产超广谱β-内酰胺酶菌株检出方法的探讨
产超广谱β-内酰胺酶菌株检出方法的探讨
许淑珍 刘广华 张淑兰 马纪平
摘 要 目的 提高产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌的检出率。方法 采用标准纸片扩散法、筛选法、确认法和双纸片协同法进行试验。结果 头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、氨曲南(AZT)对产ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌筛选率分别为11.2%、18.5、18.5%。CAZ/克拉维酸(clav)对产ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌确认率分别为72.3%(34/47)、75.0%(12/16)；CTX/Clav对其确认率分别为78.7%(37/47)、93.8%(15/16)。CAZ、CTX与阿莫西林/克拉维酸(AMC)纸片边缘间距为15 mm、20 mm、25 mm、30 mm时，出现协同现象率分别为100%、100%；83.3%、93.3%;23.3%、33.3%;0.0。结论 CTX和AZT对可疑产ESBLs菌株筛选率高于CAZ；确认试验中CTX优于CAZ；双纸片协同试验中纸片边缘之间距离为15mm时协同现象检出率最高。
, 百拇医药
关键词：β-内酰胺酶；抗生素；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌
近年来，引起临床感染的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌的种类和数量不断增加。其检测方法有多种[1]，我们着重探讨了美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的纸片筛选法和确认法以及非NCCLS推荐的双纸片法在日常工作中应如何正确应用，以利于产ESBLs菌株的检出。
材料和方法
一、材料
1.菌株：试验菌株：220株大肠埃希菌和120株肺炎克雷伯菌自1999年1月至12月从住院患者的尿、痰、血、脑脊液、脓等标本中分离。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922。肺炎克雷伯菌ATCC700603(协和医院赠送)。
2.VITEK-AMS细菌鉴定系统(生物梅里埃公司产品)
, 百拇医药
3.药敏纸片：头孢他啶(CAZ，30 μɡ/片)，头孢噻肟(CTX，30 μɡ/片)，氨曲南(AZT，30 μɡ/片)，阿莫西林/克拉维酸(AMC/clav，20 μɡ/10 μɡ)，OXOID公司产品。头孢他啶/克拉维酸(CAZ/clav，30 μg/10 μg)，头孢噻肟/克拉维酸(CTX/clav，30 μɡ/10 μɡ)，该含量克拉维酸由本室配制。
4.药敏用培养基：Mueller-Hinton琼脂(英国OXOID公司产品)。
5.克拉维酸标准品(中国药品生物制品检定所提供)。
二、方法
1.菌株鉴定：用VITEK-AMS系统鉴定细菌。
2.纸片筛选试验与确认试验：按照2000年NCCLSM100-S10推荐的方法操作。(1)纸片筛选试验：按标准纸片扩散法的规定进行，选用CTX、CAZ、AZT 3种药敏纸片做筛选试验，35℃18小时观察结果。CAZ大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对抑菌环直径≤22 mm，CTX和AZT抑菌环直径≤27 mm的细菌怀疑为产ESBLs菌株。(2)确认试验：按标准纸片扩散法的规定进行，用CAZ和CAZ/clav，CTX和CTX/clav.两组药敏纸片分别做确认试验。结果判读：含克拉维酸的药敏纸片与其相应不含克拉维酸的药敏纸片抑菌环直径的差值≥5 mm确定为产ESBLs菌株。
, 百拇医药
3.双纸片协同试验：按标准纸片扩散法的规定进行，在MHA平板上涂布受试菌，先在平板中心贴1张AMC纸片，然后相距其边缘15 mm、20 mm、25 mm、30 mm处分别贴1张CAZ或CTX药敏纸片，置35℃18 h，观察出现的协同现象。
结 果
1.质控菌株大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603质控药敏试验和确认试验的结果均在NCCLS规定的允许范围内。
2.用CAZ、CTX和AZT3种药敏纸片筛选出63株可疑产ESBLs菌株结果，见表1。
表1 3种药敏纸片筛选可疑产ESBLs菌株的结果
细菌(株数)
CAZ(≤22mm)
, 百拇医药
株数(%)
CTX(≤27mm)
株数(%)
AZT(≤27mm)
株数(%)
肺炎克雷伯菌(120)
12*(10.0)
16a(13.3)
16a(13.3)
大肠埃希菌(220)
26*(11.8)
, 百拇医药
47b(21.4)
47b(21.4)
* 全部包括在CTX和AZT筛选出的菌株中；a、b:CTX和AZT筛选出的菌株完全一致
