18 三体腭裂小鼠颅颌面发育畸形的形态测量学研究
18 三体腭裂小鼠颅颌面发育畸形的形态测量学研究
蔡志刚 Helmut von Domarus Eveley Engel
摘 要 目的 通过对18三体胚鼠和正常胚鼠的比较形态测量学研究，量化地认识该腭裂模型大体及颅颌面先天性发育不足。方法 采用 60只Han-NMRI母鼠及11只具有Rb(2.18)6Rma/Rb(1.18) Rma染色体结构的雄鼠，从569只子代活胚中选择52对胎鼠作为研究对象，其中每对包括一只正常胎鼠和一只与正常胎鼠体重相近的三体伴发腭裂的胎鼠。借助大体形态测量学手段对52对样本进行形态学测量研究。结果 腭裂小鼠脊柱明显屈曲，且伴有上、下颌骨后缩畸形，下颌骨较上颌骨更明显。结论 18三体伴腭裂实验动物模型伴有明显的脊柱发育畸形及上、下颌骨的严重发育不足。
, 百拇医药
关键词：腭裂；动物，实验；形态测量学
德国吕贝克医科大学培育出的常染色体三体小鼠为我们系统地研究先天性发育畸形提供了良好的机会。特别是18常染色体的三体小鼠有着较高的先天性腭裂的发生率。由于三体小鼠多于出生前或出生后短时期内死亡，所以其胚胎常被用于科学研究。我们研究的目的是通过对18三体胚鼠和正常胚鼠的比较形态测量学研究，更进一步量化地认识该腭裂模型大体及颅颌面先天性发育不足。
材料与方法
1.研究材料：60只Han-NMRI母鼠及11只具有Rb(2.18)6Rma/Rb(1.18)Rma染色体结构的雄鼠被用于该研究，在胚龄16及17 d共获得569只子代活胚。经染色体分析发现569只活胚中共95只 (16.7%)三体小鼠，在95只三体小鼠中共有68只(71.6%)伴有先天性腭裂。进一步选择52对胎鼠作为研究对象，其中每对包括1只正常(二倍体)胎鼠和1只与正常胎鼠体重相近的三体伴发腭裂的胎鼠(体重在完全脱水后测定)(表1)。借助大体形态测量学的研究手段对52对样本行形态学观察、大体软组织侧貌及头颅软组织侧貌的形态测量学研究。
, http://www.100md.com
2. 研究方法：
(1) 样本分组:按照小鼠的胚龄将52对样本分为以下3组：I组：胚龄16 d；II组：三体小鼠胚龄为17 d，正常小鼠胚龄为16 d；III组：胚龄17 d。
(2) 大体形态学测量: 将52对样本均在立体显微镜下分别拍摄其全身及头颅侧位像，进一步在照片上进行如下定点及测量研究(图1，2)：① 全身软组织侧貌测量指标：CRL：冠尾长；tg∠TCM：脊柱弧度。②头颅侧位软组织侧貌测量指标：BF：下颌体长度；∠NAK：上颌突角；∠NBD：下颌突角；∠ABD：上下颌关系角；∠SNG：颅面关系角。为保证定点的准确性，选择下颌骨下缘延伸线L为基准线，参考口裂平面和下颌下缘平面，L的确定相对恒定。L确定后LL、AK、BD、NG则相对易于确定，同时解决了A、B、D、N、G等各定点的可重复性问题。
表1 样本分组及配对平均体重(X±s)
, 百拇医药
分组
染色体类型
胚龄(d)
n
完全脱水后体重(mg)
Ⅰ
Ts
16
15
262.40±52.88
Ep
16
15
, 百拇医药
261.07±52.20
Ⅱ
Ts
17
25
380.68±48.93
Ep
16
25
382.24±49.21
Ⅲ
Ts
17
, 百拇医药
12
423.42±51.08
Ep
17
12
423.92±46.70
样本总体
Ts
-
52
356.42±80.00
Ep
-
, 百拇医药
52
356.90±80.19
注：Ts: 18三体腭裂小鼠；Ep：整倍体小鼠;组内配对t检验差异均无显著性(P>0.05)
图1 全身软组织侧貌分析
结果
1. 大体形态学测量研究结果：通过对52对样本按相近体重分组的大体侧貌形态学测量分析(表2)发现，三体腭裂小鼠身长(CRL)虽然均小于同组整倍体小鼠，但其差异无显著性；而三体小鼠脊柱屈曲程度(tg∠TCM)则明显大于整倍体小鼠。
2.头颅软组织侧貌分析：头颅软组织侧貌形态学测量结果(表3)显示，三体腭裂小鼠伴有明显的下颌体(BF)短缩；上(∠NAK)、下颌骨(∠NBD)均显示后缩畸形， 且下颌后缩明显较上颌严重(∠ABD在各组均显示三体腭裂小鼠均大于整倍体)；而∠SNG在三体小鼠则明显大于整倍体，从而说明上颌骨在垂直方向也同样有发育的不足。
