如何提高性传播疾病实验诊断的准确性
如何提高性传播疾病实验诊断的准确性
熊礼宽
关键词：性传播疾病(sexually transmitted disease,STD)；实验诊断 近年来，我国性传播疾病(sexually transmitted disease,STD)患病人数呈直线上升趋势，1999年全国报告STD(淋病、梅毒、艾滋病、非淋菌尿道炎或宫颈炎、尖锐湿疣、生殖器疱疹、软下疳和性病淋巴肉芽肿)患者数约83.6万，比1998年增加了30%以上[1]。截至1999年底，全国累计报告艾滋病病毒(HIV)感染者17 136例，估计HIV实际感染者超过了50万。因此，控制STD的传播乃当务之急，其关键在早期准确诊断。
一、 正确选择与评价STD实验诊断方法
(一)形态学检查
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1.淋病：涂片革兰染色后显微镜检查，从男性患者标本中发现细胞内革兰阴性双球菌，可结合临床表现作出初步诊断。但男性慢性淋病患者淋菌常位于细胞外，应加以注意。女性患者分泌物涂片染色后见革兰阴性双球菌，应进一步培养鉴定，因为女性生殖道可见灰色奈瑟菌、不动杆菌和摩拉菌等，此类细菌形态上与淋菌很相似。
2.梅毒：Ⅰ期梅毒(硬下疳)和神经梅毒可通过暗视野显微镜、涂片镀银染色观察，但要注意螺旋体的螺距、圈数多少，据此鉴别密螺旋体与其他螺旋体。
3.软下疳：可取溃疡或腹股沟肿大的淋巴结涂片，染色后见革兰 阴性短杆菌，呈“鱼群”状排列。但仅以此诊断为软下疳证据尚不足，必须培养鉴定。
4.性病淋巴肉芽肿：沙眼衣原体血清型A～K为非淋菌性尿道炎(宫颈炎)的病原体，血清型L1、L2和L3为性病淋巴肉芽肿的病原体。涂片姬姆萨和巴帕尼科拉乌(papanicolaou)染色，可见细胞内包涵体，但敏感性不高。性病淋巴肉芽肿可用荧光标记沙眼衣原体血清型L1～3单抗进行免疫荧光染色镜检。
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荧光显微镜检查可初步诊断某些STD，其准确度取决于荧光标记单抗的特异性和效价。多媒体显微诊断仪只能把普通显微镜下能见到的图像进一步放大到计算机的显示器上，不能用作确诊STD。
(二)病原体培养与鉴定
众所周知，病原体的培养与鉴定在STD诊断和治疗中起着决定性作用，但目前国内STD病原体培养与鉴定现状不容乐观，尤其是杜克雷嗜血杆菌的培养。
1.软下疳：杜克雷嗜血杆菌的培养基较多，不同的培养基阳性率为40%～90%，以兔血琼脂、GC-HgS培养基和Mueller-Hinton培养基(均含3 μg/ml万古霉素)最佳。5%的CO2潮湿环境33℃培养24～48 h，取可疑菌落进行染色镜检、触酶试验和糖发酵试验鉴定为杜克雷嗜血杆菌，方诊断为软下疳。迄今我国尚未分离到野生株。
2.淋病：采样后要立即接种在预温的Thayer-Martin培养基上，5%的CO2潮湿环境35℃培养24～48 h，取可疑菌落进行染色镜检、氧化酶试验(盐酸四甲基对苯二胺比盐酸二甲基对苯二胺敏感)和糖发酵试验鉴定为淋菌，方诊断为淋病。同时进行药敏试验，最好采取绝对浓度法。
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3.支原体感染：引起人类泌尿生殖道感染的支原体有解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体和发酵支原体等，多数实验室仅凭液体培养基分解尿素、精氨酸和葡萄糖发生颜色改变是不够的(发酵支原体能分解精氨酸和葡萄糖)，必须在颜色发生改变的初期(一般解脲脲原体培养12 h)，过滤转种于固体培养基后，见“油煎蛋”菌落，进行Diense染色和生化反应后方可报告。
4.梅毒：梅毒螺旋体只能靠兔子睾丸活体培养，称兔感染试验(RIT)，理论上培养到1个活的梅毒螺旋体即可确定诊断，但在临床上作为常规应用不太实际。
