碱性成纤维生长因子对大鼠视神经损伤的保护作用
碱性成纤维生长因子对大鼠视神经损伤的保护作用
胡爱莲 孙葆忱 董冬生 刘守彬 李校坤
摘 要 目的 探讨碱性成纤维生长因子(bFGF)对视神经损伤的保护作用。方法 用精确校准方法在成年鼠造成部分视神经损伤模型，球后注射生理盐水、VB12、bFGF。伤后1h和4wk测量闪光视神经诱发电位(F-VEP)。结果 伤后1h，F-VEP潜伏期延长且电位幅值降低，与正常比较有明显差异。伤后4wk时生理盐水和VB12组对刺激没有应答，bFGF组F-VEP接近正常。结论 bFGF对视神经损伤后视神经节细胞和轴索退变有明显的保护作用。
关键词：碱性成纤维生长因子；视神经损伤；神经保护；视觉诱发电位
, 百拇医药
视神经损伤是眼科重要的致盲因素之一，在眼科临床中尚未找到有效的治疗方法，为此寻找促进神经修复与再生的有效手段成为现代神经生物领域的热点。最近研究认为碱性成纤维生长因子(bFGF)能维持中枢神经细胞存活和促进损伤修复。本研究通过观察视神经部分损伤后bFGF对视觉诱发电位变化的影响，旨在阐明bFGF对视神经损伤保护作用的潜在生物效应。
1 材料和方法
1.1 实验动物 雌性Sprague-Dawley大鼠48只，重量200～250g，随机分为6组:空白对照组、生理盐水组、维生素B12组(天津市氨基酸公司人民制药厂500mg.L-1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)800U、1 600U、2 400U组(暨南大学生物工程研究所提供)，每组8只动物。每只动物左眼为正常对照眼，右眼为实验眼。
1.2 视神经损伤动物模型的制作[1] 氯胺酮麻醉满意后，将大鼠俯卧位固定于手术台上，手术显微镜下环形剪开右眼球结膜，断内、上直肌，钝性向后分离暴露视神经，用头部宽1mm的特制镊子在球后2～3mm处夹持视神经6s造成视神经夹伤，观察眼底无视网膜中央动脉缺血者为成功模型，否则剔除。
, 百拇医药
1.3 术后处理 实验眼除空白对照组不用药治疗外，其余各组，均在视神经损伤后，当时及隔日球后分别注射该组药物，连续5次。
1.4 闪光视觉诱发电位(F-VEP)检查 先在损伤后1h随机选用8只动物，分别记录左、右眼F-VEP，以监测视神经急性损伤时视神经功能状况。分组治疗4wk后再分别记录双眼F-VEP，以观察各药疗效。电生理检查参照ISCEV标准，使用美国Nicolet多功能电生理诊断仪，氯胺酮麻醉动物后，Mydrin-p(日本参天制药)散瞳。采用银针电极，阻抗<2kΩ,暗适应后在暗室内，用Ganzfeld全视野闪光刺激器，先后分别刺激左、右眼，刺激光强3.93cd.m-2，刺激频率1.9Hz，通频带宽1～100Hz，分析时间250ms，叠加100次，连续测量至少3次。
1.5 观察指标 我们的实验条件记录到的F-VEP的波形是比较稳定的NPN波形(图1)，分别命名为N1、P1、N2，P1为一大的正波。初始波N1，正波P1和N2波的潜伏期以毫秒(ms)为单位，N1-P1和P1-N2波幅的大小以微伏(μV)为单位。测量方法：峰潜时的测量方法由起始至N1的顶峰为N1的峰潜时，由起始至P1的谷底为P1的峰潜时，依此类推；振幅值测量的方法为N1-P1的振幅由N1的顶峰至P1的谷底为N1-P1的振幅值，依此类推，各指标值为3次测量的平均值。
, 百拇医药
Figure 1 F-VEP of rat.大鼠F-VEP
1.6 统计方法 用SPSS软件包进行统计，各指标组内比较行配对t检验，组间比较用2眼各指标之差值行方差分析，组间有差异者再进行两两比较。
2 结果
2.1 F-VEP波形 正常大鼠F-VEP潜伏期短，电位幅值陡直；视神经急性损伤F-VEP波形变的低而宽，伤后4wk空白对照组、生理盐水组和Vit B12组对刺激无应答，均诱导不出波形，bFGF各组F-VEP波形幅值较正常平缓(图1)。
2.2 视神经急性损伤F-VEP 视神经急性损伤后潜伏期N1、P1、N2明显延长，波峰N1-P1、P1-N2降低，与正常相比有显著性差异(P<0.01)，检测结果见表1。
