内毒素、烧伤病人血清诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的体外实验研究
内毒素、烧伤病人血清诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的体外实验研究
石富胜 徐根贤 王利平 杨正国 张晨阳 罗向东 杨宗城
摘 要 目的 观察内毒素(LPS)、烧伤血清对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡及坏死的影响。 方法 将培养于盖玻片中的细胞随机分为正常对照组、LPS致伤组和烧伤血清致伤组，各组在相应的培养液中于 37℃， 5%的 CO2孵育箱中培养24 h。用Annexin-v-FLUOS探针标记凋亡细胞膜的磷脂酰丝氨酸(PS)，用碘化丙啶(propidium iodide， PI)作DNA染色,用流式细胞仪和荧光显微镜测定和观察HUVEC凋亡和坏死的变化。 结果 正常对照组HUVEC凋亡和坏死分别为(2.3±2.8)%和(1.3±0.6)%; LPS及烧伤刺激后凋亡分别达到(35.2±3.2)% 和(21.3±5.1)% ，坏死分别达到(8.7±0.3)%和(4.2±0.4)%，凋亡增加幅度大于坏死(P<0.05)，LPS组及烧伤组的凋亡和坏死程度与正常对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。 结论 血管内皮细胞凋亡在烧伤早期病理改变中具有一定的意义。
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关键词：内毒素血症；烧伤；内皮，血管；坏死；凋亡
研究表明，血管内皮细胞损伤在烧伤后脏器损害的发生、发展中具有极重要的作用,而且是导致缺血再灌注损伤、最终引起全身多脏器功能损害的重要原因。笔者研究发现, 烧伤早期(最早约15 min)即可见血浆内毒素(LPS)浓度的升高。内毒素可损伤血管内皮细胞，进而导致微血管通透性增高。一般认为，血管通透性增高是由于内皮细胞内钙离子浓度增高后导致内皮细胞收缩所引起的，近年来的研究表明，内皮细胞凋亡亦是血管通透性增高的原因之一。为此，笔者利用体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型，分别用LPS、烧伤血清作为致伤因素，观察LPS、烧伤血清对HUVEC凋亡及坏死损伤的影响。
材料与方法
一、主要试剂及检测仪器
人脐静脉内皮细胞株ECV-304；M199细胞培养液、LPS(O55：B5)、细胞培养瓶、96孔培养板购自美国Sigma公司；胰蛋白酶为Difco 1∶250；烧伤病人烧伤面积90%,Ⅲ度 85%；烧伤后24 h收集血清；Annexin-Ⅴ-FLUOS(CAT.NO.1858777， Boehringer Mannheim， 德国)；流式细胞仪(Facpla Star，美国)；荧光显微镜(DMIRB显微镜， LAICA公司， 德国)。
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二、细胞株的培养和分组处理
1. 内皮细胞培养：本实验中采用ECV-304人脐静脉内皮细胞株，细胞常规复苏后将细胞接种于75 ml培养瓶中传代，培养液M199含体积分数为10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素、2 ml谷氨酰胺，每48 h更换培养液一次，培养24～48 h用于实验，实验开始前将细胞接种于细胞培养板(盖玻片)，在无血清培养液中培养24 h。37℃、5%CO2孵育箱中孵育。
2. 实验细胞分组。将培养于盖玻片中的细胞随机分为正常对照组(N)、LPS致伤组(LPS)和烧伤血清致伤组(BS)，每组样本数=6。N组细胞培养于无血清M199培养液；LPS组在加入LPS(终浓度为2.0 μg/ml)的无血清培养液中培养；BS组在加入烧伤血清(使其体积分数为30%)的无血清培养液中培养。各组在37℃、5%CO2的条件下共同孵育24 h。
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三、实验步骤及方法
1. 荧光显微镜检测实验步骤及方法：见参考文献[1]。将各组盖玻片从孵育箱中取出去，弃去培养液，PBS冲洗，加入预先配制的染色液(配制方法：1 ml hepes buffer液+20 ul Annexin-Ⅴ-FLUOS+20 ul PI液)10 μl，室温孵育10～15 min，荧光显微镜下观察并照相。随机选取6个视野计数凋亡、坏死细胞数。
2. 流式细胞仪测定步骤及方法：见参考文献[2，3]。将LPS、烧伤血清刺激培养的细胞悬浮后用磷酸缓冲液(PBS)冲洗，200×g离心机离心5 min再悬浮细胞，加入100 μl Annexin-Ⅴ-FLUOS染色液，室温孵育10～15 min，进行流式细胞仪测定。记数5 000个细胞，可见标有A-V、PI或同时双标的细胞，因荧光强度不同，细胞迁徙区域不同，屏幕上细胞分布在不同的三个区域，分别是D区(存活细胞)、E区(凋亡细胞)、F区(坏死细胞)，通过各区细胞的比例及荧光强度，测定HUVEC凋亡和坏死的变化。测定参数：High volt：FS(81)，PMT1(354)，MT2(660)，T3(903)，T4(935)；Int gain：FS(5)，PMT1(5)，MT2(15)，T3(10)，T4(20)
