L-刀豆氨酸在创伤性休克中的应用研究
L-刀豆氨酸在创伤性休克中的应用研究
朱华栋 周玉淑 于学忠 邵孝鉷
关键词：L-刀豆氨酸；创伤性休克
内毒素血症、炎性因子、一氧化氮(nitric oxide, NO)在创伤性休克的发展过程中起着促进作用，减少上述物质生成，可能有助于休克的纠正。因此，笔者选用NO合酶抑制剂来抑制NO合成，以达到治疗创伤性休克的目的。
一、材料与方法
1. 实验动物： 38只新西兰大白兔，体重(2.68±0.32) kg，雌雄各半，随机分成三组：创伤性休克组(A组)13只，L-刀豆氨酸组(B组)13只，L-N-硝基精氨酸甲酯组(C组)12只。
, http://www.100md.com
2. 实验方法： A组大白兔以质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠溶液行腹腔麻醉(30 mg/kg)，然后行右侧股动、静脉插管术[动脉插管用来监测平均动脉压(MAP)，静脉插管用作补液和取血]，再静脉注射肝素(6 mg/kg)。上述手术完成后，以骨钳钳夹致大白兔一侧股骨中下1/3处粉碎性骨折，并经右股动脉快速放血(约10 min)使MAP降至(30±35) mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，维持90 min，然后回输全部失血或输入等量的林格液进行复苏，复苏需30 min，以后用质量浓度为50 g/L的葡萄糖盐水以2.5 ml*kg-1*h-1的速度静脉滴注。B组、C组创伤性休克模型的制作同A组，在进行复苏时，B组还在10 min内按 20 mg/kg静注L-刀豆氨酸，C组则在10 min内按30 mg/kg静注L-N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(药品均由美国Sigma公司提供)。各组分别在休克前、休克末、复苏末、复苏后0.5，4 h记录MAP的变化，并在上述时点抽血2 ml用来测定血浆内毒素、TNF-α、IL-6、NO的水平；然后静脉维持输液,观察24，48 h生存率，在此期间股骨骨折不做任何处理。
, 百拇医药
3. 测定方法：内毒素的测定采用显色鲎试剂定量法(试剂盒由上海医学检验中心提供)；TNF-α、IL-6的测定采用ELISA法(试剂盒由Sigma公司提供，主要用于测定人TNF-α、IL-6，但与兔TNF-α、IL-6有很高交叉反应性)；NO的测定采用Griess重氮化反应法(试剂盒由北京帮定医学公司提供)。
4. 统计学处理：组间相同指标的比较用单因素方差分析，组内不同条件下同一指标比较用无重复数据的两因素方差分析，均数两两比较用q检验；率的比较用χ2检验。以P<0.05表示差异具有显著性意义。
二、结果
1. MAP变化情况：各组大白兔复苏末MAP均恢复到休克前水平；A组复苏后0.5 h、4 h MAP分别为(82±9) mm Hg、 (50±15) mm Hg，与休克前[(103±6) mm Hg]比较，差异均具有显著性意义(P<0.01)；C组于复苏后4 h MAP开始降至(72±11) mm Hg，与休克前[(103±6) mm Hg]比较，差异具有显著性意义(P<0.01)；B组复苏后0.5 h、4 h MAP与休克前比较，差异无统计学意义。
, http://www.100md.com
2. 血浆内毒素水平：A组大白兔休克末内毒素水平为(0.541±0.098) EU/ml，复苏后0.5 h达高峰(0.824±0.153) EU/ml，与休克前[(0.138±0.029) EU/ml]比较，差异具有显著性意义(P<0.01)；而B组动物复苏后0.5 h内毒素水平为(0.701±0.132) EU/ml，明显低于同时点A组(P<0.05)；C组内毒素水平与同时点A组比较，差异无统计学意义。
3. 血浆TNF-α、IL-6水平：各组大白兔休克后TNF-α、IL-6水平较休克前明显升高；B组动物复苏后TNF-α、IL-6水平明显低于同时点A组、C组；C组TNF-α、IL-6水平与同时点A组比较，差异无统计学意义。见表1。
表1 三组大白兔不同时相点的血浆TNF-α、IL-6变化(ng/L,X±s )
组别
, 百拇医药 兔数
(只)
TNF-α
IL-6
休克前
休克末
复苏末
复苏后0.5h
复苏后4h
休克前
休克末
复苏末
复苏后0.5h
, http://www.100md.com
复苏后4h
A组
13
18.9±
70.2±
78.4±
76.5±
64.9±
11.0±
12.3±
25.1±
55.1±
67.5±
, http://www.100md.com
4.6
10.5*
10.6*
9.4*
11.2*
2.5
2.3
5.2*
10.5*
13.8*
B组
, 百拇医药
13
19.2±
72.6±
77.6±
63.2±
31.0±
11.1±
13.3±
24.0±
54.7±
26.8±
4.3
11.5*