, 百拇医药
表1 急性损伤与正常F-VEP比较
Table 1 F-VEP of injury and control eyes
Group
N1(ms)
N1-P1(μV)
P1(ms)
N2(ms)
P1-N2(μV)
Injury
, 百拇医药
38.83±8.08
13.45±3.24
66.50±45.82
106.58±17.30
15.66±4.16
Control
71.83±16.93
8.70±1.45
110.33±28.90
158.67±42.01
9.83±2.79
, 百拇医药
P
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
2.3 bFGF治疗4wk F-VEP 不同剂量bFGF治疗组右眼较左眼N1潜伏期延长，N1-P1幅值降低，但均无显著性差异；P1和N2潜伏期延长，P1-N2幅值降低，均有显著性差异，P1 bFGF 800U组P<0.01，1 600U组P<0.05，2 400U组P<0.05；N23组均P<0.05；P1-N2 bFGF 800U组P<0.05，1 600U组P<0.01，2 400U组P<0.05，见表2。
, 百拇医药
表2 3种剂量bFGF组左、右眼F-VEP比较
Table 2 F-VEP of left and right eye in bFGF group
Group
N1(ms)
N1-P1(μV)
P1(ms)
N2(ms)
P1-N2(μV)
800U bFGF
, http://www.100md.com
Left
39.33±5.72
17.85±5.33
61.00±8.25
132.17±12.73
19.36±2.54
Right
45.00±5.76
16.06±6.22
77.00±9.34△
154.33±19.33*
, 百拇医药
16.54±1.61*
1 600U bFGF
Left
35.50±5.05
19.05±4.37
55.00±5.37
101.33±20.88
20.34±2.82
Right
41.33±7.87
14.38±5.09
, http://www.100md.com
61.92±5.08*
129.33±30.64*
16.29±2.26△
2 400U bFGF
Left
34.33±4.50
16.54±3.53
48.50±4.14
93.67±12.08
20.82±3.02
Right
, 百拇医药
37.83±4.67
13.22±3.20
53.67±4.84*
104.67±6.86*
17.10±3.51*
Note：*P<0.05， △P<0.01
bFGF 3组与急性损伤组实验眼之间比较,各指标以自身左右眼差值(用Δ表示)为统计量，ΔN1、ΔN2和ΔP1组间有显著性差异，两两比较ΔN1 和ΔP1 bFGF 3组均与急性损伤组有显著性差异P<0.05，bFGF 3组之间无显著性差异；ΔN2 bFGF 800U和2 400U组与急性损伤组有显著性差异P<0.05，1 600U组与急性损伤组无显著性差异，bFGF 3组之间也无显著性差异；ΔN1-P1和ΔP1-N2组间无显著性差异，见表3。
, http://www.100md.com
表3 3组bFGF与急性损伤组组间比较
Table 3 F-VEP of bFGF and injury groups
Range(Δ)
Acute injury
800U bFGF
1 600U bFGF
2 400U bFGF
ΔN1(ms)
33.00±13.39
5.67±5.57*
, 百拇医药
5.83±5.08*
3.50±2.66*
ΔN1-P1(μV)
4.75±3.06
1.80±1.47
4.67±2.71
3.32±2.72
ΔP1(ms)
43.83±29.22
16.00±12.38*
, 百拇医药
6.92±6.07*
5.17±3.31*
ΔN2(ms)
52.08±38.80