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四、统计分析
结果用X±s 表示，采用华西医科大学医学统计程序包PEMS进行样本均数t检验。
结果
一、荧光显微镜下观察结果
正常细胞荧光镜下不被荧光标记；凋亡细胞被A-V染色，荧光镜下呈绿色(图1)；坏死细胞被PI染色或同时被A-V、PI染色，荧光镜下见坏死细胞核呈橘黄色，或细胞核橘黄色和细胞膜的绿色同时存在(图2)。正常对照组的细胞，荧光镜下看不到荧光标记，或可见有少数标有荧光的凋亡、坏死细胞，烧伤血清、LPS刺激后荧光镜下见荧光标记细胞明显增加，随机选取6个视野计数凋亡、坏死细胞数结果见表1。
二、流式细胞仪测定LPS、烧伤血清对培养HUVEC凋亡、坏死的影响
图1 LPS、BS刺激后，在荧光镜下凋亡细胞呈绿色 Annein-V标记×400
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图2 LPS、BS刺激后，坏死细胞在荧光镜下呈橘黄色，同时标有绿色和杼黄色的细胞是凋亡向坏死发展的细胞 Annexin-V和PI标记 ×400
正常对照组的血管内皮细胞凋亡和坏死较少，多数细胞分布在D区(活细胞)，E区(凋亡细胞)、F区(坏死细胞)很少。LPS及烧伤血清刺激后凋亡和坏死同时增加，即E区、F区细胞数明显增加，D区细胞数减少。凋亡增加幅度大于坏死。见表2。
表1 LPS、BS刺激后A-V、PI标记的
细胞数变化(个/视野，X±s)
组别
A-V
PI
正常对照组
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3.0±1.0
2.0±1.0
LPS致伤组
28.0±2.0*
18.0±1.0*
BS致伤组
35.0±2.0*
23.0±2.0*
与正常组对照比较：*P<0.01表2 LPS、BS刺激后HUVEC凋亡、坏死变化(X±s)
组别
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构成比(%)
存活细胞
凋亡细胞
坏死细胞
正常对照组
94.66±3.5
2.3±2.8
1.3±0.6
LPS致伤组
55.9±1.5*
35.2±3.2*
8.7±0.3*
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BS致伤组
79.0±2.6*
21.3±5.1*
4.2±0.4*
与正常组对照比较：*P<.0.01讨论
近年来越来越多的研究发现，细胞凋亡不仅在生理状态下对细胞的选择、分化及衰老细胞的清除起重要作用，而且参与多种疾病的发病过程[4]。因此，本实验中用LPS和烧伤血清刺激培养的HUVEC，应用流式细胞仪、荧光显微镜观察HUVEC凋亡及坏死的发生情况。结果发现，LPS和烧伤血清刺激24 h后培养HUVEC凋亡和坏死同时增加，尤其凋亡细胞增加显著；在创伤领域里能导致细胞凋亡的因素有：(1)细菌感染，(2)细胞因子，(3)氧化应激，(4)缺血再灌注。细菌感染所致的脓毒症(sepsis)或内毒素血症是致多脏器功能不全(multiple organ dysfunction syndrome MODS)的常见原因之一。内毒素是全身炎症反应综合征(SIRS)的重要启动子，有报道LPS可诱导多脏器功能不全和多细胞的凋亡[5-8]。内皮细胞凋亡机制目前研究报道不多，有研究者用钙离子载体A23187处理内皮细胞，发现内皮细胞凋亡坏死增加，而用牛磺酸阻止A23187介导的细胞内钙离子浓度增高的同时还阻止了内皮细胞的凋亡[9]，说明细胞内钙离子的增加可导致VEC的凋亡；有报道细胞的氧化应激反应释放的氧自由基、过氧化氢、及超氧基团等介导了VEC的凋亡[10，11]，而应用氧自由基清除剂则降低了VEC的凋亡[12]，提示VEC的凋亡与氧化应激反应有关。有关内皮细胞凋亡的机理有待进一步研究。
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一般认为血管通透性增高是由于内皮细胞内钙离子浓度增高后导致内皮细胞收缩所引起的，近年来的研究发现，内皮细胞凋亡亦是血管通透性增高的原因之一。内皮细胞的凋亡除可直接引起血管通透性增高外，还伴有其他功能的改变，如内皮细胞黏附功能增加等[8]。Abello等[13]用LPS刺激体外培养的猪主动脉内皮细胞，然后诱导热休克蛋白反应，结果导致了细胞的凋亡而不是坏死，Zhang等[5]用原位标记法亦观察到小鼠在注射LPS后存在内皮细胞凋亡的现象。在氧化应激反应存在及热休克时内皮细胞发生凋亡[11]。笔者在本实验的体外实验中发现(待发表)，LPS、TNF刺激后培养HUVEC凋亡细胞明显增加。本实验中烧伤病人血清刺激后，细胞凋亡和坏死增加明显，提示烧伤血清可通过多条途径对HUVEC造成损伤。这些证据表明血管内皮细胞凋亡在血管内皮细胞的通透性的改变中起着重要的作用，其机制有待进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金重点课题资助项目(39830400)