, 百拇医药
11.4*
12.2*#△
6.6*##△△
2.6
3.6
4.8*
9.7*
6.2*##△△
C组
12
19.1±
, 百拇医药
72.5±
75.8±
74.8±
60.0±
10.8±
12.5±
24.8±
52.2±
61.3±
4.2
12.0*
9.8*
, 百拇医药
10.8*
7.2*
2.2
2.1
4.9*
8.7*
9.5*
与同组休克前比较：*P<0.01； 与同时点的A组比较：#P<0.05， ##P<0.01；与同时点的C组比较：△P<0.05 △△P<0.01 4. 血浆NO水平：A组大白兔休克末NO水平为(66.98±11.15) μmol/L，复苏后0.5 h达高峰(88.61±9.39) μmol/L，与休克前[(21.85±4.17) μmol/L]比较明显升高(P<0.01)；B组和C组动物复苏后0.5 h NO水平分别为(62.54±9.54) μmol/L和(5.37±10.12) μmol/L，均明显低于同时点的A组(P<0.01)。
, http://www.100md.com
5. 预后：B组24 h生存率77%(10/13)与A组46%(6/13)、C组50%(6/12)比较，差异有显著性意义(P<0.05)。B组48 h生存率61%(8/13)与A组23%(3/13)比较差异有显著性意义(P<0.01)；与C组33%(4/12)比较差异也有显著性意义(P<0.05)。
三、讨论
以往研究认为：创伤性休克后肠道细菌、内毒素发生移位，导致内毒素血症[1]；内毒素可刺激单核-巨噬细胞合成大量的TNF-α、IL-6等细胞因子[2]，而内毒素、细胞因子又可诱导NO生成，上述物质在休克发展过程中起着重要作用，其中NO的作用可能更为突出。笔者的研究也证实了上述观点。
NO是由NO合酶(NOS)合成，NOS包括结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)，cNOS合成的NO参与调节机体的正常生理功能；iNOS合成的NO则参与机体的病理损害。NOS抑制剂可抑制NO合成，其中L-NAME属于非选择性NOS抑制剂，L-刀豆氨酸则属于选择性iNOS抑制剂。在以往的动物实验中发现：在改善内毒素性休克的预后方面，L-刀豆氨酸明显优于 L-NAME[3]。笔者应用L-刀豆氨酸治疗创伤性休克后，提高了休克动物的生存率；而L-NAME不能改善休克动物的预后。原因可能在于L-NAME抑制iNOS的同时，也抑制了cNOS的活性，使内皮源性NO生成减少，引起全身血管收缩。这无疑会加重肠道的缺血，增加肠上皮细胞的通透性，使肠道内细菌、内毒素发生移位。而应用L-刀豆氨酸则仅能抑制iNOS活性，这样既能减轻由iNOS合成的大量NO的病理损害，又不影响cNOS合成调节正常生理功能的NO，有利于休克的纠正，由此减轻了肠道内细菌、内毒素的移位，也相应减少了TNF-α和IL-6的生成。另外L-刀豆氨酸尚能改善有氧代谢和线粒体功能，对休克的治疗也有重要意义[4]。
, 百拇医药
总之，兔创伤性休克后应用L-刀豆氨酸治疗，能明显改善休克动物的预后。但L-刀豆氨酸进行抗休克治疗的其他效应、副作用及最佳剂量问题，仍须进一步的研究。
作者单位：朱华栋(100730 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院急诊科)
周玉淑(100730 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院急诊科)
于学忠(100730 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院急诊科)
邵孝鉷(100730 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院急诊科)
参考文献
1，Jiang JX, Bahrami S, Leichtfried G, et al. Kinetics of endotoxin and tumor necrosis factor appearance in portal and system circulation after hemorrhagic shock in rats. Ann Surg, 1995, 221:100-106.
, 百拇医药
2，蒋建新，田昆仑，陈惠孙，等. 家兔创伤性休克后血浆内毒素、TNF和IL-6的动态变化. 中华麻醉学杂志，1997，17：171-173.
3，Cai M, Sakamoto A, Ogawa R. Inhibition of nitric oxide formation with L-canavanine attenuates endotoxin-induced vascular hyporeactivity in the rat. Eur J Pharm, 1996, 295:215-220.