5.沙眼衣原体感染：细胞培养为诊断沙眼衣原体感染的“金标准”，常用McCoy和HeLa229细胞，敏感性为80%～90%，受标本的采集、传送条件、培养细胞及标本中抑制物等影响。
6.HIV：培养阳性率虽高，但普通实验室不宜进行。
, 百拇医药 (三)免疫学试验
1.抗体检测：不同的STD意义不同，淋病、非淋菌性尿道炎(宫颈炎)、性病淋巴肉芽肿测定特异性抗体仅用于流行病学研究。人乳头状瘤病毒(HPV)和杜克雷嗜血杆菌抗体尚处于研究阶段[2]。
抗体检测乃诊断梅毒的主要方法。它包括非密螺旋体和密螺旋体抗体试验。非密螺旋体抗体试验包括性病研究实验室试验(VDRL)、不加热血清反应素试验(USR)和快速血浆反应素(RPR)试验。非密螺旋体试验是采用卵鳞脂、胆固醇和纯化心磷脂为抗原，检测梅毒患者血清中心磷脂抗体，因假阳性较多，主要见于妊娠、药物成瘾、恶性肿瘤、自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、类风湿等)、病毒(特别是EB病毒和肝炎病毒)感染、寄生虫感染、慢性感染(如结核病)及老年人等，故为梅毒筛选试验，其滴度可作为疗效判断指标。假阴性见于早期和晚期梅毒。密螺旋体试验包括血清荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)和血凝试验(TPHA)。其使用梅毒螺旋体为全抗原，其特异性高于非密螺旋体试验，假阳性少，主要见于其他密螺旋体感染、结缔组织病、自身免疫性疾病和妊娠等，故被用于确诊试验，但不适用于梅毒疗效考核。脑脊液(CSF)性病研究实验室试验诊断神经性梅毒特异性高，假阳性仅见于血液污染。CSF出现密螺旋体抗体不能诊断为神经性梅毒，因为血液中密螺旋体抗体可被动扩散到CSF中。但CSF荧光密螺旋体抗体吸收试验阴性可排除神经性梅毒。有梅毒史的孕妇，非密螺旋体筛选试验滴度可能非特异性上升，这种现象难与再感染或复发相鉴别，此时只有将2次克隆梅毒螺旋体的序列进行比较才能鉴别。当婴儿CSF性病研究实验室试验阳性，血清筛选试验滴度为母亲滴度的4倍，应考虑诊断为先天性梅毒，此时应进行血清荧光密度螺旋体抗体吸收试验。近年来，用梅毒重组抗原如分子量为47 000、37 000、17 000和15 000等外膜蛋白检测其特异性抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)法、免疫印记技术及胶体金试剂正在逐步用于临床，将有可能鉴别梅毒螺旋体与其他密螺旋体感染，如雅司[3-6]。
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HIV抗体：尽管HIV2主要流行于西非，但在选择试剂时应包括HIV1+2抗体。新生儿应检查血清HIV-IgA。
生殖器疱疹：1周内就可检出血清中抗HSV-2型gB、gD、VP5、gC/E的IgG、IgM、IgA抗体，但原发性生殖器疱疹抗体水平低。目前国产HSV-2型IgG和IgM抗体试剂，重复性和稳定性差，进口试剂质量也参差不齐,以意大利DiaSorin公司试剂质量较为可靠。
2.抗原检测：当HIV1+2抗体阳性时，进行免疫印记试验和ELISA检测gp160、gp120、p66、p55、p51、p41、p39、p31、p24和p17抗原，以确诊和鉴别HIV感染。ELISA、VIDAS系统和胶体金标记技术已用于检测沙眼衣原体脂多糖和主要外膜蛋白；ELISA检测HSV-2脂多糖和糖蛋白。此类试剂全靠进口。由于人乳头瘤病毒仅少量存在于体液中，则检测体液中人乳头瘤病毒抗原意义不大。
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(四)分子生物学方法
由于人乳头状瘤病毒不能在体外组织细胞中培养，核酸杂交技术可用于尖锐湿疣的诊断及人乳头状瘤病毒的分型。聚合酶链反应(PCR)技术由于特异性好、敏感性高，用于诊断STD曾一度过热，但由于受实验室条件、人员素质和试剂质量等影响，造成STD误诊和漏诊。目前，我国和美国批准上市的STD定量 PCR试剂盒只有淋菌和沙眼衣原体。