22.17±19.16*
28.00±21.06
11.00±8.25*
ΔP1-N2(μV)
5.83±3.20
2.82±3.38
, 百拇医药
4.05±1.87
3.72±3.12
* P<0.05
3 讨论
视神经损伤严重影响患者视力，临床治疗颇为棘手。由于难以获得人类损伤后的视神经和眼球，为进一步了解哺乳动物受损视神经和视网膜对损伤反应的特征，并观察一些药物对视神经损伤和视网膜节细胞退变的治疗效应，常用大鼠为研究对象。目前视神经损伤模型有视神经完全损伤和视神经不完全损伤2类，完全损伤方法是直接切断视神经，非完全性损伤方法有视神经间接冲击伤、视神经管挤压伤、视神经夹挫伤或挤压伤、视神经牵拉伤。临床上常见不完全视神经损伤，本文的视神经夹挫伤模型是国外最常用的和被公认为较精确的视神经不完全损伤模型[1]，它较相似地模拟了临床损伤过程。
VEP是研究正常和疾病过程中功能状态的一种较成熟而有效的无创性方法，本实验显示VEP可很敏感地反应视神经损伤的程度，并可预测恢复可能性的大小，这与Akabane[2]的结果相一致，即重要波形的波幅下降超过50%视神经功能则受到了严重的损伤，可能造成不可逆的损伤。此外，由于不同的实验室之间，刺激和记录方法的不同，VEP波峰的极性、潜伏期、波幅有很大的差异，目前尚没有一个统一的标准值，为使个体间差异的影响达到最小，本文以自身健眼作为对照。
, 百拇医药
生理盐水组、维生素B12组、空白对照组VEP波形消失，提示视神经功能高度受损，表明视神经在夹挫伤后又发生了继发性损伤[3，4]，生理盐水和维生素B12对视神经原发损伤和继发性损伤均无治疗作用。3种剂量bFGF治疗组均可诱导出稳定的波形， N1大致正常；N1-P1幅值比正常低而比急性损伤时高，但均无显著性差异。P1、N2与正常和急性损伤时相比均有显著性差异(除N2 bFGF 1 600U组例外)，说明经bFGF治疗P1、N2有所缩短，但尚不正常；N2 bFGF 1 600U组、P1-N2与急性损伤比无显著性差异。总之，bFGF使损伤眼VEP比急性损伤时潜伏期明显缩短，波幅增高，证实bFGF对视神经损伤有明显的保护作用。3种剂量bFGF之间N1、 P1、 N2、N1-P1、P1-N2均无显著性差异，说明bFGF 800U已有足够的生物活性，且不再随剂量增加而增大。由此可见， bFGF作为一类新的神经营养因子[5]，将为临床治疗提供可喜的前景。
, 百拇医药
基金项目：北京市卫生局重点学科资助
作者简介：胡爱莲，女，1964年11月出生，山西人，汉族，主治医师。1986年毕业于山西医科大学医学系，获医学学士学位。毕业后在山西省眼科医院从事眼科临床工作。1994年至1997年在山西医科大学攻读研究生，获得硕士学位。1997年至今在首都医科大学攻读博士学位，师从同仁医院眼科研究所著名眼科专家孙葆忱教授，进行视神经损伤的保护研究。
作者单位：胡爱莲(世界卫生组织防盲合作中心，北京市眼科研究所 100730)
孙葆忱(世界卫生组织防盲合作中心，北京市眼科研究所 100730)
董冬生(北京同仁医院眼科)
刘守彬(北京同仁医院眼科)
李校坤(广州暨南大学生物工程研究所)
, http://www.100md.com
参考文献
1，Yoles E,Muller S,Schwartz M.NMDA-Receptor antagonist protects neurons from secondary degeneration after partial optic crush[J].J Neurotrauma 1999;14∶665-675.
2，Akabane A,Saito K,Suzuki Y,et al.Monitoring visual evoked potentials during retraction of the canine optic nerve:protective effect of unroofing the optic canal[J].J Neurosurg 1995;82(2)∶284-287.