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作者单位：石富胜(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
徐根贤(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
王利平(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
杨正国(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
张晨阳(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
罗向东(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
杨宗城(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
参考文献
1 Vermes I, Gvchelaar HJ, Vermes A, et al. A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin-v.J Immunol Methods， 1995，184:39.
, 百拇医药
2，Koopman G, Reutelingsperger CPM, Kuijten GAM, et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.Blood，1994，84:1415.
3，Homburg CHE, Maggiore G, Veber F, et al. Human neutrophils lose their surface Fc gamma RIII and acquire Annexin V binding sites during apoptosis in vitro.Blood，1995，85:532.
4，官键，金大地. 创伤后多器官功能不全综合征与细胞凋亡.国外医学创伤外科基本问题分册，1998，19：4.
, 百拇医药
5，Zhang XM，Morikawa A，Takahashi K, et al.Localization of apoptosis (programmed cell death) in mice by administration of lipopolysaccharide.Microbiol Immunol，1994，38：669-671.
6，Wang SD，Huang KJ，Lin YS, et al. Sepsis-induced apoptosis of the thymocytes in mice.J Immunol，1994，152：5014-5021.
7，Bohlinger I，Leist M，Gantner F, et al.DNA fragmentation in mouse organs during endotoxic shock. Am J Pathol，1996，149：1381-1393.
, 百拇医药
8，吴荣谦，孟宪钧.内皮细胞与多器官功能失常综合征.中华实验外科杂志，1999，16：94-95.
9，Wang JH, Redmond HP, Watson RW, et al. The beneficial effect of taurine on the prevention of human endothelial cell death. Shock,1996,6:331-338.
10，Wang JH， Redmond HP，Watson RWG.Induction of heat shock protein-72 prevents neutrophil-mediated human endothelial cell necrosis.Arch Surg， 1995，130：1260-1265.
11，Vrani J，Dame MK. Injury to adult human dermal microvascular endothelial cells in vtro.Shock， 1995，3：179-183.
12，Wang JH，Redmond HP，Watson RWG，et al.Mechanisms involved in the induction of human endothelial cell necrosis.Cell Immunol， 1996，168：91-99.