二、目前我国STD实验诊断中存在的主要问题
1.未能正确评价实验室现用检查方法的灵敏度、特异性及其适用范围，导致漏诊和误诊：试验结果是诊断STD的依据，结果正确与否与标本选择、采集、传送方法和时间，试验方法的选择、试剂质量和检验人员的素质等有关。
2.应正确评价各种试剂：不同试剂质量差异较大，如gonogen淋菌快速检测试剂盒和chlamygen衣原体快速检测试剂盒，敏感性和特异性均较低[7]。
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3.部分检验人员基础理论不够扎实，对某一方法的原理不甚了解：如现有梅毒确诊试验为什么还有假阳性，重组抗原有何优点。又如支原体液体培养基变色初期，为什么要过滤后转固体培养基等。
三、对加强STD实验诊断方法研究的建议
1.建议卫生部临床检验中心组织力量对目前现有诊断试剂进行比较研究，筛选出可靠的试剂推广应用。
2.加强培养基的研制与比较。如淋菌和杜克雷嗜血杆菌的变色培养基，快速绝对浓度法测定药物最小抑菌浓度和最低杀菌浓度。
3.加强STD病原体的基因克隆与表达。我国梅毒、HIV的确诊试验、沙眼衣原体抗原、单纯疱疹病毒-2抗原等检测试剂依赖进口，其主要原因在于特异性抗原获取困难，导致不易得到单克隆抗体。迄今，梅毒螺旋体[5]、生殖支原体、沙眼衣原体和HIV全基因序列已经阐明，部分基因表达的蛋白结构和功能业已清楚。因此，有条件的实验室应加强STD病原体抗原的基因克隆表达，以利于获得高度纯化抗原，以此生产单克隆抗体，将高度特异性的抗原和单克隆抗体用于STD的诊断。早日实现STD抗原检测试剂国产化。
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4.开展多重定量PCR技术[8]，胶体金标记多种STD病原体单克隆抗体的研究，只需1份标本即可快速鉴别诊断生殖器溃疡(软下疳、硬下疳和生殖器疱疹)，淋病合并非淋菌性尿道炎(宫颈炎)。
5.开展DNA指印技术、DNA芯片技术研究。用于STD耐药检测、分子流行病学研究和分子生物学技术诊断，如一步法检测出淋菌penA、penB、mtr、tetM、gyrA和gyrB等基因。
6.加强STD耐药性监测及耐药基因的研究。尤其是青霉素治疗失败的梅毒患者[5]。
作者单位：熊礼宽(518020 深圳市慢性病防治院性病防治中心检验科)
参考文献
1，卫生部疾病控制司. 性病规范防治设施项目鉴定. 性病情况简报，2000，4：1.
, 百拇医药
2，Elkins C,Yi K,Olsen B,et al.Development of a serolgical test for Haemophilus ducreyi seroprevalence studies.J Clin Microbiol,2000,38:1520-1526.
3，孙峥嵘，孙皓，鲁润铭,等. 梅毒螺旋体低分子量多肽基因的克隆表达及临床应用. 中华检验医学杂志，2000，23：46.
4，Ebel A,Vanneste L,Cardinaels M,et al.Validation of the INNO-LIA syphilis kit as a confirmatory assay for Treponema pallidum antibodies.J Clin Microbiol, 2000,38：215-219.
5，熊礼宽，周华. 梅毒螺旋体部分抗原分子生物学研究进展. 国外医学流行病学传染病学分册,1999，26:270-273.
6，熊礼宽，周华，宁波. 梅毒螺旋体37 000内鞭毛蛋白基因的扩增、克隆及鉴定. 中华皮肤科杂志，2000，33：177-178.
7，叶顺章. 论性病实验室诊断中的几个问题. 性传播疾病诊疗与预防. 广东：广东科技出版社,1996.28-32.
