连环素α、β在哮喘豚鼠模型中的表达变化
连环素α、β在哮喘豚鼠模型中的表达变化
潘频华 吴鄂生 陈清兰 尹本义 胡成平 陈琼
关键词：连环素α；β；哮喘；豚鼠 上皮钙粘附素(E-cadherin，E-cd)与连环素(catenin)α、β结合构成的复合体是介导同型上皮细胞连接、维持呼吸道上皮细胞极性和完整性最重要的细胞粘附机制[1]。支气管哮喘是气道的慢性变应性炎症，气道粘膜上皮细胞脆性增加、上皮细胞脱落、基底膜暴露是支气管哮喘的病理特征之一。为探讨支气管哮喘气道粘膜上皮的这种改变是否与catenin α、β的表达变化有关，我们应用免疫组化法观察了catenin α、β在支气管哮喘模型中的表达变化及地塞米松对其表达的影响。
材料与方法 健康豚鼠24只(雌雄不拘)，8～10周龄，体重200～250 g(由本校实验动物中心提供)。随机分成3组：哮喘组(A组)、地塞米松干预组(B组)、 正常组(C组)，每组8只，A组于第1天腹腔注射10%卵蛋白(美国Sigma公司)1 ml，致敏2周后给于1%卵蛋白混悬液雾化吸入至出现腹肌收缩、呼吸困难等哮喘症状，每天1次，共7 d。B组处理同A组，不同之处是B组每次雾化诱喘前豚鼠腹腔注射地塞米松2 mg/kg。C组用生理盐水代替卵蛋白和地塞米松。
, 百拇医药
1周后以2% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉豚鼠、肺动脉插管快速灌注生理盐水100～200 ml至双侧肺呈白色，再接着肺动脉持续灌注4% 多聚甲醛30 min，取下双侧肺组织，气管内注入1.5 ml 4% 多聚甲醛，结扎气管，至肺组织于4% 多聚甲醛中膨胀固定6～10 h，常规石蜡包埋切片。
免疫组化SABC染色：采用武汉博士德公司SABC免疫组化试剂盒。取5 μm厚石蜡切片，3% H2O2甲醇溶液30 min，微波修复抗原2 min×5次，抗原修复液室温10 min，正常封闭山羊血清室温30 min，分别滴加兔抗人、鼠catenin α、β单克隆抗体(工作浓度均为1∶500，美国Sigma公司)、37 ℃反应30 min，4 ℃过夜，滴加生物素化二抗反应30 min，SABC复合物30 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。结果判断：以上皮细胞膜/浆染棕黄色为阳性，每张切片在光学显微镜下(×400倍)分别随机计数500个气管和细支气管上皮细胞，计数阳性细胞百分率。
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数据统计分析：以X±s 表示，采用SPSS 7.5统计软件进行F检验。
结果 catenin α、β在肺组织中的染色特征：正常组豚鼠气管、细支气管粘膜上皮细胞完整，catenin α、β表达强阳性，其细胞定位主要在细胞膜上，在细胞连接的侧面更为明显，部分细胞胞浆亦有轻度着色，细胞轮廓清晰(图1，2)。哮喘模型组气道粘膜上皮细胞呈灶性脱落，气管、细支气管粘膜上皮catenin α、β表达阳性细胞明显减少、表达强度减弱，且弥散于胞浆内，细胞界线模糊不清(图3，4)。地塞米松干预组气管、细支气管上皮细胞catenin α、β表达较哮喘组明显增强(图5，6)。
各组catenin α、β表达阳性率比较：见表1。
表1 豚鼠呼吸道上皮细胞catenin α、β阳性
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表达率(%，X±s)
组别
鼠数
catenin α
catenin β
气管
细支气管
气管
细支气管
正常组
8
90±4
89±6
, 百拇医药
87±4
88±4
哮喘组
8
55±7※△
60±7※△
52±7※△
54±6※△
地塞米松组
8
84±5
86±6
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83±5
83±5
注：与正常组比较※ P<0.01，与地塞米松组比较△ P<0.01
讨论 Catenin α、β与E-cadherin复合体在介导同型上皮细胞之间粘附连接、维持上皮极性和完整性等方面起着重要作用。E-cd是一个跨膜蛋白，其胞膜内侧区与catenin α、β(紧密连接区还有catenin γ参与)紧密结合，catenin α、β起稳定E-cd于细胞膜上和介导细胞内信号传导的功能，catenin α、β的功能和表达变化均可影响E-cd在细胞膜上的稳定性，既而影响细胞的粘附功能。近年来有关catenin α、β-E-cd复合体在肿瘤浸润转移以及炎症损伤修复中的变化开始引起重视[2，3]。本组结果显示，支气管哮喘气道上皮细胞出现损伤脱落时，气管和细支气管上皮细胞catenin α、β的表达均明显降低，并脱离胞膜边缘游离于胞浆之中，说明哮喘气道上皮细胞损害涉及各级支气管。而地塞米松干预后气道上皮细胞catenin α、β的表达均明显上调，同时粘膜上皮层亦较完整。 以上结果表明，catenin α、β的表达下调与支气管哮喘气道上皮细胞的损伤脱落密切相关。