, 百拇医药
图2 头颅侧位软组织侧貌分析
表2 大体侧貌形态学测量结果(X±s)
分组
胚龄 (d)
染色体
类型
n
CRL(mm)
tg∠TCM
Ⅰ
16
Ts
15
, 百拇医药
12.73±1.05
0.75±0.10
16
Ep
15
13.42±1.05
0.67±0.04*
Ⅱ
17
Ts
25
14.52±0.96
, 百拇医药
0.76±0.07
16
Ep
25
15.12±1.11
0.64±0.08*
Ⅲ
17
Ts
12
15.69±1.18
0.74±0.10
, http://www.100md.com 17
Ep
12
16.47±0.93
0.64±0.06*
Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ
Ts
52
14.27±1.49
0.75±0.08
Ep
52
14.94±1.52*
, 百拇医药
0.65±0.07*
注：* 组内配对t检验： P<0.05；Ts: 18三体伴腭裂鼠胚(trisomic foetuses with CP); Ep: 整倍体鼠胚( euploid foetuses)CRL：冠尾长度；tg∠TCM：脊柱弧度讨论
唇腭裂是人类较为常见的先天性发育畸形。在人类每600～1 000名新生儿中便会有1例唇腭裂患者，单纯腭裂的发生率则在0.027%～0.073%[1]。尽管80%的先天性唇腭裂畸形为非综合症性疾患，即大多数唇腭裂患者是单发的，截至目前文献报道已有超过300种综合症伴有各种类型的口面裂畸形，其中伴有单纯腭裂的综合症也已超过70种[2-4]。在人类常染色体的三体疾患，Patau氏综合症、Edward氏综合症和Wolf-Hirschhorn氏综合症等均伴有先天性腭裂，但这类疾病的发生机理还有待于进一步研究[5]。18三体腭裂小鼠以其较高的腭裂发生为人们更好地了解常染色体三体条件与先天性腭裂的发病关系提供了可靠的动物模型。本研究正是该模型研究的一部分，从大体形态学研究确定了该模型可能具有的先天性发育畸形，特别是颅颌面发育畸形。
, 百拇医药
表3 头颅侧位软组织侧貌形态测量学结果(X±s)
胚龄 (d)
染色体
类型
n
BF(mm)
∠ABD(°)
∠NAK(°)
∠NBD(°)
∠SNG(°)
16
Ts
, 百拇医药
15
1.04±0.14
120.80±8.18
96.83±5.91
107.37±5.44
41.87±6.30
16
Ep
15
1.15±0.07*
113.67±4.70*
90.13±6.08*
, 百拇医药
101.40±4.52*
38.57±5.73
17
Ts
25
1.12±0.14
122.04±6.50
93.52±6.40
106.38±5.13
36.92±5.16
16
Ep
, http://www.100md.com
25
1.24±0.12*
112.62±6.38*
87.44±4.89*
99.56±4.45*
33.92±3.93
17
Ts
12
1.08±0.11
120.25±7.60
, 百拇医药
92.63±6.26
106.25±6.65
35.67±4.30
17
Ep
12
1.19±0.07
113.17±4.38*
86.00±4.31*
98.75±3.26*
33.67±2.58
, 百拇医药
合计
Ts
52
1.09±0.14
121.27±7.17
94.27±6.34
106.63±5.50
38.06±5.80
Ep
52
1.20±0.10*
113.05±5.44*
, http://www.100md.com
87.88±5.28*
99.90±4.27*
35.20±4.73*
注：*: 组内配对t检验 P<0.05；Ts: 18三体伴腭裂鼠胚(trisomic foetuses with CP); Ep: 整倍体鼠胚(euploid foetuses)
