，不同直径的轴突组平均NNF和平均SNF也无明显变化，NF没有出现密聚现象(表2、图4)。
讨论
在人类 DAI中，神经轴索受到瞬时性张力牵张。近年来利用DAI动物模型所作的研究发现，造成轴索损伤的牵张力在绝大多数情况下并不会立刻扯断轴索，而是损害轴膜的结构[4]，削弱其维持轴突内环境稳定的能力，并由此引发连锁病理反应，最终于伤后数小时才发生轴索中断，即延迟性轴索断离(delayed axotomy)。病理学上将这种轴索损伤称之为非中断性轴索损伤(non-disruptive axonal injury)[2]。这一发现为寻找治疗DAI的有效方法提供了一个重要的时间窗，即轴索损伤后的数小时将是决定受损轴索转归的关键阶段，如能阐明此阶段轴
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图1 对照组右侧视神经小轴突(0.50～1.00 μm)横切面。微管(↑)和神经丝(↑)散布于轴浆内 枸橼酸铅染色 ×52 000
图2 常温实验组伤后2 h右侧视神经小轴突(0.50～1.00 μm)横切面。微管明显减少，微管间距扩大 枸橼酸铅染色 ×52 000
图3 常温实验组伤后4 h右侧视神经中轴突(1.01～1.50 μm)横切面。微管几乎消失，神经丝在轴浆中央密聚 枸橼酸铅染色 ×52 000
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图4 亚低温实验组伤后4 h右侧视神经中轴突(1.01～1.50 μm)横切面。微管和神经丝数量和分布正常 枸橼酸铅染色 ×52 000
表1 轴索损伤早期常温组和低温组微管数量和微管间距的变化(X±s)
组别
轴突数
(个)
伤后2 h
伤后4 h
微管总数
微管间距(nm)
微管总数
微管间距(nm)
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常温组
小轴突
60
8.03±2.14***
185.22±15.22*
20.63±4.40
141.30±9.20
中轴突
60
12.36±2.95***
264.59±18.07**
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30.93±6.90
179.60±14.00
大轴突
60
21.01±0.02***
274.62±12.40**
43.50±8.30**
204.30±12.00*
低温组
小轴突
60
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23.77±3.46
122.62±6.34
26.09±2.80
137.33±23.44
中轴突
60
34.39±0.69
126.41±16.67
32.29±0.94
113.85±20.98
大轴突
60
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66.33±5.77
138.63±23.10
70.32±2.98
141.36±18.36
注：对照组轴突数为30个。对照组小轴突微管总数为24.03±0.77，微管间距为(134.97±2.10) nm；对照组中轴突微管总数为36.90±2.19，微管间距为(151.70±9.60) nm；对照组大轴突微管总数为68.80±4.95，微管间距为(147.50±7.40) nm。与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001表2 轴索损伤早期常温组和低温组神经丝数量和神经丝间距的变化(X±s)
组别
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轴突数
(个)
伤后2 h
伤后4 h
神经丝总数
神经丝间距(nm)
神经丝总数
神经丝间距(nm)
常温组
小轴突
60
29.27±1.75
106.38±5.65
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43.80±1.90*
67.84±3.70*
中轴突
60
50.76±3.54**
110.24±9.78
89.87±1.60*
72.14±0.60*
大轴突
60
76.33±25.15**
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84.70±23.14
152.50±24.00
79.67±22.80
低温组
小轴突
60
30.53±1.36
95.10±22.49
35.14±3.90
144.41±22.32
中轴突
60
