哮喘大鼠抗原激发后嗜酸细胞迁移的研究
哮喘大鼠抗原激发后嗜酸细胞迁移的研究
汪慧英 沈华浩
关键词：哮喘；大鼠；抗原；嗜酸细胞
我们应用大鼠哮喘模型研究在抗原激发后不同时刻外周血、气道、支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸细胞(EOS)的变化，探讨EOS在哮喘发病时的迁移过程及与气道反应性的关系，并观察糖皮质激素对此的影响。
材料与方法 雄性SD大鼠72只(浙江大学医学院实验动物中心提供)，体重(117±10)g，随机分成3组：致敏组(S组)：各组24只大鼠。以生理盐水1 ml、鸡卵白蛋白(OVA，美国Sigma公司)1.0 mg、氢氧化铝凝胶Al (OH)3 100 mg对大鼠进行皮下、腹腔注射致敏，2周后以1% OVA气雾激发15 min；地塞米松预处理组(DXM组)：在抗原激发前24 h、1 h各予DXM 40 mg/kg腹腔注射；正常对照组(NC组)以生理盐水替代OVA。抗原激发后6 h大鼠腹腔注射安定7.5 mg/kg后以30～40 min 的间隔吸入超声雾化的0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L 氯化乙酰胆碱(Mch，美国Sigma公司)，记录其呼吸频率变化，以使呼吸频率增加30%时所需Mch的浓度负对数(-Log PC30，mmol/m3)作为评价气道反应性高低的指标。 在抗原激发后0、6、12、24 h 各组分别处死6只大鼠，取血、BALF计数EOS；取肺做切片，苏木精-伊红染色后利用计算机图像分析软件(浙江大学医学院神经生物学实验室研制，ZUNL-SIMAG 1.0)测定切片中细支气管单位管壁面积中浸润的EOS数量。
, http://www.100md.com
统计学处理：实验数据以SPSS 6.0软件进行单因素方差分析，t检验或秩和检验。
结果 各组在抗原激发0时刻比较差异无显著性，NC组不同时刻比较差异无显著性。S组BALF中EOS随时间增加有显著增高(F=34.14，P<0.001)。抗原激发后6 h即见增高(P<0.001)，24 h明显增高；外周血EOS在抗原激发后6 h显著下降(P<0.05)，此后回升，至24 h恢复正常；细支气管管壁浸润的EOS随时间变化有显著增高(H=11.31，P=0.01)见表1。显微镜下可见S组支气管及周围小血管的管壁有大量EOS浸润。抗原激发后6 h S组的-Log PC30显著高于NC组(t=2.63，P=0.02，表2)。DXM预处理可完全阻断抗原诱导的气道高反应性，使外周血、BALF及肺组织EOS数量下降，但未完全阻断EOS浸润。
讨论 已知致敏可使大鼠外周血中EOS的程序死亡时间延长，而本组研究中致敏大鼠在抗原激发后6 h外周血中EOS急剧下降，可能是转移到其它组织中去了。至于12 h后的增高，可能是骨髓中EOS释放到外周血中。
, 百拇医药
正常大鼠的气道、BALF中几乎没有EOS，而致敏大鼠在抗原激发后6 h气道有大量EOS浸润。这一变化很难用气道中少量EOS祖细胞在如此短时间内分化而来解释，联系到此时外周血EOS的下降，可认为肺组织中EOS是由外周血迁移而来。同样BALF中EOS也只能是由气道迁移而来。影响其迁移的重要因素是支气管腔中高浓度的eotaxin和白细胞介素5(IL-5)。Ohkawara等[1]报道，在抗原激发后24 h BALF中IL-5的高峰，与本组实验一致，可见IL-5在维持BALF中EOS的活性及延长其生存时间中起着重要作用。
表1 抗原激发后不同时刻不同组织中EOS的变化(X±s)
时刻
(h)
组别
鼠数
, http://www.100md.com
(只)
BALF
EOS(108个/L)
外周血
EOS(108个/L)
细支气管管壁周围
EOS(个/1 000 μm2)
0
S组
5
0.10±0.09
2.46±1.14
, 百拇医药
0.85± 0.77
DXM组
5
0.07±0.09
0.86±0.77
0.68± 0.57
NC组
5
0.04±0.03
1.52±0.74
0.57± 0.42
6
, http://www.100md.com
S组
5
4.86±1.68**
0.65±0.21*
26.83± 5.37*
DXM组
5
0.17±0.22
0.29±0.17
2.75± 0.29*
NC组
, http://www.100md.com
5
0.09±0.11
1.38±0.77
0.53± 0.50
12
S组
6
4.97±1.84*
1.83±1.26
26.83± 5.37*
DXM组
5
, http://www.100md.com
0.17±0.15
0.42±0.30
2.75± 0.29*
NC组
5
0.09±0.10
1.45±0.66
0.53± 0.50
24
S组
6
10.12±1.61*▲
, 百拇医药
2.19±0.86#
34.09±20.69*
DXM组
5
2.28±0.79*
0.85±0.51
3.34± 0.218*
NC组
5
0.04±0.04
1.39±0.67
, http://www.100md.com
0.59± 0.52
注：同一组别不同时刻亚组间单因素方差检验：与0时刻比较* P<0.05，** P<0.001；与6 h组比较# P<0.05，与12 h比较 ▲ P<0.05表2 大鼠呼吸频率增加30%所需的Mch浓度
负对数(mmol/m3，X±s)
组别
鼠数
-Log PC30
S组
6