3，Povlishock JT,Christman CW.The pathobiology of traumatically induced axonal injury in animals and humans:a review of current thoughts[J].J Neurotrauma 1995;12∶555-564.
4，Yoles E,Muller S,Schwartz M.HU211,a nonpsychotropic cannabinoid,produces shore- and long-term neuroprotection after optic nerve axotomy[J].J Neurotrauma 1996；13∶49-57.
5，胡爱莲，孙葆忱.碱性成纤维生长因子在视网膜及视神经方面的研究[J].国外医学眼科学分册 1998;22(6)∶348-354., 百拇医药
胡爱莲 孙葆忱 董冬生 刘守彬 李校坤
摘 要 目的 探讨碱性成纤维生长因子(bFGF)对视神经损伤的保护作用。方法 用精确校准方法在成年鼠造成部分视神经损伤模型，球后注射生理盐水、VB12、bFGF。伤后1h和4wk测量闪光视神经诱发电位(F-VEP)。结果 伤后1h，F-VEP潜伏期延长且电位幅值降低，与正常比较有明显差异。伤后4wk时生理盐水和VB12组对刺激没有应答，bFGF组F-VEP接近正常。结论 bFGF对视神经损伤后视神经节细胞和轴索退变有明显的保护作用。
关键词：碱性成纤维生长因子；视神经损伤；神经保护；视觉诱发电位
, 百拇医药
视神经损伤是眼科重要的致盲因素之一，在眼科临床中尚未找到有效的治疗方法，为此寻找促进神经修复与再生的有效手段成为现代神经生物领域的热点。最近研究认为碱性成纤维生长因子(bFGF)能维持中枢神经细胞存活和促进损伤修复。本研究通过观察视神经部分损伤后bFGF对视觉诱发电位变化的影响，旨在阐明bFGF对视神经损伤保护作用的潜在生物效应。
1 材料和方法
1.1 实验动物 雌性Sprague-Dawley大鼠48只，重量200～250g，随机分为6组:空白对照组、生理盐水组、维生素B12组(天津市氨基酸公司人民制药厂500mg.L-1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)800U、1 600U、2 400U组(暨南大学生物工程研究所提供)，每组8只动物。每只动物左眼为正常对照眼，右眼为实验眼。
1.2 视神经损伤动物模型的制作[1] 氯胺酮麻醉满意后，将大鼠俯卧位固定于手术台上，手术显微镜下环形剪开右眼球结膜，断内、上直肌，钝性向后分离暴露视神经，用头部宽1mm的特制镊子在球后2～3mm处夹持视神经6s造成视神经夹伤，观察眼底无视网膜中央动脉缺血者为成功模型，否则剔除。
, 百拇医药
1.3 术后处理 实验眼除空白对照组不用药治疗外，其余各组，均在视神经损伤后，当时及隔日球后分别注射该组药物，连续5次。
1.4 闪光视觉诱发电位(F-VEP)检查 先在损伤后1h随机选用8只动物，分别记录左、右眼F-VEP，以监测视神经急性损伤时视神经功能状况。分组治疗4wk后再分别记录双眼F-VEP，以观察各药疗效。电生理检查参照ISCEV标准，使用美国Nicolet多功能电生理诊断仪，氯胺酮麻醉动物后，Mydrin-p(日本参天制药)散瞳。采用银针电极，阻抗<2kΩ,暗适应后在暗室内，用Ganzfeld全视野闪光刺激器，先后分别刺激左、右眼，刺激光强3.93cd.m-2，刺激频率1.9Hz，通频带宽1～100Hz，分析时间250ms，叠加100次，连续测量至少3次。
1.5 观察指标 我们的实验条件记录到的F-VEP的波形是比较稳定的NPN波形(图1)，分别命名为N1、P1、N2，P1为一大的正波。初始波N1，正波P1和N2波的潜伏期以毫秒(ms)为单位，N1-P1和P1-N2波幅的大小以微伏(μV)为单位。测量方法：峰潜时的测量方法由起始至N1的顶峰为N1的峰潜时，由起始至P1的谷底为P1的峰潜时，依此类推；振幅值测量的方法为N1-P1的振幅由N1的顶峰至P1的谷底为N1-P1的振幅值，依此类推，各指标值为3次测量的平均值。