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63.00±3.06
81.85±14.50
63.84±1.40
126.36±14.40
大轴突
60
119.93±12.50
92.80±16.30
154.27±3.70
94.20±14.80
注：对照组轴突数为30个。对照组小轴突神经丝总数为31.57±2.50，神经丝间距为(116.10±8.60) nm；对照组中轴突神经丝总数为75.10±7.40，神经丝间距为(111.30±7.80) nm；对照组大轴突神经丝总数为173.30±34.04，神经丝间距为(96.60±12.00) nm。与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01 索病理变化的过程及其机制，及早采取针对性治疗，将会避免或减轻轴索损害，从而改善DAI预后。
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非中断性轴索损伤引起的最早的病理变化是轴索肿胀，常见于伤后2～6 h，这是发生轴索延迟中断前的关键环节。用辣根过氧化物酶所做的示踪试验证实，轴索肿胀与轴浆运输阻断有关[2]。轴突细胞骨架是维持轴突正常形态、结构及功能的重要的亚细胞结构，其中MT为快速轴浆运输提供运输通道，NF则负责维持细胞骨架结构和轴突管径。笔者重点观察轴索肿胀期细胞骨架的变化，结果发现，轴突细胞骨架有显著的超微结构异常，不但MT和NF有数量的变化，而且相互间的排列分布关系也被打乱。MT丢失提示有微管解聚发生；NF先有减少，后又增多，且发生密聚，提示NF聚合与分解平衡遭到破坏，而且造成结构塌陷。因此，笔者认为，轴索肿胀正是MT迅速丢失，轴浆运输通道中断的结果，而NF的变化则削弱了其维持正常细胞骨架的能力。
本研究结果表明，亚低温能显著改善轴索损伤早期细胞骨架的病理反应，使MT和NF数量及排列维持正常，这是目前国际上首次在损伤数小时内，在亚细胞水平观察到亚低温的作用部位，为阐明亚低温神经保护功能的细胞分子学机制提供了最新的实验证据。有学者采用免疫组化方法标记神经丝亚单位68 000,于伤后24 h在光镜下对轴索中断后形成的“回缩球”(retraction ball)进行计数，发现亚低温治疗能显著减少轴索损伤动物内囊回缩球的数量[3]。笔者的实验结果为该发现提供了解释：亚低温对细胞骨架的稳定有助于维持轴浆运输通畅，减少和减轻轴索肿胀，从而减少了发生延迟性中断的轴突的数量。
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轴索损伤后轴突细胞骨架解构的机制尚未完全阐明，目前认为Ca2+内流是一个重要因素。笔者早先的研究发现，轴索损伤后轴突朗飞节轴膜有结构异常和Ca2+泵活性降低，轴浆内Ca2+增多[4，5]。体外实验证实，Ca2+能使微管迅速解离[6]。当轴浆内Ca2+上升到一定浓度，激活钙调蛋白(calmodulin)导致微管解聚、丢失[7]；激活μm神经蛋白酶(calpain)或蛋白激酶(protein kinase)导致神经丝侧臂发生蛋白分解或发生脱磷酸化而分解，使神经丝空间结构塌陷，引起整个细胞骨架解构[8]。Mitani等[9]发现，亚低温能显著抑制缺氧所造成的Ca2+内流，降低神经细胞内Ca2+浓度。亚低温还能有效地使脑损伤动物脑组织内微管相关蛋白2 (MAP2)含量恢复至正常水平[10]，而MAP2是微管蛋白组装成微管所必须的。亚低温可能通过稳定轴膜结构，保护Ca2+泵活性，维持了细胞内外Ca2+的平衡；同时通过促使神经元表达和合成细胞结构蛋白而发挥神经保护作用。
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基金项目：中英友好奖学金(SBFSS)资助项目
作者单位：孙晓川(400016 重庆医科大学附属第一医院神经外科)
参考文献
1，Guy J, Ellis EA, Kelley K, et al. Spectra of G ratio, myelin sheath thickness and axon， and fibre diameter in the guinea pig optic nerve. J Comparative Neurol, 1989, 287:446-454.
2，Povlishock JT, Christman CW. The pathobiology of traumatically induced axonal injury in animals and humans: a review of current thoughts. J Neurotrauma, 1995, 12:555-563.