8，张正. 聚合酶链反应定量技术在微生物检测中的应用. 中华医学检验杂志，1999，22增刊：22-24., 百拇医药
熊礼宽
关键词：性传播疾病(sexually transmitted disease,STD)；实验诊断 近年来，我国性传播疾病(sexually transmitted disease,STD)患病人数呈直线上升趋势，1999年全国报告STD(淋病、梅毒、艾滋病、非淋菌尿道炎或宫颈炎、尖锐湿疣、生殖器疱疹、软下疳和性病淋巴肉芽肿)患者数约83.6万，比1998年增加了30%以上[1]。截至1999年底，全国累计报告艾滋病病毒(HIV)感染者17 136例，估计HIV实际感染者超过了50万。因此，控制STD的传播乃当务之急，其关键在早期准确诊断。
一、 正确选择与评价STD实验诊断方法
(一)形态学检查
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1.淋病：涂片革兰染色后显微镜检查，从男性患者标本中发现细胞内革兰阴性双球菌，可结合临床表现作出初步诊断。但男性慢性淋病患者淋菌常位于细胞外，应加以注意。女性患者分泌物涂片染色后见革兰阴性双球菌，应进一步培养鉴定，因为女性生殖道可见灰色奈瑟菌、不动杆菌和摩拉菌等，此类细菌形态上与淋菌很相似。
2.梅毒：Ⅰ期梅毒(硬下疳)和神经梅毒可通过暗视野显微镜、涂片镀银染色观察，但要注意螺旋体的螺距、圈数多少，据此鉴别密螺旋体与其他螺旋体。
3.软下疳：可取溃疡或腹股沟肿大的淋巴结涂片，染色后见革兰 阴性短杆菌，呈“鱼群”状排列。但仅以此诊断为软下疳证据尚不足，必须培养鉴定。
4.性病淋巴肉芽肿：沙眼衣原体血清型A～K为非淋菌性尿道炎(宫颈炎)的病原体，血清型L1、L2和L3为性病淋巴肉芽肿的病原体。涂片姬姆萨和巴帕尼科拉乌(papanicolaou)染色，可见细胞内包涵体，但敏感性不高。性病淋巴肉芽肿可用荧光标记沙眼衣原体血清型L1～3单抗进行免疫荧光染色镜检。
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荧光显微镜检查可初步诊断某些STD，其准确度取决于荧光标记单抗的特异性和效价。多媒体显微诊断仪只能把普通显微镜下能见到的图像进一步放大到计算机的显示器上，不能用作确诊STD。
(二)病原体培养与鉴定
众所周知，病原体的培养与鉴定在STD诊断和治疗中起着决定性作用，但目前国内STD病原体培养与鉴定现状不容乐观，尤其是杜克雷嗜血杆菌的培养。
1.软下疳：杜克雷嗜血杆菌的培养基较多，不同的培养基阳性率为40%～90%，以兔血琼脂、GC-HgS培养基和Mueller-Hinton培养基(均含3 μg/ml万古霉素)最佳。5%的CO2潮湿环境33℃培养24～48 h，取可疑菌落进行染色镜检、触酶试验和糖发酵试验鉴定为杜克雷嗜血杆菌，方诊断为软下疳。迄今我国尚未分离到野生株。
2.淋病：采样后要立即接种在预温的Thayer-Martin培养基上，5%的CO2潮湿环境35℃培养24～48 h，取可疑菌落进行染色镜检、氧化酶试验(盐酸四甲基对苯二胺比盐酸二甲基对苯二胺敏感)和糖发酵试验鉴定为淋菌，方诊断为淋病。同时进行药敏试验，最好采取绝对浓度法。
, http://www.100md.com
3.支原体感染：引起人类泌尿生殖道感染的支原体有解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体和发酵支原体等，多数实验室仅凭液体培养基分解尿素、精氨酸和葡萄糖发生颜色改变是不够的(发酵支原体能分解精氨酸和葡萄糖)，必须在颜色发生改变的初期(一般解脲脲原体培养12 h)，过滤转种于固体培养基后，见“油煎蛋”菌落，进行Diense染色和生化反应后方可报告。
4.梅毒：梅毒螺旋体只能靠兔子睾丸活体培养，称兔感染试验(RIT)，理论上培养到1个活的梅毒螺旋体即可确定诊断，但在临床上作为常规应用不太实际。