, 百拇医药
Figure 1 F-VEP of rat.大鼠F-VEP
1.6 统计方法 用SPSS软件包进行统计，各指标组内比较行配对t检验，组间比较用2眼各指标之差值行方差分析，组间有差异者再进行两两比较。
2 结果
2.1 F-VEP波形 正常大鼠F-VEP潜伏期短，电位幅值陡直；视神经急性损伤F-VEP波形变的低而宽，伤后4wk空白对照组、生理盐水组和Vit B12组对刺激无应答，均诱导不出波形，bFGF各组F-VEP波形幅值较正常平缓(图1)。
2.2 视神经急性损伤F-VEP 视神经急性损伤后潜伏期N1、P1、N2明显延长，波峰N1-P1、P1-N2降低，与正常相比有显著性差异(P<0.01)，检测结果见表1。
, 百拇医药
表1 急性损伤与正常F-VEP比较
Table 1 F-VEP of injury and control eyes
Group
N1(ms)
N1-P1(μV)
P1(ms)
N2(ms)
P1-N2(μV)
Injury
, 百拇医药
38.83±8.08
13.45±3.24
66.50±45.82
106.58±17.30
15.66±4.16
Control
71.83±16.93
8.70±1.45
110.33±28.90
158.67±42.01
9.83±2.79
, 百拇医药
P
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
2.3 bFGF治疗4wk F-VEP 不同剂量bFGF治疗组右眼较左眼N1潜伏期延长，N1-P1幅值降低，但均无显著性差异；P1和N2潜伏期延长，P1-N2幅值降低，均有显著性差异，P1 bFGF 800U组P<0.01，1 600U组P<0.05，2 400U组P<0.05；N23组均P<0.05；P1-N2 bFGF 800U组P<0.05，1 600U组P<0.01，2 400U组P<0.05，见表2。
, 百拇医药
表2 3种剂量bFGF组左、右眼F-VEP比较
Table 2 F-VEP of left and right eye in bFGF group
Group
N1(ms)
N1-P1(μV)
P1(ms)
N2(ms)
P1-N2(μV)
800U bFGF
, http://www.100md.com
Left
39.33±5.72
17.85±5.33
61.00±8.25
132.17±12.73
19.36±2.54
Right
45.00±5.76
16.06±6.22
77.00±9.34△
154.33±19.33*
, 百拇医药
16.54±1.61*
1 600U bFGF
Left
35.50±5.05
19.05±4.37
55.00±5.37
101.33±20.88
20.34±2.82
Right
41.33±7.87
14.38±5.09
, http://www.100md.com
61.92±5.08*
129.33±30.64*
16.29±2.26△
2 400U bFGF
Left
34.33±4.50
16.54±3.53
48.50±4.14
93.67±12.08
20.82±3.02
Right
, 百拇医药
37.83±4.67
13.22±3.20
53.67±4.84*
104.67±6.86*
17.10±3.51*
Note：*P<0.05， △P<0.01
bFGF 3组与急性损伤组实验眼之间比较,各指标以自身左右眼差值(用Δ表示)为统计量，ΔN1、ΔN2和ΔP1组间有显著性差异，两两比较ΔN1 和ΔP1 bFGF 3组均与急性损伤组有显著性差异P<0.05，bFGF 3组之间无显著性差异；ΔN2 bFGF 800U和2 400U组与急性损伤组有显著性差异P<0.05，1 600U组与急性损伤组无显著性差异，bFGF 3组之间也无显著性差异；ΔN1-P1和ΔP1-N2组间无显著性差异，见表3。