7.80±1.24*#
, http://www.100md.com
NC组
7
6.14±0.86
DXM组
9
6.30±0.88
注：与NC组比较* P<0.05；与DXM组比较# P<0.05
在抗原激发后6 h致敏大鼠气道反应性明显增高，与国外文献报道的哮喘患者气道中EOS的升高与气道反应性的增高相关一致，可能与EOS对气道上皮细胞有直接的破坏作用有关。
由以上结果可推测，致敏大鼠在抗原激发后6 h，外周血中EOS迁移到气道，并穿过上皮层向管腔内迁移，24 h后管腔内EOS达到高峰。据国外文献报道，OVA致敏或寄生虫感染后均出现骨髓中EOS增高[2]，而抗原激发后即刻有骨髓EOS的下降及外周血EOS的上升，由此可推论，致敏大鼠在抗原激发后首先有骨髓中EOS向外周血的迁移。
, 百拇医药
DXM的应用可有效地抑制此迁移过程及气道高反应性，与临床上DXM的疗效一致。其主要原因可能是DXM可有效地抑制细胞因子IL-5的产生，导致EOS的凋亡加速。但DXM的大剂量应用可致外周血中白细胞、EOS大幅度降低，提示以DXM治疗哮喘需以合适的给药方式和剂量。
志谢 浙江大学医学院附属第二医院呼吸内科刘富光教授、浙江大学医学院药理教研室魏尔清教授
作者单位：汪慧英(310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院呼吸内科)
沈华浩(310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院呼吸内科)
参考文献
[1]Ohkawara Y, Lei XF, Stampfli MR, et al. Cytokine and eosinophil responses in the lung, peripheral blood, and bone marrow compartments in a murine model of allergen-induced airways inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:510-520.
[2]Nittoh T, Arii M, Suzuki R, et al. Increase of eosinophilic cell population in bone marrow of rats by immunization with Ascaris suum antigen. Immunol Invest, 1997,26:439-451., 百拇医药
汪慧英 沈华浩
关键词：哮喘；大鼠；抗原；嗜酸细胞
我们应用大鼠哮喘模型研究在抗原激发后不同时刻外周血、气道、支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸细胞(EOS)的变化，探讨EOS在哮喘发病时的迁移过程及与气道反应性的关系，并观察糖皮质激素对此的影响。
材料与方法 雄性SD大鼠72只(浙江大学医学院实验动物中心提供)，体重(117±10)g，随机分成3组：致敏组(S组)：各组24只大鼠。以生理盐水1 ml、鸡卵白蛋白(OVA，美国Sigma公司)1.0 mg、氢氧化铝凝胶Al (OH)3 100 mg对大鼠进行皮下、腹腔注射致敏，2周后以1% OVA气雾激发15 min；地塞米松预处理组(DXM组)：在抗原激发前24 h、1 h各予DXM 40 mg/kg腹腔注射；正常对照组(NC组)以生理盐水替代OVA。抗原激发后6 h大鼠腹腔注射安定7.5 mg/kg后以30～40 min 的间隔吸入超声雾化的0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L 氯化乙酰胆碱(Mch，美国Sigma公司)，记录其呼吸频率变化，以使呼吸频率增加30%时所需Mch的浓度负对数(-Log PC30，mmol/m3)作为评价气道反应性高低的指标。 在抗原激发后0、6、12、24 h 各组分别处死6只大鼠，取血、BALF计数EOS；取肺做切片，苏木精-伊红染色后利用计算机图像分析软件(浙江大学医学院神经生物学实验室研制，ZUNL-SIMAG 1.0)测定切片中细支气管单位管壁面积中浸润的EOS数量。
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统计学处理：实验数据以SPSS 6.0软件进行单因素方差分析，t检验或秩和检验。
结果 各组在抗原激发0时刻比较差异无显著性，NC组不同时刻比较差异无显著性。S组BALF中EOS随时间增加有显著增高(F=34.14，P<0.001)。抗原激发后6 h即见增高(P<0.001)，24 h明显增高；外周血EOS在抗原激发后6 h显著下降(P<0.05)，此后回升，至24 h恢复正常；细支气管管壁浸润的EOS随时间变化有显著增高(H=11.31，P=0.01)见表1。显微镜下可见S组支气管及周围小血管的管壁有大量EOS浸润。抗原激发后6 h S组的-Log PC30显著高于NC组(t=2.63，P=0.02，表2)。DXM预处理可完全阻断抗原诱导的气道高反应性，使外周血、BALF及肺组织EOS数量下降，但未完全阻断EOS浸润。
讨论 已知致敏可使大鼠外周血中EOS的程序死亡时间延长，而本组研究中致敏大鼠在抗原激发后6 h外周血中EOS急剧下降，可能是转移到其它组织中去了。至于12 h后的增高，可能是骨髓中EOS释放到外周血中。
, 百拇医药