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8，Maxwell WL, Povlishock JT, Graham DI. A mechanic analysis of nondisruptive axonal injury: a review. J Neurotrauma, 1997, 14: 419-440.
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9，Mitani A, Kadoya F, Kataoka K. Temperature dependence of hypoxia-induced calcium accumulation in gerbil hippocampal slices. Brain Res, 1991, 35: 159-162.
10，Widmann R, Miyazaawa T, Hossmann KA. Protective effect of hypothermia on hippocampal injury after 30 minutes of forebrain ischemia in rats is mediated by post ischemic recovery of protein synthesis. J Neurochem, 1993,61:200-204., http://www.100md.com
孙晓川
摘 要 目的 观察轴索损伤早期轴突细胞骨架超微结构的改变和早期亚低温处理后细胞骨架的改变，为亚低温治疗弥漫性轴索损伤(DAI)寻找实验依据。 方法 实验组豚鼠右侧视神经受牵拉致伤。伤后常温实验组动物体温维持在36.0～37.5℃，低温实验组动物体温降至32.0～32.5℃，两组于伤后 2 h和 4 h各处死一半动物。电镜下观察轴突细胞骨架的变化，并用电脑图像分析系统进行定量分析。 结果 常温实验组伤后 2 h，大、中、小轴突组平均微管总数均显著减少( P<0.001)，平均微管间距显著增大 (P<0.05 或 P<0.01)，大、中轴突组平均神经丝总数也显著减少(P<0.01)。伤后 4 h，中、小轴突组平均神经丝总数显著增多(P<0.05)，平均神经丝间距显著缩小( P<0.05)。亚低温实验组的各直径轴突内的微管总数及间距，神经丝总数及间距与对照组相比，无明显改变(P>0.05)。 结论 轴突损伤早期轴突细胞骨架有显著的结构改变，早期亚低温处理，能明显改善细胞骨架的异常。
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关键词：轴突；细胞骨架；亚低温；弥漫性轴索损伤
弥漫性轴索损伤 (diffuse axonal injury ,DAI)是颅脑损伤后出现无血肿性持续昏迷、严重神经功能障碍和植物生存的最常见原因。越来越多的临床研究发现，伤后予以适度的低温能改善脑外伤病人的行为能力。笔者利用DAI动物模型，对轴索损伤早期轴突细胞骨架的病理反应，以及亚低温疗法对细胞骨架超微结构改变的影响进行了动态观察及定量分析，试图从亚细胞水平对亚低温治疗的早期效果进行评价。
材料与方法
1. 实验动物：雄性成年豚鼠15只，体重700～800 g，分成3个组：对照组(3只)、常温实验组(6只)、低温实验组(6只)。
2. 麻醉方法：肌注氯胺酮 (50 mg/kg)和甲苯噻嗪(3 mg/kg)，右眼球用质量浓度为10 g/L的利多卡因局部浸润麻醉。
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3. 致伤方式：利用特制的装置制作豚鼠视神经牵位伤模型。步骤如下： (1)在右眼角膜外1 mm环形切开球结膜，将右眼球轻微牵出。将宽约2 mm的小棉带置入球后并用丝线结扎固定。对照组完成此步骤后立即移去小棉带。(2)实验组动物被置于立体定位架上。调节头部支撑架，使视神经管轴向与牵拉方向一致。(3)将固定在右眼球后的小棉带用丝线连接到牵拉装置上，并对右眼球先施予30～40 g牵拉力，使右视神经被拉直。(4)启动开关，牵拉装置在19～22 ms内对右眼视神经施以150～180 g牵拉力。在此张力范围内，视神经及其供应血管均不会被拉断。