, 百拇医药
图1、2 分别为cateninα、catenin β在正常豚鼠肺组织中表达SABC染色×400
图3、4分别为cateninα、catenin β在哮喘豚鼠中表达SABC染色×400
, 百拇医药
图5、6 分别为地塞米松干预组cateninα、catenin β的表达SABC色×400
作者单位：潘频华(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
吴鄂生(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
陈清兰(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
尹本义(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
胡成平(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
陈琼(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
参考文献
, 百拇医药
[1]王曦，李军，吴人亮. 上皮钙粘附素-连环素复合体功能调控的研究进展. 国外医学分子生物学分册，1998，20：42.
[2]Efstathiou JA，Pignatelli M. Modulation of epithelial cell adhesion in gastrointestinal homeostasis. Am J Pathology , 1998，153:341.
[3]Ozawa M，Kemler R. Altered cell adhesion activity by pervanadate due to the dissociation of alpha-catenin from the E-cadherin.catenin complex . J Biol Chem，1998,273:6166-6170., http://www.100md.com
潘频华 吴鄂生 陈清兰 尹本义 胡成平 陈琼
关键词：连环素α；β；哮喘；豚鼠 上皮钙粘附素(E-cadherin，E-cd)与连环素(catenin)α、β结合构成的复合体是介导同型上皮细胞连接、维持呼吸道上皮细胞极性和完整性最重要的细胞粘附机制[1]。支气管哮喘是气道的慢性变应性炎症，气道粘膜上皮细胞脆性增加、上皮细胞脱落、基底膜暴露是支气管哮喘的病理特征之一。为探讨支气管哮喘气道粘膜上皮的这种改变是否与catenin α、β的表达变化有关，我们应用免疫组化法观察了catenin α、β在支气管哮喘模型中的表达变化及地塞米松对其表达的影响。
材料与方法 健康豚鼠24只(雌雄不拘)，8～10周龄，体重200～250 g(由本校实验动物中心提供)。随机分成3组：哮喘组(A组)、地塞米松干预组(B组)、 正常组(C组)，每组8只，A组于第1天腹腔注射10%卵蛋白(美国Sigma公司)1 ml，致敏2周后给于1%卵蛋白混悬液雾化吸入至出现腹肌收缩、呼吸困难等哮喘症状，每天1次，共7 d。B组处理同A组，不同之处是B组每次雾化诱喘前豚鼠腹腔注射地塞米松2 mg/kg。C组用生理盐水代替卵蛋白和地塞米松。
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1周后以2% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉豚鼠、肺动脉插管快速灌注生理盐水100～200 ml至双侧肺呈白色，再接着肺动脉持续灌注4% 多聚甲醛30 min，取下双侧肺组织，气管内注入1.5 ml 4% 多聚甲醛，结扎气管，至肺组织于4% 多聚甲醛中膨胀固定6～10 h，常规石蜡包埋切片。
免疫组化SABC染色：采用武汉博士德公司SABC免疫组化试剂盒。取5 μm厚石蜡切片，3% H2O2甲醇溶液30 min，微波修复抗原2 min×5次，抗原修复液室温10 min，正常封闭山羊血清室温30 min，分别滴加兔抗人、鼠catenin α、β单克隆抗体(工作浓度均为1∶500，美国Sigma公司)、37 ℃反应30 min，4 ℃过夜，滴加生物素化二抗反应30 min，SABC复合物30 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。结果判断：以上皮细胞膜/浆染棕黄色为阳性，每张切片在光学显微镜下(×400倍)分别随机计数500个气管和细支气管上皮细胞，计数阳性细胞百分率。
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数据统计分析：以X±s 表示，采用SPSS 7.5统计软件进行F检验。