13，Abello PA,Fidler SA,Bulkley GB,et al.Antioxidants modulate induction of programmed endothelial cell death(apoptosis)by endotoxin.Arch Surg,1994,129:134-141., 百拇医药
石富胜 徐根贤 王利平 杨正国 张晨阳 罗向东 杨宗城
摘 要 目的 观察内毒素(LPS)、烧伤血清对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡及坏死的影响。 方法 将培养于盖玻片中的细胞随机分为正常对照组、LPS致伤组和烧伤血清致伤组，各组在相应的培养液中于 37℃， 5%的 CO2孵育箱中培养24 h。用Annexin-v-FLUOS探针标记凋亡细胞膜的磷脂酰丝氨酸(PS)，用碘化丙啶(propidium iodide， PI)作DNA染色,用流式细胞仪和荧光显微镜测定和观察HUVEC凋亡和坏死的变化。 结果 正常对照组HUVEC凋亡和坏死分别为(2.3±2.8)%和(1.3±0.6)%; LPS及烧伤刺激后凋亡分别达到(35.2±3.2)% 和(21.3±5.1)% ，坏死分别达到(8.7±0.3)%和(4.2±0.4)%，凋亡增加幅度大于坏死(P<0.05)，LPS组及烧伤组的凋亡和坏死程度与正常对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。 结论 血管内皮细胞凋亡在烧伤早期病理改变中具有一定的意义。
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关键词：内毒素血症；烧伤；内皮，血管；坏死；凋亡
研究表明，血管内皮细胞损伤在烧伤后脏器损害的发生、发展中具有极重要的作用,而且是导致缺血再灌注损伤、最终引起全身多脏器功能损害的重要原因。笔者研究发现, 烧伤早期(最早约15 min)即可见血浆内毒素(LPS)浓度的升高。内毒素可损伤血管内皮细胞，进而导致微血管通透性增高。一般认为，血管通透性增高是由于内皮细胞内钙离子浓度增高后导致内皮细胞收缩所引起的，近年来的研究表明，内皮细胞凋亡亦是血管通透性增高的原因之一。为此，笔者利用体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型，分别用LPS、烧伤血清作为致伤因素，观察LPS、烧伤血清对HUVEC凋亡及坏死损伤的影响。
材料与方法
一、主要试剂及检测仪器
人脐静脉内皮细胞株ECV-304；M199细胞培养液、LPS(O55：B5)、细胞培养瓶、96孔培养板购自美国Sigma公司；胰蛋白酶为Difco 1∶250；烧伤病人烧伤面积90%,Ⅲ度 85%；烧伤后24 h收集血清；Annexin-Ⅴ-FLUOS(CAT.NO.1858777， Boehringer Mannheim， 德国)；流式细胞仪(Facpla Star，美国)；荧光显微镜(DMIRB显微镜， LAICA公司， 德国)。
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二、细胞株的培养和分组处理
1. 内皮细胞培养：本实验中采用ECV-304人脐静脉内皮细胞株，细胞常规复苏后将细胞接种于75 ml培养瓶中传代，培养液M199含体积分数为10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素、2 ml谷氨酰胺，每48 h更换培养液一次，培养24～48 h用于实验，实验开始前将细胞接种于细胞培养板(盖玻片)，在无血清培养液中培养24 h。37℃、5%CO2孵育箱中孵育。
2. 实验细胞分组。将培养于盖玻片中的细胞随机分为正常对照组(N)、LPS致伤组(LPS)和烧伤血清致伤组(BS)，每组样本数=6。N组细胞培养于无血清M199培养液；LPS组在加入LPS(终浓度为2.0 μg/ml)的无血清培养液中培养；BS组在加入烧伤血清(使其体积分数为30%)的无血清培养液中培养。各组在37℃、5%CO2的条件下共同孵育24 h。
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三、实验步骤及方法
1. 荧光显微镜检测实验步骤及方法：见参考文献[1]。将各组盖玻片从孵育箱中取出去，弃去培养液，PBS冲洗，加入预先配制的染色液(配制方法：1 ml hepes buffer液+20 ul Annexin-Ⅴ-FLUOS+20 ul PI液)10 μl，室温孵育10～15 min，荧光显微镜下观察并照相。随机选取6个视野计数凋亡、坏死细胞数。
2. 流式细胞仪测定步骤及方法：见参考文献[2，3]。将LPS、烧伤血清刺激培养的细胞悬浮后用磷酸缓冲液(PBS)冲洗，200×g离心机离心5 min再悬浮细胞，加入100 μl Annexin-Ⅴ-FLUOS染色液，室温孵育10～15 min，进行流式细胞仪测定。记数5 000个细胞，可见标有A-V、PI或同时双标的细胞，因荧光强度不同，细胞迁徙区域不同，屏幕上细胞分布在不同的三个区域，分别是D区(存活细胞)、E区(凋亡细胞)、F区(坏死细胞)，通过各区细胞的比例及荧光强度，测定HUVEC凋亡和坏死的变化。测定参数：High volt：FS(81)，PMT1(354)，MT2(660)，T3(903)，T4(935)；Int gain：FS(5)，PMT1(5)，MT2(15)，T3(10)，T4(20)