4. 亚低温实验：所有动物伤后或假手术后立即插入肛表并连接于监测仪连续监测体温。对照组和常温实验组动物用可控式电热毯包裹，体温维持于36.0～37.5℃。低温实验组动物被置入特制降温装置中，再外包电热毯，二者配合使用，维持体温在32～32.5℃之间。
5. 标本处理：实验组分别于伤后2，4 h用质量浓度为25 g/L的戊二醛作心脏灌注，并各处死3只豚鼠，对照组用相同方式于假手术后4 h处死。取出右眼视神经(长12～20 mm)，将其等分为3段，以利固定包埋，横切出若干超薄切片，枸橼酸铅染色，用透射电镜观察。
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6. 观察指标及资料收集：轴突细胞骨架由微管(microtubule,MT)和神经丝 (neurofilament,NF)组成，二者平行于轴突纵轴，在横切面上能清楚显示其数量及空间分布，以轴突横切面上微管总数(number of MT, NMT)、微管间距(spacing between MTs,SMT)、神经丝总数(number of NF,NNF)和神经丝间距(spacing between NFs,SNF)为观察指标。早期的研究发现，NMT和NNF与轴突粗细有关[1]。本研究中按轴突直径分组进行统计。随机从每只动物选择一张超薄切片，电镜下从该切片左上角开始，从左至右，再由上而下，每隔2个方格观察1个方格视野，使每一切片有10个方格受到检查。从每一方格视野中随机选择大、中、小轴突节间段(internode,IN)各1个,用52 000放大倍数拍照,这样从每一动物的切片上共获得电镜照片30张,负片被输入电脑图像分析系统，测出直径后，轴突被分为小轴突组(0.50～1.00 μm)、中轴突组(1.01～1.50 μm)和大轴突组(1.51～2.00 μm)3个组，每组各有10个轴突。电脑分析系统将测量并计算出对照组、常温实验组和低温实验组的不同直径轴突组平均NMT及平均SMT，平均NNF及平均SNF。
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7. 统计分析：数据以X±s表示，用方差分析进行NMT和NNF的组间比较，用t检验进行SMT和SNF的组间比较。
结果
1. 对照组轴突：轴突IN由板层状紧密排列的髓鞘包裹，轴膜紧贴髓鞘内面，不同大小的轴突交错排列。轴突内可见呈空心环状结构的MT和实心圆点NF，MT直径大于NF(图1)。NMT和NNF均随轴突直径增大而逐渐增多，尤以NF增加更为显著，使中、大轴突内NF数量超过MT。不同直径轴突间SMT、SNF差异无统计学意义(表1，2 )。
2. 常温实验组轴突细胞骨架的变化：伤后2 h，大、中、小轴突组MT均减少，甚至消失(图 2)。三组平均NMT均显著低于相应对照组(P<0.001)。残留的MT稀疏分布于轴浆内，使MT间距增大，三组平均SMT明显大于相应对照组(P<0.05或P<0.01)。伤后4 h，则仅有大轴突组平均NMT仍显著低于对照组(P<0.01)，其平均SMT也相应地明显大于对照组(P<0.05)(表1)。
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神经丝的变化则较为复杂。伤后2 h，小轴突组平均NNF无明显变化，大、中轴突组平均NNF明显低于相应对照组(P<0.01)；但3组平均SNF与相应对照组间无明显差别。伤后4 h，与相应对照组比较，中、小轴突组平均NNF明显增加(P<0.05)，同时两组平均SNF则明显缩小(P<0.05)，使NF发生密聚现象(compaction)(图3)，大轴突组平均NNF和平均SNF无明显变化(表2)。
3. 亚低温对轴突细胞骨架的影响：伤后2 h和4 h，大、中、小轴突组平均NMT和平均SMT与相应对照组相比，差异无统计学意义(表1、图 4)。同样，伤后2 h和4 h，不同直径的轴突组平均NNF和平均SNF也无明显变化，NF没有出现密聚现象(表2、图4)。
讨论
在人类 DAI中，神经轴索受到瞬时性张力牵张。近年来利用DAI动物模型所作的研究发现，造成轴索损伤的牵张力在绝大多数情况下并不会立刻扯断轴索，而是损害轴膜的结构[4]，削弱其维持轴突内环境稳定的能力，并由此引发连锁病理反应，最终于伤后数小时才发生轴索中断，即延迟性轴索断离(delayed axotomy)。病理学上将这种轴索损伤称之为非中断性轴索损伤(non-disruptive axonal injury)[2]。这一发现为寻找治疗DAI的有效方法提供了一个重要的时间窗，即轴索损伤后的数小时将是决定受损轴索转归的关键阶段，如能阐明此阶段轴