小鼠的妊娠期为19～21 d，而双侧腭突的完全融合一般在妊娠15 d左右，而18三体小鼠在出生前大部分流产[6]。因此我们选择妊娠16～17 d的鼠胚作为研究对象。这样既保证能够获得足够量的样本，同时也为进一步研究腭突及其周围组织、器官的发育奠定基础。本研究配对资料的获得则是建立在Gropp、Winking[7]的研究基础上，按照他们的观点，三体小鼠一般较整倍体小鼠发育迟滞1～1.5 d，因此才可能从胚龄16～17 d的鼠胚中找到相同发育阶段的小鼠。只有比较处于相近发育阶段的三体和整倍体小鼠的生长发育指标才可能得到18三体腭裂小鼠动物模型可靠的生长发育资料，为进一步研究人类三体条件的发育畸形提供可靠资料。基于Gropp 等[7，8]的观点，选择相同体重作为配对依据，保证了计量资料的可比性。
, 百拇医药
Gropp等[9]早期的研究发现18三体NMRI小鼠仅有体重及身长的发育不足，通过X线检查并未发现其他明显畸形。本研究则在控制体重因素的前提下从大体形态上比较了18三体腭裂小鼠与整倍体小鼠的身长(CRL)和脊柱的屈曲度(tg∠TCM)，结果表明三体小鼠除有身长的发育不足外，其脊柱屈曲度明显较整倍体小鼠大，因此三体小鼠的颏部抵于其胸部，从而可能限制了其下颌骨的正常发育。这一点在后来的头颅侧貌分析中也得到了证实，尽管该动物模型同时伴有上、下颌骨的发育不足，但下颌骨较上颌骨更明显。进一步对18三体腭裂小鼠的头颅侧位软组织侧貌分析结果表明，该动物模型同时伴有上颌骨垂直向和水平向的发育不足，因此它的颅面角(∠SNG)和上颌突角(∠NAK)均较整倍体小鼠的大。个别指标在组内统计学差异无显著性，但从52对样本的统计结果看，其变化则是一致的，且在统计学上差异有显著性。组内的无差异性可能系样本量不足所致。
蔡志刚(北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科 100081)
, 百拇医药
Helmut von Domarus(Hospital of Maxillofacial Surgery, Lübeck Medical University, Germany)
Eveley Engel(Hospital of Maxillofacial Surgery, Lübeck Medical University, Germany)
参考文献
1，Melnick M. Cleft lip and cleft palate: Etiology and pathogenesis. In: Kernahan DA， Rosenstein SW. Cleft Lip and Palate： A System of Management. 1st ed. Baltimore: Williams Wilkins, 1990. 3-12.
, 百拇医药
2，Burdi A, Feingold M, Larsson KS, et al. Etiology and pathogenesis of congenital cleft lip and cleft palate, an NIDR state of the art report. Teratology, 1972, 6:255-270.
3，Cohen JR, Bankier A. Syndrome delineation involving orofacial clefting. J Cleft Palate-Craniofac, 1991, 28: 119-120.
4，Hanson JW, Murray JC. Genetic aspects of cleft lip and palate. In: Bardach J, eds. Multidisciplinary management of cleft lip and palate, Section II: genetic aspects and classification. 1st ed. Philadephia: Saunders, 1990.121-124.
, http://www.100md.com
5，Gorlin RJ, Cohen JR, Levin LS. Syndromes of the head and neck. 3rd ed.New Youk:Oxford University Press, 1990.41-47.