3.CAZ和CTX及其含克拉维酸的药敏纸片对63株可疑产ESBLs菌株的确认试验结果见表2。CAZ和CTX及其含克拉维酸的药敏纸片对产ESBLs菌株确认试验差值的分布情况，见表3。表中CAZ组差值为5 mm的占32.6%，9～22 mm的占26.1%，CTX组5 mm的占7.7%，9～22 mm的占88.5%。CTX组对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检出率分别为16.8%(37/220)和12.5%(15/120)，CAZ组分别为15.5%(34/220)和10.0%(12/120)。
表2 两组药敏纸片对产ESBLs细菌的确认试验结果
, 百拇医药
细菌
株数
CAZ组
CTX组
+
-
大肠埃希菌
47
+
34
0
-
3
10
, 百拇医药
肺炎克雷伯菌
16
+
12
0
-
3
1
注：+：产ESBLs菌株；-：不产ESBLs菌株表3 两组药敏纸片对产ESBLs细菌确认试验
差值的分布情况
菌 名
(株数)
, 百拇医药
药敏
纸片
差值(mm)
5
6～8
9～22
大肠埃希菌
(34)
CAZ
12
14
8
(37)
, http://www.100md.com
CTX
3
0
34
肺炎克雷伯菌
(12)
CAZ
3
5
4
(15)
CTX
1
2
, 百拇医药
12
4.用30株产ESBLs大肠埃希菌检测CAZ、CTX与AMC纸片之间不同距离出现的协同现象(表4)。表4 CAZ、CTX与AMC纸片之间不同距离
出现协同现象株数(%)
株数
距离
(mm)
CAZ与AMC协同
CTX与AMC协同
株数(%)
株数(%)
30
, 百拇医药
15
30(100)
30(100)
30
20
25(83.3)
28(93.3)
30
25
7(23.3)
10(33.3)
30
30
, 百拇医药
0(0)
0(0)
讨论
大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603的质控结果均在NCCLS 2000年M100-S10规定的质控允许范围内，说明试验条件合格。表1显示，同时用CTX、AZT和CAZ 3种药敏纸片筛选产ESBLs菌株时，CTX和AZT两种药敏纸片对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌筛选率相同均为21.4%和13.3%，高于CAZ(11.8%，10.0%)，由此看出，在筛选试验中，最好选用CTX或AZT。表2中，CAZ组确认的菌株全部包括在CTX组中，CTX组对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的确认率(78.7%，93.8%)高于CAZ组(72.3%，75.0%)，表3中CAZ组中差值为5 mm的占32.6%，如果人为因素测量有误差时有可能将这部分细菌漏检。由于CTX耐药率高，出现了CTX组中差值为9 mm以上的占88.5%，差值大，容易观察结果，不易漏检ESBLs菌株，因此，在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的确认试验中最好选用CTX，由于我们研究的菌株量不大，为避免漏检ESBLs菌株，最好也同时用CAZ。由质粒介导的产ESBLs细菌在我国不同地区广泛传播[2，3]，我院对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别为16.8%和12.5%，因此加强对其监测十分必要。双纸片协同法虽然不是NCCLS推荐的方法，但是在日常工作中仍然起一定作用，在我们的常规药敏试验中对发现CAZ或CTX与AMC之间出现协同现象的菌株经确认全部为产ESBLs细菌，与文献报道一致[4]。但双纸片之间的距离确是影响结果的关键因素，表4结果显示CAZ、CTX与AMC之间纸片边缘到边缘的距离为15 mm时出现协同现象为100%，比距离为20 mm、25 mm、30 mm时协同现象检出率高，与文献报道一致[5]，由于CTX耐药率高，在日常工作中CTX较CAZ与AMC之间出现的协同现象更容易观察。
, 百拇医药
基金项目：北京市自然科学基金资助项目(7992017)
作者单位：许淑珍(100050北京首都医科大学附属北京友谊医院检验科)
张淑兰(100050北京首都医科大学附属北京友谊医院检验科)
马纪平(100050北京首都医科大学附属北京友谊医院检验科)
刘广华(长春市儿童医院检验科)
参考文献
1，倪语星，毛向群，王志军.质粒介导的超广谱β-内酰胺酶的耐药性问题及检测.中华医学检验杂志，1999，22增刊:19-21.
2，孙长贵，陈汉美，颜秉兴，等.评价三种筛选方法检测超广谱β-内酰胺酶及其临床应用.中华医学检验杂志，1999，22:228-231.
, http://www.100md.com
3，许锦民，苏丹红.大肠埃希菌和克雷伯菌属产超广谱β-内酰胺酶的检测.中华医学检验杂志，1998，21：373.
4，Schooneveldt-JM; Nimmo-GR; Giffard-p. Detection and characteristics of extended spectrum beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae causing nosocomial infection. Pathology, 1998,30:164-168.