结果 catenin α、β在肺组织中的染色特征：正常组豚鼠气管、细支气管粘膜上皮细胞完整，catenin α、β表达强阳性，其细胞定位主要在细胞膜上，在细胞连接的侧面更为明显，部分细胞胞浆亦有轻度着色，细胞轮廓清晰(图1，2)。哮喘模型组气道粘膜上皮细胞呈灶性脱落，气管、细支气管粘膜上皮catenin α、β表达阳性细胞明显减少、表达强度减弱，且弥散于胞浆内，细胞界线模糊不清(图3，4)。地塞米松干预组气管、细支气管上皮细胞catenin α、β表达较哮喘组明显增强(图5，6)。
各组catenin α、β表达阳性率比较：见表1。
表1 豚鼠呼吸道上皮细胞catenin α、β阳性
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表达率(%，X±s)
组别
鼠数
catenin α
catenin β
气管
细支气管
气管
细支气管
正常组
8
90±4
89±6
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87±4
88±4
哮喘组
8
55±7※△
60±7※△
52±7※△
54±6※△
地塞米松组
8
84±5
86±6
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83±5
83±5
注：与正常组比较※ P<0.01，与地塞米松组比较△ P<0.01
讨论 Catenin α、β与E-cadherin复合体在介导同型上皮细胞之间粘附连接、维持上皮极性和完整性等方面起着重要作用。E-cd是一个跨膜蛋白，其胞膜内侧区与catenin α、β(紧密连接区还有catenin γ参与)紧密结合，catenin α、β起稳定E-cd于细胞膜上和介导细胞内信号传导的功能，catenin α、β的功能和表达变化均可影响E-cd在细胞膜上的稳定性，既而影响细胞的粘附功能。近年来有关catenin α、β-E-cd复合体在肿瘤浸润转移以及炎症损伤修复中的变化开始引起重视[2，3]。本组结果显示，支气管哮喘气道上皮细胞出现损伤脱落时，气管和细支气管上皮细胞catenin α、β的表达均明显降低，并脱离胞膜边缘游离于胞浆之中，说明哮喘气道上皮细胞损害涉及各级支气管。而地塞米松干预后气道上皮细胞catenin α、β的表达均明显上调，同时粘膜上皮层亦较完整。 以上结果表明，catenin α、β的表达下调与支气管哮喘气道上皮细胞的损伤脱落密切相关。
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图1、2 分别为cateninα、catenin β在正常豚鼠肺组织中表达SABC染色×400
图3、4分别为cateninα、catenin β在哮喘豚鼠中表达SABC染色×400
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图5、6 分别为地塞米松干预组cateninα、catenin β的表达SABC色×400
作者单位：潘频华(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
吴鄂生(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
陈清兰(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
尹本义(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
胡成平(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
陈琼(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院呼吸科)
参考文献
, 百拇医药
[1]王曦，李军，吴人亮. 上皮钙粘附素-连环素复合体功能调控的研究进展. 国外医学分子生物学分册，1998，20：42.
[2]Efstathiou JA，Pignatelli M. Modulation of epithelial cell adhesion in gastrointestinal homeostasis. Am J Pathology , 1998，153:341.
[3]Ozawa M，Kemler R. Altered cell adhesion activity by pervanadate due to the dissociation of alpha-catenin from the E-cadherin.catenin complex . J Biol Chem，1998,273:6166-6170., http://www.100md.com