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四、统计分析
结果用X±s 表示，采用华西医科大学医学统计程序包PEMS进行样本均数t检验。
结果
一、荧光显微镜下观察结果
正常细胞荧光镜下不被荧光标记；凋亡细胞被A-V染色，荧光镜下呈绿色(图1)；坏死细胞被PI染色或同时被A-V、PI染色，荧光镜下见坏死细胞核呈橘黄色，或细胞核橘黄色和细胞膜的绿色同时存在(图2)。正常对照组的细胞，荧光镜下看不到荧光标记，或可见有少数标有荧光的凋亡、坏死细胞，烧伤血清、LPS刺激后荧光镜下见荧光标记细胞明显增加，随机选取6个视野计数凋亡、坏死细胞数结果见表1。
二、流式细胞仪测定LPS、烧伤血清对培养HUVEC凋亡、坏死的影响
图1 LPS、BS刺激后，在荧光镜下凋亡细胞呈绿色 Annein-V标记×400
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图2 LPS、BS刺激后，坏死细胞在荧光镜下呈橘黄色，同时标有绿色和杼黄色的细胞是凋亡向坏死发展的细胞 Annexin-V和PI标记 ×400
正常对照组的血管内皮细胞凋亡和坏死较少，多数细胞分布在D区(活细胞)，E区(凋亡细胞)、F区(坏死细胞)很少。LPS及烧伤血清刺激后凋亡和坏死同时增加，即E区、F区细胞数明显增加，D区细胞数减少。凋亡增加幅度大于坏死。见表2。
表1 LPS、BS刺激后A-V、PI标记的
细胞数变化(个/视野，X±s)
组别
A-V
PI
正常对照组
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3.0±1.0
2.0±1.0
LPS致伤组
28.0±2.0*
18.0±1.0*
BS致伤组
35.0±2.0*
23.0±2.0*
与正常组对照比较：*P<0.01表2 LPS、BS刺激后HUVEC凋亡、坏死变化(X±s)
组别
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构成比(%)
存活细胞
凋亡细胞
坏死细胞
正常对照组
94.66±3.5
2.3±2.8
1.3±0.6
LPS致伤组
55.9±1.5*
35.2±3.2*
8.7±0.3*
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BS致伤组
79.0±2.6*
21.3±5.1*
4.2±0.4*
与正常组对照比较：*P<.0.01讨论
近年来越来越多的研究发现，细胞凋亡不仅在生理状态下对细胞的选择、分化及衰老细胞的清除起重要作用，而且参与多种疾病的发病过程[4]。因此，本实验中用LPS和烧伤血清刺激培养的HUVEC，应用流式细胞仪、荧光显微镜观察HUVEC凋亡及坏死的发生情况。结果发现，LPS和烧伤血清刺激24 h后培养HUVEC凋亡和坏死同时增加，尤其凋亡细胞增加显著；在创伤领域里能导致细胞凋亡的因素有：(1)细菌感染，(2)细胞因子，(3)氧化应激，(4)缺血再灌注。细菌感染所致的脓毒症(sepsis)或内毒素血症是致多脏器功能不全(multiple organ dysfunction syndrome MODS)的常见原因之一。内毒素是全身炎症反应综合征(SIRS)的重要启动子，有报道LPS可诱导多脏器功能不全和多细胞的凋亡[5-8]。内皮细胞凋亡机制目前研究报道不多，有研究者用钙离子载体A23187处理内皮细胞，发现内皮细胞凋亡坏死增加，而用牛磺酸阻止A23187介导的细胞内钙离子浓度增高的同时还阻止了内皮细胞的凋亡[9]，说明细胞内钙离子的增加可导致VEC的凋亡；有报道细胞的氧化应激反应释放的氧自由基、过氧化氢、及超氧基团等介导了VEC的凋亡[10，11]，而应用氧自由基清除剂则降低了VEC的凋亡[12]，提示VEC的凋亡与氧化应激反应有关。有关内皮细胞凋亡的机理有待进一步研究。
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一般认为血管通透性增高是由于内皮细胞内钙离子浓度增高后导致内皮细胞收缩所引起的，近年来的研究发现，内皮细胞凋亡亦是血管通透性增高的原因之一。内皮细胞的凋亡除可直接引起血管通透性增高外，还伴有其他功能的改变，如内皮细胞黏附功能增加等[8]。Abello等[13]用LPS刺激体外培养的猪主动脉内皮细胞，然后诱导热休克蛋白反应，结果导致了细胞的凋亡而不是坏死，Zhang等[5]用原位标记法亦观察到小鼠在注射LPS后存在内皮细胞凋亡的现象。在氧化应激反应存在及热休克时内皮细胞发生凋亡[11]。笔者在本实验的体外实验中发现(待发表)，LPS、TNF刺激后培养HUVEC凋亡细胞明显增加。本实验中烧伤病人血清刺激后，细胞凋亡和坏死增加明显，提示烧伤血清可通过多条途径对HUVEC造成损伤。这些证据表明血管内皮细胞凋亡在血管内皮细胞的通透性的改变中起着重要的作用，其机制有待进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金重点课题资助项目(39830400)