正常大鼠的气道、BALF中几乎没有EOS，而致敏大鼠在抗原激发后6 h气道有大量EOS浸润。这一变化很难用气道中少量EOS祖细胞在如此短时间内分化而来解释，联系到此时外周血EOS的下降，可认为肺组织中EOS是由外周血迁移而来。同样BALF中EOS也只能是由气道迁移而来。影响其迁移的重要因素是支气管腔中高浓度的eotaxin和白细胞介素5(IL-5)。Ohkawara等[1]报道，在抗原激发后24 h BALF中IL-5的高峰，与本组实验一致，可见IL-5在维持BALF中EOS的活性及延长其生存时间中起着重要作用。
表1 抗原激发后不同时刻不同组织中EOS的变化(X±s)
时刻
(h)
组别
鼠数
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(只)
BALF
EOS(108个/L)
外周血
EOS(108个/L)
细支气管管壁周围
EOS(个/1 000 μm2)
0
S组
5
0.10±0.09
2.46±1.14
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0.85± 0.77
DXM组
5
0.07±0.09
0.86±0.77
0.68± 0.57
NC组
5
0.04±0.03
1.52±0.74
0.57± 0.42
6
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S组
5
4.86±1.68**
0.65±0.21*
26.83± 5.37*
DXM组
5
0.17±0.22
0.29±0.17
2.75± 0.29*
NC组
, http://www.100md.com
5
0.09±0.11
1.38±0.77
0.53± 0.50
12
S组
6
4.97±1.84*
1.83±1.26
26.83± 5.37*
DXM组
5
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0.17±0.15
0.42±0.30
2.75± 0.29*
NC组
5
0.09±0.10
1.45±0.66
0.53± 0.50
24
S组
6
10.12±1.61*▲
, 百拇医药
2.19±0.86#
34.09±20.69*
DXM组
5
2.28±0.79*
0.85±0.51
3.34± 0.218*
NC组
5
0.04±0.04
1.39±0.67
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0.59± 0.52
注：同一组别不同时刻亚组间单因素方差检验：与0时刻比较* P<0.05，** P<0.001；与6 h组比较# P<0.05，与12 h比较 ▲ P<0.05表2 大鼠呼吸频率增加30%所需的Mch浓度
负对数(mmol/m3，X±s)
组别
鼠数
-Log PC30
S组
6
7.80±1.24*#
, http://www.100md.com
NC组
7
6.14±0.86
DXM组
9
6.30±0.88
注：与NC组比较* P<0.05；与DXM组比较# P<0.05
在抗原激发后6 h致敏大鼠气道反应性明显增高，与国外文献报道的哮喘患者气道中EOS的升高与气道反应性的增高相关一致，可能与EOS对气道上皮细胞有直接的破坏作用有关。
由以上结果可推测，致敏大鼠在抗原激发后6 h，外周血中EOS迁移到气道，并穿过上皮层向管腔内迁移，24 h后管腔内EOS达到高峰。据国外文献报道，OVA致敏或寄生虫感染后均出现骨髓中EOS增高[2]，而抗原激发后即刻有骨髓EOS的下降及外周血EOS的上升，由此可推论，致敏大鼠在抗原激发后首先有骨髓中EOS向外周血的迁移。
, 百拇医药
DXM的应用可有效地抑制此迁移过程及气道高反应性，与临床上DXM的疗效一致。其主要原因可能是DXM可有效地抑制细胞因子IL-5的产生，导致EOS的凋亡加速。但DXM的大剂量应用可致外周血中白细胞、EOS大幅度降低，提示以DXM治疗哮喘需以合适的给药方式和剂量。
志谢 浙江大学医学院附属第二医院呼吸内科刘富光教授、浙江大学医学院药理教研室魏尔清教授
作者单位：汪慧英(310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院呼吸内科)
沈华浩(310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院呼吸内科)
参考文献
[1]Ohkawara Y, Lei XF, Stampfli MR, et al. Cytokine and eosinophil responses in the lung, peripheral blood, and bone marrow compartments in a murine model of allergen-induced airways inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:510-520.
[2]Nittoh T, Arii M, Suzuki R, et al. Increase of eosinophilic cell population in bone marrow of rats by immunization with Ascaris suum antigen. Immunol Invest, 1997,26:439-451., 百拇医药