4，Liaudet L, Feihl F, Rosselet A, et al. Beneficial effects of L-canavanine, a selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase during rodent endotoxemia. Clin Sci, 1996, 90:369-377., 百拇医药
朱华栋 周玉淑 于学忠 邵孝鉷
关键词：L-刀豆氨酸；创伤性休克
内毒素血症、炎性因子、一氧化氮(nitric oxide, NO)在创伤性休克的发展过程中起着促进作用，减少上述物质生成，可能有助于休克的纠正。因此，笔者选用NO合酶抑制剂来抑制NO合成，以达到治疗创伤性休克的目的。
一、材料与方法
1. 实验动物： 38只新西兰大白兔，体重(2.68±0.32) kg，雌雄各半，随机分成三组：创伤性休克组(A组)13只，L-刀豆氨酸组(B组)13只，L-N-硝基精氨酸甲酯组(C组)12只。
, http://www.100md.com
2. 实验方法： A组大白兔以质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠溶液行腹腔麻醉(30 mg/kg)，然后行右侧股动、静脉插管术[动脉插管用来监测平均动脉压(MAP)，静脉插管用作补液和取血]，再静脉注射肝素(6 mg/kg)。上述手术完成后，以骨钳钳夹致大白兔一侧股骨中下1/3处粉碎性骨折，并经右股动脉快速放血(约10 min)使MAP降至(30±35) mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，维持90 min，然后回输全部失血或输入等量的林格液进行复苏，复苏需30 min，以后用质量浓度为50 g/L的葡萄糖盐水以2.5 ml*kg-1*h-1的速度静脉滴注。B组、C组创伤性休克模型的制作同A组，在进行复苏时，B组还在10 min内按 20 mg/kg静注L-刀豆氨酸，C组则在10 min内按30 mg/kg静注L-N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(药品均由美国Sigma公司提供)。各组分别在休克前、休克末、复苏末、复苏后0.5，4 h记录MAP的变化，并在上述时点抽血2 ml用来测定血浆内毒素、TNF-α、IL-6、NO的水平；然后静脉维持输液,观察24，48 h生存率，在此期间股骨骨折不做任何处理。
, 百拇医药
3. 测定方法：内毒素的测定采用显色鲎试剂定量法(试剂盒由上海医学检验中心提供)；TNF-α、IL-6的测定采用ELISA法(试剂盒由Sigma公司提供，主要用于测定人TNF-α、IL-6，但与兔TNF-α、IL-6有很高交叉反应性)；NO的测定采用Griess重氮化反应法(试剂盒由北京帮定医学公司提供)。
4. 统计学处理：组间相同指标的比较用单因素方差分析，组内不同条件下同一指标比较用无重复数据的两因素方差分析，均数两两比较用q检验；率的比较用χ2检验。以P<0.05表示差异具有显著性意义。
二、结果
1. MAP变化情况：各组大白兔复苏末MAP均恢复到休克前水平；A组复苏后0.5 h、4 h MAP分别为(82±9) mm Hg、 (50±15) mm Hg，与休克前[(103±6) mm Hg]比较，差异均具有显著性意义(P<0.01)；C组于复苏后4 h MAP开始降至(72±11) mm Hg，与休克前[(103±6) mm Hg]比较，差异具有显著性意义(P<0.01)；B组复苏后0.5 h、4 h MAP与休克前比较，差异无统计学意义。
, http://www.100md.com
2. 血浆内毒素水平：A组大白兔休克末内毒素水平为(0.541±0.098) EU/ml，复苏后0.5 h达高峰(0.824±0.153) EU/ml，与休克前[(0.138±0.029) EU/ml]比较，差异具有显著性意义(P<0.01)；而B组动物复苏后0.5 h内毒素水平为(0.701±0.132) EU/ml，明显低于同时点A组(P<0.05)；C组内毒素水平与同时点A组比较，差异无统计学意义。
3. 血浆TNF-α、IL-6水平：各组大白兔休克后TNF-α、IL-6水平较休克前明显升高；B组动物复苏后TNF-α、IL-6水平明显低于同时点A组、C组；C组TNF-α、IL-6水平与同时点A组比较，差异无统计学意义。见表1。
表1 三组大白兔不同时相点的血浆TNF-α、IL-6变化(ng/L,X±s )
组别
, 百拇医药 兔数
(只)
TNF-α
IL-6
休克前
休克末
复苏末
复苏后0.5h
复苏后4h
休克前
休克末
复苏末
复苏后0.5h
, http://www.100md.com
复苏后4h
A组
13
18.9±
70.2±
78.4±
76.5±
64.9±
11.0±
12.3±
25.1±
55.1±
67.5±
, http://www.100md.com
4.6
10.5*
10.6*
9.4*
11.2*
2.5
2.3
5.2*
10.5*
13.8*
B组
, 百拇医药
13
19.2±
72.6±
77.6±
63.2±
31.0±
11.1±
13.3±
24.0±
54.7±
26.8±
4.3
11.5*
, 百拇医药
11.4*