6，Herbst EW, Winking H. Adoptive transfer of the hematopietic system of trisomic mice with limited life span: Stem cells from six different trisomies are capable of survival. Dev Genet, 1991, 12: 415-422.
7，Gropp A, Winking H. Fertility vs. sterility in males with double Robertsonian heterozygosity and monobrachial homology. Mouse News Letter, 1981, 64: 33.
8，Domarus HV. Inherited cleft palate in an animal model. In: Kriens O, eds. What is a cleft lip and palate? A multidisciplinary update. 1st ed. Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1989.5-7.
9，Gropp D, Gropp A, Winking H. Trisomy 18 of the mouse embryo. Mouse News Letter 1981, 64: 70., http://www.100md.com
蔡志刚 Helmut von Domarus Eveley Engel
摘 要 目的 通过对18三体胚鼠和正常胚鼠的比较形态测量学研究，量化地认识该腭裂模型大体及颅颌面先天性发育不足。方法 采用 60只Han-NMRI母鼠及11只具有Rb(2.18)6Rma/Rb(1.18) Rma染色体结构的雄鼠，从569只子代活胚中选择52对胎鼠作为研究对象，其中每对包括一只正常胎鼠和一只与正常胎鼠体重相近的三体伴发腭裂的胎鼠。借助大体形态测量学手段对52对样本进行形态学测量研究。结果 腭裂小鼠脊柱明显屈曲，且伴有上、下颌骨后缩畸形，下颌骨较上颌骨更明显。结论 18三体伴腭裂实验动物模型伴有明显的脊柱发育畸形及上、下颌骨的严重发育不足。
, 百拇医药
关键词：腭裂；动物，实验；形态测量学
德国吕贝克医科大学培育出的常染色体三体小鼠为我们系统地研究先天性发育畸形提供了良好的机会。特别是18常染色体的三体小鼠有着较高的先天性腭裂的发生率。由于三体小鼠多于出生前或出生后短时期内死亡，所以其胚胎常被用于科学研究。我们研究的目的是通过对18三体胚鼠和正常胚鼠的比较形态测量学研究，更进一步量化地认识该腭裂模型大体及颅颌面先天性发育不足。
材料与方法
1.研究材料：60只Han-NMRI母鼠及11只具有Rb(2.18)6Rma/Rb(1.18)Rma染色体结构的雄鼠被用于该研究，在胚龄16及17 d共获得569只子代活胚。经染色体分析发现569只活胚中共95只 (16.7%)三体小鼠，在95只三体小鼠中共有68只(71.6%)伴有先天性腭裂。进一步选择52对胎鼠作为研究对象，其中每对包括1只正常(二倍体)胎鼠和1只与正常胎鼠体重相近的三体伴发腭裂的胎鼠(体重在完全脱水后测定)(表1)。借助大体形态测量学的研究手段对52对样本行形态学观察、大体软组织侧貌及头颅软组织侧貌的形态测量学研究。
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2. 研究方法：
(1) 样本分组:按照小鼠的胚龄将52对样本分为以下3组：I组：胚龄16 d；II组：三体小鼠胚龄为17 d，正常小鼠胚龄为16 d；III组：胚龄17 d。
(2) 大体形态学测量: 将52对样本均在立体显微镜下分别拍摄其全身及头颅侧位像，进一步在照片上进行如下定点及测量研究(图1，2)：① 全身软组织侧貌测量指标：CRL：冠尾长；tg∠TCM：脊柱弧度。②头颅侧位软组织侧貌测量指标：BF：下颌体长度；∠NAK：上颌突角；∠NBD：下颌突角；∠ABD：上下颌关系角；∠SNG：颅面关系角。为保证定点的准确性，选择下颌骨下缘延伸线L为基准线，参考口裂平面和下颌下缘平面，L的确定相对恒定。L确定后LL、AK、BD、NG则相对易于确定，同时解决了A、B、D、N、G等各定点的可重复性问题。
表1 样本分组及配对平均体重(X±s)
, 百拇医药
分组
染色体类型