5.沙眼衣原体感染：细胞培养为诊断沙眼衣原体感染的“金标准”，常用McCoy和HeLa229细胞，敏感性为80%～90%，受标本的采集、传送条件、培养细胞及标本中抑制物等影响。
6.HIV：培养阳性率虽高，但普通实验室不宜进行。
, 百拇医药 (三)免疫学试验
1.抗体检测：不同的STD意义不同，淋病、非淋菌性尿道炎(宫颈炎)、性病淋巴肉芽肿测定特异性抗体仅用于流行病学研究。人乳头状瘤病毒(HPV)和杜克雷嗜血杆菌抗体尚处于研究阶段[2]。
抗体检测乃诊断梅毒的主要方法。它包括非密螺旋体和密螺旋体抗体试验。非密螺旋体抗体试验包括性病研究实验室试验(VDRL)、不加热血清反应素试验(USR)和快速血浆反应素(RPR)试验。非密螺旋体试验是采用卵鳞脂、胆固醇和纯化心磷脂为抗原，检测梅毒患者血清中心磷脂抗体，因假阳性较多，主要见于妊娠、药物成瘾、恶性肿瘤、自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、类风湿等)、病毒(特别是EB病毒和肝炎病毒)感染、寄生虫感染、慢性感染(如结核病)及老年人等，故为梅毒筛选试验，其滴度可作为疗效判断指标。假阴性见于早期和晚期梅毒。密螺旋体试验包括血清荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)和血凝试验(TPHA)。其使用梅毒螺旋体为全抗原，其特异性高于非密螺旋体试验，假阳性少，主要见于其他密螺旋体感染、结缔组织病、自身免疫性疾病和妊娠等，故被用于确诊试验，但不适用于梅毒疗效考核。脑脊液(CSF)性病研究实验室试验诊断神经性梅毒特异性高，假阳性仅见于血液污染。CSF出现密螺旋体抗体不能诊断为神经性梅毒，因为血液中密螺旋体抗体可被动扩散到CSF中。但CSF荧光密螺旋体抗体吸收试验阴性可排除神经性梅毒。有梅毒史的孕妇，非密螺旋体筛选试验滴度可能非特异性上升，这种现象难与再感染或复发相鉴别，此时只有将2次克隆梅毒螺旋体的序列进行比较才能鉴别。当婴儿CSF性病研究实验室试验阳性，血清筛选试验滴度为母亲滴度的4倍，应考虑诊断为先天性梅毒，此时应进行血清荧光密度螺旋体抗体吸收试验。近年来，用梅毒重组抗原如分子量为47 000、37 000、17 000和15 000等外膜蛋白检测其特异性抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)法、免疫印记技术及胶体金试剂正在逐步用于临床，将有可能鉴别梅毒螺旋体与其他密螺旋体感染，如雅司[3-6]。
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HIV抗体：尽管HIV2主要流行于西非，但在选择试剂时应包括HIV1+2抗体。新生儿应检查血清HIV-IgA。
生殖器疱疹：1周内就可检出血清中抗HSV-2型gB、gD、VP5、gC/E的IgG、IgM、IgA抗体，但原发性生殖器疱疹抗体水平低。目前国产HSV-2型IgG和IgM抗体试剂，重复性和稳定性差，进口试剂质量也参差不齐,以意大利DiaSorin公司试剂质量较为可靠。
2.抗原检测：当HIV1+2抗体阳性时，进行免疫印记试验和ELISA检测gp160、gp120、p66、p55、p51、p41、p39、p31、p24和p17抗原，以确诊和鉴别HIV感染。ELISA、VIDAS系统和胶体金标记技术已用于检测沙眼衣原体脂多糖和主要外膜蛋白；ELISA检测HSV-2脂多糖和糖蛋白。此类试剂全靠进口。由于人乳头瘤病毒仅少量存在于体液中，则检测体液中人乳头瘤病毒抗原意义不大。
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(四)分子生物学方法
由于人乳头状瘤病毒不能在体外组织细胞中培养，核酸杂交技术可用于尖锐湿疣的诊断及人乳头状瘤病毒的分型。聚合酶链反应(PCR)技术由于特异性好、敏感性高，用于诊断STD曾一度过热，但由于受实验室条件、人员素质和试剂质量等影响，造成STD误诊和漏诊。目前，我国和美国批准上市的STD定量 PCR试剂盒只有淋菌和沙眼衣原体。