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表3 3组bFGF与急性损伤组组间比较
Table 3 F-VEP of bFGF and injury groups
Range(Δ)
Acute injury
800U bFGF
1 600U bFGF
2 400U bFGF
ΔN1(ms)
33.00±13.39
5.67±5.57*
, 百拇医药
5.83±5.08*
3.50±2.66*
ΔN1-P1(μV)
4.75±3.06
1.80±1.47
4.67±2.71
3.32±2.72
ΔP1(ms)
43.83±29.22
16.00±12.38*
, 百拇医药
6.92±6.07*
5.17±3.31*
ΔN2(ms)
52.08±38.80
22.17±19.16*
28.00±21.06
11.00±8.25*
ΔP1-N2(μV)
5.83±3.20
2.82±3.38
, 百拇医药
4.05±1.87
3.72±3.12
* P<0.05
3 讨论
视神经损伤严重影响患者视力，临床治疗颇为棘手。由于难以获得人类损伤后的视神经和眼球，为进一步了解哺乳动物受损视神经和视网膜对损伤反应的特征，并观察一些药物对视神经损伤和视网膜节细胞退变的治疗效应，常用大鼠为研究对象。目前视神经损伤模型有视神经完全损伤和视神经不完全损伤2类，完全损伤方法是直接切断视神经，非完全性损伤方法有视神经间接冲击伤、视神经管挤压伤、视神经夹挫伤或挤压伤、视神经牵拉伤。临床上常见不完全视神经损伤，本文的视神经夹挫伤模型是国外最常用的和被公认为较精确的视神经不完全损伤模型[1]，它较相似地模拟了临床损伤过程。
VEP是研究正常和疾病过程中功能状态的一种较成熟而有效的无创性方法，本实验显示VEP可很敏感地反应视神经损伤的程度，并可预测恢复可能性的大小，这与Akabane[2]的结果相一致，即重要波形的波幅下降超过50%视神经功能则受到了严重的损伤，可能造成不可逆的损伤。此外，由于不同的实验室之间，刺激和记录方法的不同，VEP波峰的极性、潜伏期、波幅有很大的差异，目前尚没有一个统一的标准值，为使个体间差异的影响达到最小，本文以自身健眼作为对照。
, 百拇医药
生理盐水组、维生素B12组、空白对照组VEP波形消失，提示视神经功能高度受损，表明视神经在夹挫伤后又发生了继发性损伤[3，4]，生理盐水和维生素B12对视神经原发损伤和继发性损伤均无治疗作用。3种剂量bFGF治疗组均可诱导出稳定的波形， N1大致正常；N1-P1幅值比正常低而比急性损伤时高，但均无显著性差异。P1、N2与正常和急性损伤时相比均有显著性差异(除N2 bFGF 1 600U组例外)，说明经bFGF治疗P1、N2有所缩短，但尚不正常；N2 bFGF 1 600U组、P1-N2与急性损伤比无显著性差异。总之，bFGF使损伤眼VEP比急性损伤时潜伏期明显缩短，波幅增高，证实bFGF对视神经损伤有明显的保护作用。3种剂量bFGF之间N1、 P1、 N2、N1-P1、P1-N2均无显著性差异，说明bFGF 800U已有足够的生物活性，且不再随剂量增加而增大。由此可见， bFGF作为一类新的神经营养因子[5]，将为临床治疗提供可喜的前景。
, 百拇医药
基金项目：北京市卫生局重点学科资助
作者简介：胡爱莲，女，1964年11月出生，山西人，汉族，主治医师。1986年毕业于山西医科大学医学系，获医学学士学位。毕业后在山西省眼科医院从事眼科临床工作。1994年至1997年在山西医科大学攻读研究生，获得硕士学位。1997年至今在首都医科大学攻读博士学位，师从同仁医院眼科研究所著名眼科专家孙葆忱教授，进行视神经损伤的保护研究。
作者单位：胡爱莲(世界卫生组织防盲合作中心，北京市眼科研究所 100730)
孙葆忱(世界卫生组织防盲合作中心，北京市眼科研究所 100730)
董冬生(北京同仁医院眼科)
刘守彬(北京同仁医院眼科)
李校坤(广州暨南大学生物工程研究所)
, http://www.100md.com
参考文献
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