5，Laboratory Centre for Disease Control. Guidelines on susceptibility testing of antibiotic-resistant Enterobacteriaceae due to extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). 1998. 11.ISBN0-662-02429-X., 百拇医药
许淑珍 刘广华 张淑兰 马纪平
摘 要 目的 提高产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌的检出率。方法 采用标准纸片扩散法、筛选法、确认法和双纸片协同法进行试验。结果 头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、氨曲南(AZT)对产ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌筛选率分别为11.2%、18.5、18.5%。CAZ/克拉维酸(clav)对产ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌确认率分别为72.3%(34/47)、75.0%(12/16)；CTX/Clav对其确认率分别为78.7%(37/47)、93.8%(15/16)。CAZ、CTX与阿莫西林/克拉维酸(AMC)纸片边缘间距为15 mm、20 mm、25 mm、30 mm时，出现协同现象率分别为100%、100%；83.3%、93.3%;23.3%、33.3%;0.0。结论 CTX和AZT对可疑产ESBLs菌株筛选率高于CAZ；确认试验中CTX优于CAZ；双纸片协同试验中纸片边缘之间距离为15mm时协同现象检出率最高。
, 百拇医药
关键词：β-内酰胺酶；抗生素；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌
近年来，引起临床感染的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌的种类和数量不断增加。其检测方法有多种[1]，我们着重探讨了美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的纸片筛选法和确认法以及非NCCLS推荐的双纸片法在日常工作中应如何正确应用，以利于产ESBLs菌株的检出。
材料和方法
一、材料
1.菌株：试验菌株：220株大肠埃希菌和120株肺炎克雷伯菌自1999年1月至12月从住院患者的尿、痰、血、脑脊液、脓等标本中分离。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922。肺炎克雷伯菌ATCC700603(协和医院赠送)。
2.VITEK-AMS细菌鉴定系统(生物梅里埃公司产品)
, 百拇医药
3.药敏纸片：头孢他啶(CAZ，30 μɡ/片)，头孢噻肟(CTX，30 μɡ/片)，氨曲南(AZT，30 μɡ/片)，阿莫西林/克拉维酸(AMC/clav，20 μɡ/10 μɡ)，OXOID公司产品。头孢他啶/克拉维酸(CAZ/clav，30 μg/10 μg)，头孢噻肟/克拉维酸(CTX/clav，30 μɡ/10 μɡ)，该含量克拉维酸由本室配制。
4.药敏用培养基：Mueller-Hinton琼脂(英国OXOID公司产品)。
5.克拉维酸标准品(中国药品生物制品检定所提供)。
二、方法
1.菌株鉴定：用VITEK-AMS系统鉴定细菌。
2.纸片筛选试验与确认试验：按照2000年NCCLSM100-S10推荐的方法操作。(1)纸片筛选试验：按标准纸片扩散法的规定进行，选用CTX、CAZ、AZT 3种药敏纸片做筛选试验，35℃18小时观察结果。CAZ大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对抑菌环直径≤22 mm，CTX和AZT抑菌环直径≤27 mm的细菌怀疑为产ESBLs菌株。(2)确认试验：按标准纸片扩散法的规定进行，用CAZ和CAZ/clav，CTX和CTX/clav.两组药敏纸片分别做确认试验。结果判读：含克拉维酸的药敏纸片与其相应不含克拉维酸的药敏纸片抑菌环直径的差值≥5 mm确定为产ESBLs菌株。
, 百拇医药
3.双纸片协同试验：按标准纸片扩散法的规定进行，在MHA平板上涂布受试菌，先在平板中心贴1张AMC纸片，然后相距其边缘15 mm、20 mm、25 mm、30 mm处分别贴1张CAZ或CTX药敏纸片，置35℃18 h，观察出现的协同现象。
结 果
1.质控菌株大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603质控药敏试验和确认试验的结果均在NCCLS规定的允许范围内。
2.用CAZ、CTX和AZT3种药敏纸片筛选出63株可疑产ESBLs菌株结果，见表1。
表1 3种药敏纸片筛选可疑产ESBLs菌株的结果
细菌(株数)
CAZ(≤22mm)
, 百拇医药
株数(%)
CTX(≤27mm)
株数(%)
AZT(≤27mm)
株数(%)
肺炎克雷伯菌(120)
12*(10.0)
16a(13.3)
16a(13.3)
大肠埃希菌(220)
26*(11.8)
, 百拇医药
47b(21.4)
47b(21.4)
* 全部包括在CTX和AZT筛选出的菌株中；a、b:CTX和AZT筛选出的菌株完全一致
3.CAZ和CTX及其含克拉维酸的药敏纸片对63株可疑产ESBLs菌株的确认试验结果见表2。CAZ和CTX及其含克拉维酸的药敏纸片对产ESBLs菌株确认试验差值的分布情况，见表3。表中CAZ组差值为5 mm的占32.6%，9～22 mm的占26.1%，CTX组5 mm的占7.7%，9～22 mm的占88.5%。CTX组对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检出率分别为16.8%(37/220)和12.5%(15/120)，CAZ组分别为15.5%(34/220)和10.0%(12/120)。