二、目前我国STD实验诊断中存在的主要问题
1.未能正确评价实验室现用检查方法的灵敏度、特异性及其适用范围，导致漏诊和误诊：试验结果是诊断STD的依据，结果正确与否与标本选择、采集、传送方法和时间，试验方法的选择、试剂质量和检验人员的素质等有关。
2.应正确评价各种试剂：不同试剂质量差异较大，如gonogen淋菌快速检测试剂盒和chlamygen衣原体快速检测试剂盒，敏感性和特异性均较低[7]。
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3.部分检验人员基础理论不够扎实，对某一方法的原理不甚了解：如现有梅毒确诊试验为什么还有假阳性，重组抗原有何优点。又如支原体液体培养基变色初期，为什么要过滤后转固体培养基等。
三、对加强STD实验诊断方法研究的建议
1.建议卫生部临床检验中心组织力量对目前现有诊断试剂进行比较研究，筛选出可靠的试剂推广应用。
2.加强培养基的研制与比较。如淋菌和杜克雷嗜血杆菌的变色培养基，快速绝对浓度法测定药物最小抑菌浓度和最低杀菌浓度。
3.加强STD病原体的基因克隆与表达。我国梅毒、HIV的确诊试验、沙眼衣原体抗原、单纯疱疹病毒-2抗原等检测试剂依赖进口，其主要原因在于特异性抗原获取困难，导致不易得到单克隆抗体。迄今，梅毒螺旋体[5]、生殖支原体、沙眼衣原体和HIV全基因序列已经阐明，部分基因表达的蛋白结构和功能业已清楚。因此，有条件的实验室应加强STD病原体抗原的基因克隆表达，以利于获得高度纯化抗原，以此生产单克隆抗体，将高度特异性的抗原和单克隆抗体用于STD的诊断。早日实现STD抗原检测试剂国产化。
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4.开展多重定量PCR技术[8]，胶体金标记多种STD病原体单克隆抗体的研究，只需1份标本即可快速鉴别诊断生殖器溃疡(软下疳、硬下疳和生殖器疱疹)，淋病合并非淋菌性尿道炎(宫颈炎)。
5.开展DNA指印技术、DNA芯片技术研究。用于STD耐药检测、分子流行病学研究和分子生物学技术诊断，如一步法检测出淋菌penA、penB、mtr、tetM、gyrA和gyrB等基因。
6.加强STD耐药性监测及耐药基因的研究。尤其是青霉素治疗失败的梅毒患者[5]。
作者单位：熊礼宽(518020 深圳市慢性病防治院性病防治中心检验科)
参考文献
1，卫生部疾病控制司. 性病规范防治设施项目鉴定. 性病情况简报，2000，4：1.
, 百拇医药
2，Elkins C,Yi K,Olsen B,et al.Development of a serolgical test for Haemophilus ducreyi seroprevalence studies.J Clin Microbiol,2000,38:1520-1526.
3，孙峥嵘，孙皓，鲁润铭,等. 梅毒螺旋体低分子量多肽基因的克隆表达及临床应用. 中华检验医学杂志，2000，23：46.
4，Ebel A,Vanneste L,Cardinaels M,et al.Validation of the INNO-LIA syphilis kit as a confirmatory assay for Treponema pallidum antibodies.J Clin Microbiol, 2000,38：215-219.
5，熊礼宽，周华. 梅毒螺旋体部分抗原分子生物学研究进展. 国外医学流行病学传染病学分册,1999，26:270-273.
6，熊礼宽，周华，宁波. 梅毒螺旋体37 000内鞭毛蛋白基因的扩增、克隆及鉴定. 中华皮肤科杂志，2000，33：177-178.
7，叶顺章. 论性病实验室诊断中的几个问题. 性传播疾病诊疗与预防. 广东：广东科技出版社,1996.28-32.
8，张正. 聚合酶链反应定量技术在微生物检测中的应用. 中华医学检验杂志，1999，22增刊：22-24., 百拇医药