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图1 对照组右侧视神经小轴突(0.50～1.00 μm)横切面。微管(↑)和神经丝(↑)散布于轴浆内 枸橼酸铅染色 ×52 000
图2 常温实验组伤后2 h右侧视神经小轴突(0.50～1.00 μm)横切面。微管明显减少，微管间距扩大 枸橼酸铅染色 ×52 000
图3 常温实验组伤后4 h右侧视神经中轴突(1.01～1.50 μm)横切面。微管几乎消失，神经丝在轴浆中央密聚 枸橼酸铅染色 ×52 000
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图4 亚低温实验组伤后4 h右侧视神经中轴突(1.01～1.50 μm)横切面。微管和神经丝数量和分布正常 枸橼酸铅染色 ×52 000
表1 轴索损伤早期常温组和低温组微管数量和微管间距的变化(X±s)
组别
轴突数
(个)
伤后2 h
伤后4 h
微管总数
微管间距(nm)
微管总数
微管间距(nm)
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常温组
小轴突
60
8.03±2.14***
185.22±15.22*
20.63±4.40
141.30±9.20
中轴突
60
12.36±2.95***
264.59±18.07**
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30.93±6.90
179.60±14.00
大轴突
60
21.01±0.02***
274.62±12.40**
43.50±8.30**
204.30±12.00*
低温组
小轴突
60
, 百拇医药
23.77±3.46
122.62±6.34
26.09±2.80
137.33±23.44
中轴突
60
34.39±0.69
126.41±16.67
32.29±0.94
113.85±20.98
大轴突
60
, 百拇医药
66.33±5.77
138.63±23.10
70.32±2.98
141.36±18.36
注：对照组轴突数为30个。对照组小轴突微管总数为24.03±0.77，微管间距为(134.97±2.10) nm；对照组中轴突微管总数为36.90±2.19，微管间距为(151.70±9.60) nm；对照组大轴突微管总数为68.80±4.95，微管间距为(147.50±7.40) nm。与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001表2 轴索损伤早期常温组和低温组神经丝数量和神经丝间距的变化(X±s)
组别
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轴突数
(个)
伤后2 h
伤后4 h
神经丝总数
神经丝间距(nm)
神经丝总数
神经丝间距(nm)
常温组
小轴突
60
29.27±1.75
106.38±5.65
, http://www.100md.com
43.80±1.90*
67.84±3.70*
中轴突
60
50.76±3.54**
110.24±9.78
89.87±1.60*
72.14±0.60*
大轴突
60
76.33±25.15**
, 百拇医药
84.70±23.14
152.50±24.00
79.67±22.80
低温组
小轴突
60
30.53±1.36
95.10±22.49
35.14±3.90
144.41±22.32
中轴突
60
, 百拇医药
63.00±3.06
81.85±14.50
63.84±1.40
126.36±14.40
大轴突
60
119.93±12.50
92.80±16.30
154.27±3.70
94.20±14.80