表2 两组药敏纸片对产ESBLs细菌的确认试验结果
, 百拇医药
细菌
株数
CAZ组
CTX组
+
-
大肠埃希菌
47
+
34
0
-
3
10
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肺炎克雷伯菌
16
+
12
0
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3
1
注：+：产ESBLs菌株；-：不产ESBLs菌株表3 两组药敏纸片对产ESBLs细菌确认试验
差值的分布情况
菌 名
(株数)
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药敏
纸片
差值(mm)
5
6～8
9～22
大肠埃希菌
(34)
CAZ
12
14
8
(37)
, http://www.100md.com
CTX
3
0
34
肺炎克雷伯菌
(12)
CAZ
3
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4
(15)
CTX
1
2
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12
4.用30株产ESBLs大肠埃希菌检测CAZ、CTX与AMC纸片之间不同距离出现的协同现象(表4)。表4 CAZ、CTX与AMC纸片之间不同距离
出现协同现象株数(%)
株数
距离
(mm)
CAZ与AMC协同
CTX与AMC协同
株数(%)
株数(%)
30
, 百拇医药
15
30(100)
30(100)
30
20
25(83.3)
28(93.3)
30
25
7(23.3)
10(33.3)
30
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讨论
大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603的质控结果均在NCCLS 2000年M100-S10规定的质控允许范围内，说明试验条件合格。表1显示，同时用CTX、AZT和CAZ 3种药敏纸片筛选产ESBLs菌株时，CTX和AZT两种药敏纸片对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌筛选率相同均为21.4%和13.3%，高于CAZ(11.8%，10.0%)，由此看出，在筛选试验中，最好选用CTX或AZT。表2中，CAZ组确认的菌株全部包括在CTX组中，CTX组对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的确认率(78.7%，93.8%)高于CAZ组(72.3%，75.0%)，表3中CAZ组中差值为5 mm的占32.6%，如果人为因素测量有误差时有可能将这部分细菌漏检。由于CTX耐药率高，出现了CTX组中差值为9 mm以上的占88.5%，差值大，容易观察结果，不易漏检ESBLs菌株，因此，在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的确认试验中最好选用CTX，由于我们研究的菌株量不大，为避免漏检ESBLs菌株，最好也同时用CAZ。由质粒介导的产ESBLs细菌在我国不同地区广泛传播[2，3]，我院对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别为16.8%和12.5%，因此加强对其监测十分必要。双纸片协同法虽然不是NCCLS推荐的方法，但是在日常工作中仍然起一定作用，在我们的常规药敏试验中对发现CAZ或CTX与AMC之间出现协同现象的菌株经确认全部为产ESBLs细菌，与文献报道一致[4]。但双纸片之间的距离确是影响结果的关键因素，表4结果显示CAZ、CTX与AMC之间纸片边缘到边缘的距离为15 mm时出现协同现象为100%，比距离为20 mm、25 mm、30 mm时协同现象检出率高，与文献报道一致[5]，由于CTX耐药率高，在日常工作中CTX较CAZ与AMC之间出现的协同现象更容易观察。
, 百拇医药
基金项目：北京市自然科学基金资助项目(7992017)
作者单位：许淑珍(100050北京首都医科大学附属北京友谊医院检验科)
张淑兰(100050北京首都医科大学附属北京友谊医院检验科)
马纪平(100050北京首都医科大学附属北京友谊医院检验科)
刘广华(长春市儿童医院检验科)
参考文献
1，倪语星，毛向群，王志军.质粒介导的超广谱β-内酰胺酶的耐药性问题及检测.中华医学检验杂志，1999，22增刊:19-21.
2，孙长贵，陈汉美，颜秉兴，等.评价三种筛选方法检测超广谱β-内酰胺酶及其临床应用.中华医学检验杂志，1999，22:228-231.
, http://www.100md.com
3，许锦民，苏丹红.大肠埃希菌和克雷伯菌属产超广谱β-内酰胺酶的检测.中华医学检验杂志，1998，21：373.
4，Schooneveldt-JM; Nimmo-GR; Giffard-p. Detection and characteristics of extended spectrum beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae causing nosocomial infection. Pathology, 1998,30:164-168.
5，Laboratory Centre for Disease Control. Guidelines on susceptibility testing of antibiotic-resistant Enterobacteriaceae due to extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). 1998. 11.ISBN0-662-02429-X., 百拇医药