12.2*#△
6.6*##△△
2.6
3.6
4.8*
9.7*
6.2*##△△
C组
12
19.1±
, 百拇医药
72.5±
75.8±
74.8±
60.0±
10.8±
12.5±
24.8±
52.2±
61.3±
4.2
12.0*
9.8*
, 百拇医药
10.8*
7.2*
2.2
2.1
4.9*
8.7*
9.5*
与同组休克前比较：*P<0.01； 与同时点的A组比较：#P<0.05， ##P<0.01；与同时点的C组比较：△P<0.05 △△P<0.01 4. 血浆NO水平：A组大白兔休克末NO水平为(66.98±11.15) μmol/L，复苏后0.5 h达高峰(88.61±9.39) μmol/L，与休克前[(21.85±4.17) μmol/L]比较明显升高(P<0.01)；B组和C组动物复苏后0.5 h NO水平分别为(62.54±9.54) μmol/L和(5.37±10.12) μmol/L，均明显低于同时点的A组(P<0.01)。
, http://www.100md.com
5. 预后：B组24 h生存率77%(10/13)与A组46%(6/13)、C组50%(6/12)比较，差异有显著性意义(P<0.05)。B组48 h生存率61%(8/13)与A组23%(3/13)比较差异有显著性意义(P<0.01)；与C组33%(4/12)比较差异也有显著性意义(P<0.05)。
三、讨论
以往研究认为：创伤性休克后肠道细菌、内毒素发生移位，导致内毒素血症[1]；内毒素可刺激单核-巨噬细胞合成大量的TNF-α、IL-6等细胞因子[2]，而内毒素、细胞因子又可诱导NO生成，上述物质在休克发展过程中起着重要作用，其中NO的作用可能更为突出。笔者的研究也证实了上述观点。
NO是由NO合酶(NOS)合成，NOS包括结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)，cNOS合成的NO参与调节机体的正常生理功能；iNOS合成的NO则参与机体的病理损害。NOS抑制剂可抑制NO合成，其中L-NAME属于非选择性NOS抑制剂，L-刀豆氨酸则属于选择性iNOS抑制剂。在以往的动物实验中发现：在改善内毒素性休克的预后方面，L-刀豆氨酸明显优于 L-NAME[3]。笔者应用L-刀豆氨酸治疗创伤性休克后，提高了休克动物的生存率；而L-NAME不能改善休克动物的预后。原因可能在于L-NAME抑制iNOS的同时，也抑制了cNOS的活性，使内皮源性NO生成减少，引起全身血管收缩。这无疑会加重肠道的缺血，增加肠上皮细胞的通透性，使肠道内细菌、内毒素发生移位。而应用L-刀豆氨酸则仅能抑制iNOS活性，这样既能减轻由iNOS合成的大量NO的病理损害，又不影响cNOS合成调节正常生理功能的NO，有利于休克的纠正，由此减轻了肠道内细菌、内毒素的移位，也相应减少了TNF-α和IL-6的生成。另外L-刀豆氨酸尚能改善有氧代谢和线粒体功能，对休克的治疗也有重要意义[4]。
, 百拇医药
总之，兔创伤性休克后应用L-刀豆氨酸治疗，能明显改善休克动物的预后。但L-刀豆氨酸进行抗休克治疗的其他效应、副作用及最佳剂量问题，仍须进一步的研究。
作者单位：朱华栋(100730 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院急诊科)
周玉淑(100730 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院急诊科)
于学忠(100730 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院急诊科)
邵孝鉷(100730 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院急诊科)
参考文献
1，Jiang JX, Bahrami S, Leichtfried G, et al. Kinetics of endotoxin and tumor necrosis factor appearance in portal and system circulation after hemorrhagic shock in rats. Ann Surg, 1995, 221:100-106.
, 百拇医药
2，蒋建新，田昆仑，陈惠孙，等. 家兔创伤性休克后血浆内毒素、TNF和IL-6的动态变化. 中华麻醉学杂志，1997，17：171-173.
3，Cai M, Sakamoto A, Ogawa R. Inhibition of nitric oxide formation with L-canavanine attenuates endotoxin-induced vascular hyporeactivity in the rat. Eur J Pharm, 1996, 295:215-220.
4，Liaudet L, Feihl F, Rosselet A, et al. Beneficial effects of L-canavanine, a selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase during rodent endotoxemia. Clin Sci, 1996, 90:369-377., 百拇医药