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作者单位：石富胜(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
徐根贤(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
王利平(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
杨正国(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
张晨阳(037006 大同，解放军322医院烧伤科)
罗向东(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
杨宗城(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
参考文献
1 Vermes I, Gvchelaar HJ, Vermes A, et al. A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin-v.J Immunol Methods， 1995，184:39.
, 百拇医药
2，Koopman G, Reutelingsperger CPM, Kuijten GAM, et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.Blood，1994，84:1415.
3，Homburg CHE, Maggiore G, Veber F, et al. Human neutrophils lose their surface Fc gamma RIII and acquire Annexin V binding sites during apoptosis in vitro.Blood，1995，85:532.
4，官键，金大地. 创伤后多器官功能不全综合征与细胞凋亡.国外医学创伤外科基本问题分册，1998，19：4.
, 百拇医药
5，Zhang XM，Morikawa A，Takahashi K, et al.Localization of apoptosis (programmed cell death) in mice by administration of lipopolysaccharide.Microbiol Immunol，1994，38：669-671.
6，Wang SD，Huang KJ，Lin YS, et al. Sepsis-induced apoptosis of the thymocytes in mice.J Immunol，1994，152：5014-5021.
7，Bohlinger I，Leist M，Gantner F, et al.DNA fragmentation in mouse organs during endotoxic shock. Am J Pathol，1996，149：1381-1393.
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8，吴荣谦，孟宪钧.内皮细胞与多器官功能失常综合征.中华实验外科杂志，1999，16：94-95.
9，Wang JH, Redmond HP, Watson RW, et al. The beneficial effect of taurine on the prevention of human endothelial cell death. Shock,1996,6:331-338.
10，Wang JH， Redmond HP，Watson RWG.Induction of heat shock protein-72 prevents neutrophil-mediated human endothelial cell necrosis.Arch Surg， 1995，130：1260-1265.
11，Vrani J，Dame MK. Injury to adult human dermal microvascular endothelial cells in vtro.Shock， 1995，3：179-183.
12，Wang JH，Redmond HP，Watson RWG，et al.Mechanisms involved in the induction of human endothelial cell necrosis.Cell Immunol， 1996，168：91-99.
13，Abello PA,Fidler SA,Bulkley GB,et al.Antioxidants modulate induction of programmed endothelial cell death(apoptosis)by endotoxin.Arch Surg,1994,129:134-141., 百拇医药