胚龄(d)
n
完全脱水后体重(mg)
Ⅰ
Ts
16
15
262.40±52.88
Ep
16
15
, 百拇医药
261.07±52.20
Ⅱ
Ts
17
25
380.68±48.93
Ep
16
25
382.24±49.21
Ⅲ
Ts
17
, 百拇医药
12
423.42±51.08
Ep
17
12
423.92±46.70
样本总体
Ts
-
52
356.42±80.00
Ep
-
, 百拇医药
52
356.90±80.19
注：Ts: 18三体腭裂小鼠；Ep：整倍体小鼠;组内配对t检验差异均无显著性(P>0.05)
图1 全身软组织侧貌分析
结果
1. 大体形态学测量研究结果：通过对52对样本按相近体重分组的大体侧貌形态学测量分析(表2)发现，三体腭裂小鼠身长(CRL)虽然均小于同组整倍体小鼠，但其差异无显著性；而三体小鼠脊柱屈曲程度(tg∠TCM)则明显大于整倍体小鼠。
2.头颅软组织侧貌分析：头颅软组织侧貌形态学测量结果(表3)显示，三体腭裂小鼠伴有明显的下颌体(BF)短缩；上(∠NAK)、下颌骨(∠NBD)均显示后缩畸形， 且下颌后缩明显较上颌严重(∠ABD在各组均显示三体腭裂小鼠均大于整倍体)；而∠SNG在三体小鼠则明显大于整倍体，从而说明上颌骨在垂直方向也同样有发育的不足。
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图2 头颅侧位软组织侧貌分析
表2 大体侧貌形态学测量结果(X±s)
分组
胚龄 (d)
染色体
类型
n
CRL(mm)
tg∠TCM
Ⅰ
16
Ts
15
, 百拇医药
12.73±1.05
0.75±0.10
16
Ep
15
13.42±1.05
0.67±0.04*
Ⅱ
17
Ts
25
14.52±0.96
, 百拇医药
0.76±0.07
16
Ep
25
15.12±1.11
0.64±0.08*
Ⅲ
17
Ts
12
15.69±1.18
0.74±0.10
, http://www.100md.com 17
Ep
12
16.47±0.93
0.64±0.06*
Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ
Ts
52
14.27±1.49
0.75±0.08
Ep
52
14.94±1.52*
, 百拇医药
0.65±0.07*
注：* 组内配对t检验： P<0.05；Ts: 18三体伴腭裂鼠胚(trisomic foetuses with CP); Ep: 整倍体鼠胚( euploid foetuses)CRL：冠尾长度；tg∠TCM：脊柱弧度讨论
唇腭裂是人类较为常见的先天性发育畸形。在人类每600～1 000名新生儿中便会有1例唇腭裂患者，单纯腭裂的发生率则在0.027%～0.073%[1]。尽管80%的先天性唇腭裂畸形为非综合症性疾患，即大多数唇腭裂患者是单发的，截至目前文献报道已有超过300种综合症伴有各种类型的口面裂畸形，其中伴有单纯腭裂的综合症也已超过70种[2-4]。在人类常染色体的三体疾患，Patau氏综合症、Edward氏综合症和Wolf-Hirschhorn氏综合症等均伴有先天性腭裂，但这类疾病的发生机理还有待于进一步研究[5]。18三体腭裂小鼠以其较高的腭裂发生为人们更好地了解常染色体三体条件与先天性腭裂的发病关系提供了可靠的动物模型。本研究正是该模型研究的一部分，从大体形态学研究确定了该模型可能具有的先天性发育畸形，特别是颅颌面发育畸形。
, 百拇医药
表3 头颅侧位软组织侧貌形态测量学结果(X±s)
胚龄 (d)
染色体
类型
n
BF(mm)
∠ABD(°)
∠NAK(°)
∠NBD(°)
∠SNG(°)
16
Ts
, 百拇医药
15
1.04±0.14
120.80±8.18
96.83±5.91
107.37±5.44
41.87±6.30
16
Ep
15
1.15±0.07*
113.67±4.70*
90.13±6.08*
, 百拇医药
101.40±4.52*
38.57±5.73
17
Ts
25
1.12±0.14
122.04±6.50
93.52±6.40
106.38±5.13
36.92±5.16
16
Ep
, http://www.100md.com
25
1.24±0.12*
112.62±6.38*
87.44±4.89*
99.56±4.45*
33.92±3.93
17
Ts
12
1.08±0.11
120.25±7.60