注：对照组轴突数为30个。对照组小轴突神经丝总数为31.57±2.50，神经丝间距为(116.10±8.60) nm；对照组中轴突神经丝总数为75.10±7.40，神经丝间距为(111.30±7.80) nm；对照组大轴突神经丝总数为173.30±34.04，神经丝间距为(96.60±12.00) nm。与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01 索病理变化的过程及其机制，及早采取针对性治疗，将会避免或减轻轴索损害，从而改善DAI预后。
, 百拇医药
非中断性轴索损伤引起的最早的病理变化是轴索肿胀，常见于伤后2～6 h，这是发生轴索延迟中断前的关键环节。用辣根过氧化物酶所做的示踪试验证实，轴索肿胀与轴浆运输阻断有关[2]。轴突细胞骨架是维持轴突正常形态、结构及功能的重要的亚细胞结构，其中MT为快速轴浆运输提供运输通道，NF则负责维持细胞骨架结构和轴突管径。笔者重点观察轴索肿胀期细胞骨架的变化，结果发现，轴突细胞骨架有显著的超微结构异常，不但MT和NF有数量的变化，而且相互间的排列分布关系也被打乱。MT丢失提示有微管解聚发生；NF先有减少，后又增多，且发生密聚，提示NF聚合与分解平衡遭到破坏，而且造成结构塌陷。因此，笔者认为，轴索肿胀正是MT迅速丢失，轴浆运输通道中断的结果，而NF的变化则削弱了其维持正常细胞骨架的能力。
本研究结果表明，亚低温能显著改善轴索损伤早期细胞骨架的病理反应，使MT和NF数量及排列维持正常，这是目前国际上首次在损伤数小时内，在亚细胞水平观察到亚低温的作用部位，为阐明亚低温神经保护功能的细胞分子学机制提供了最新的实验证据。有学者采用免疫组化方法标记神经丝亚单位68 000,于伤后24 h在光镜下对轴索中断后形成的“回缩球”(retraction ball)进行计数，发现亚低温治疗能显著减少轴索损伤动物内囊回缩球的数量[3]。笔者的实验结果为该发现提供了解释：亚低温对细胞骨架的稳定有助于维持轴浆运输通畅，减少和减轻轴索肿胀，从而减少了发生延迟性中断的轴突的数量。
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轴索损伤后轴突细胞骨架解构的机制尚未完全阐明，目前认为Ca2+内流是一个重要因素。笔者早先的研究发现，轴索损伤后轴突朗飞节轴膜有结构异常和Ca2+泵活性降低，轴浆内Ca2+增多[4，5]。体外实验证实，Ca2+能使微管迅速解离[6]。当轴浆内Ca2+上升到一定浓度，激活钙调蛋白(calmodulin)导致微管解聚、丢失[7]；激活μm神经蛋白酶(calpain)或蛋白激酶(protein kinase)导致神经丝侧臂发生蛋白分解或发生脱磷酸化而分解，使神经丝空间结构塌陷，引起整个细胞骨架解构[8]。Mitani等[9]发现，亚低温能显著抑制缺氧所造成的Ca2+内流，降低神经细胞内Ca2+浓度。亚低温还能有效地使脑损伤动物脑组织内微管相关蛋白2 (MAP2)含量恢复至正常水平[10]，而MAP2是微管蛋白组装成微管所必须的。亚低温可能通过稳定轴膜结构，保护Ca2+泵活性，维持了细胞内外Ca2+的平衡；同时通过促使神经元表达和合成细胞结构蛋白而发挥神经保护作用。
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基金项目：中英友好奖学金(SBFSS)资助项目
作者单位：孙晓川(400016 重庆医科大学附属第一医院神经外科)
参考文献
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9，Mitani A, Kadoya F, Kataoka K. Temperature dependence of hypoxia-induced calcium accumulation in gerbil hippocampal slices. Brain Res, 1991, 35: 159-162.
10，Widmann R, Miyazaawa T, Hossmann KA. Protective effect of hypothermia on hippocampal injury after 30 minutes of forebrain ischemia in rats is mediated by post ischemic recovery of protein synthesis. J Neurochem, 1993,61:200-204., http://www.100md.com