, 百拇医药
92.63±6.26
106.25±6.65
35.67±4.30
17
Ep
12
1.19±0.07
113.17±4.38*
86.00±4.31*
98.75±3.26*
33.67±2.58
, 百拇医药
合计
Ts
52
1.09±0.14
121.27±7.17
94.27±6.34
106.63±5.50
38.06±5.80
Ep
52
1.20±0.10*
113.05±5.44*
, http://www.100md.com
87.88±5.28*
99.90±4.27*
35.20±4.73*
注：*: 组内配对t检验 P<0.05；Ts: 18三体伴腭裂鼠胚(trisomic foetuses with CP); Ep: 整倍体鼠胚(euploid foetuses)
小鼠的妊娠期为19～21 d，而双侧腭突的完全融合一般在妊娠15 d左右，而18三体小鼠在出生前大部分流产[6]。因此我们选择妊娠16～17 d的鼠胚作为研究对象。这样既保证能够获得足够量的样本，同时也为进一步研究腭突及其周围组织、器官的发育奠定基础。本研究配对资料的获得则是建立在Gropp、Winking[7]的研究基础上，按照他们的观点，三体小鼠一般较整倍体小鼠发育迟滞1～1.5 d，因此才可能从胚龄16～17 d的鼠胚中找到相同发育阶段的小鼠。只有比较处于相近发育阶段的三体和整倍体小鼠的生长发育指标才可能得到18三体腭裂小鼠动物模型可靠的生长发育资料，为进一步研究人类三体条件的发育畸形提供可靠资料。基于Gropp 等[7，8]的观点，选择相同体重作为配对依据，保证了计量资料的可比性。
, 百拇医药
Gropp等[9]早期的研究发现18三体NMRI小鼠仅有体重及身长的发育不足，通过X线检查并未发现其他明显畸形。本研究则在控制体重因素的前提下从大体形态上比较了18三体腭裂小鼠与整倍体小鼠的身长(CRL)和脊柱的屈曲度(tg∠TCM)，结果表明三体小鼠除有身长的发育不足外，其脊柱屈曲度明显较整倍体小鼠大，因此三体小鼠的颏部抵于其胸部，从而可能限制了其下颌骨的正常发育。这一点在后来的头颅侧貌分析中也得到了证实，尽管该动物模型同时伴有上、下颌骨的发育不足，但下颌骨较上颌骨更明显。进一步对18三体腭裂小鼠的头颅侧位软组织侧貌分析结果表明，该动物模型同时伴有上颌骨垂直向和水平向的发育不足，因此它的颅面角(∠SNG)和上颌突角(∠NAK)均较整倍体小鼠的大。个别指标在组内统计学差异无显著性，但从52对样本的统计结果看，其变化则是一致的，且在统计学上差异有显著性。组内的无差异性可能系样本量不足所致。
蔡志刚(北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科 100081)
, 百拇医药
Helmut von Domarus(Hospital of Maxillofacial Surgery, Lübeck Medical University, Germany)
Eveley Engel(Hospital of Maxillofacial Surgery, Lübeck Medical University, Germany)
参考文献
1，Melnick M. Cleft lip and cleft palate: Etiology and pathogenesis. In: Kernahan DA， Rosenstein SW. Cleft Lip and Palate： A System of Management. 1st ed. Baltimore: Williams Wilkins, 1990. 3-12.
, 百拇医药
2，Burdi A, Feingold M, Larsson KS, et al. Etiology and pathogenesis of congenital cleft lip and cleft palate, an NIDR state of the art report. Teratology, 1972, 6:255-270.
3，Cohen JR, Bankier A. Syndrome delineation involving orofacial clefting. J Cleft Palate-Craniofac, 1991, 28: 119-120.
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